甘蓝型油菜油酸含量的主基因+多基因遗传分析

应用植物数量性状主基因 多基因的多世代联合分析方法,对甘蓝型油菜杂交组合8087 × 8108的P1、P2、F1、B1、B2和F2 等6个世代种子油酸含量进行分析,结果表明:(1)该组合油酸含量受2对加性-显性-上位性主基因 加性-显性-上位性多基因控制遗传;(2)该杂交组合的B1、B2和F2群体油酸含量主基因遗传力为43.83 %～94.71%,多基因遗传力为0.65 %～30.85 %,表明该组合油酸含量是由两对主基因 多基因共同控制的,并以主基因遗传为主;(3)油酸含量以加性效应和上位性效应为主,显性效应比较小.     

甘蓝型油菜光合基因的表达及其与含油量的关系

以双低油菜高含油品系855和低含油品系868为材料,对9个光合基因(Bna0391450、Bna0449040、Bna0104450、Bna0501620、Bna0197350、Bna0305890、Bna0087590、Bna0084310、Bna0280620)在叶片、花蕾和种子中的表达及其与油分积累的相关性进行研究。结果表明:除Bna0280620基因在高油品系855中、Bna0084310基因在低油品系868授粉后15 d的种子中基本不表达外,其他基因在叶片、花蕾和授粉后不同时期的种子中均有表达,且基因表达量均呈先上升后下降的趋势;高油品系855中的基因表达量峰值出现在授粉后20 d;低油品系868中的基因表达量峰值出现在授粉后25 d;2个品系中,光合基因表达差异集中在苗期叶片和授粉后20 d的种子中,油分积累差异主要集中在授粉后30～40 d种子中。品系855中,除Bna0197350和Bna0280620外,油分积累与光合基因表达量均呈负相关,且相关性不显著;品系868中,除Bna0501620基因外,油分积累与光合基因表达量也呈负相关,相关性不显著。说明油菜光合基因在种子中有表达,但不影响种子中的油分积累量。     

EMS处理甘蓝型油菜（Brassica napus）获得高油酸材料

 【目的】对EMS诱变甘蓝型油菜后代主要脂肪酸含量进行检测,并对M2代中获得的高油酸材料在分子水平进行分析。【方法】利用0.5%、1.0%和1.5%共3个EMS浓度处理甘蓝型油菜(湘油15号),分析检测M1和M2代的主要脂肪酸含量;分别克隆高油酸突变体05-4和对照材料FAD2基因,对其进行核苷酸和氨基酸序列分析。【结果】浓度为1.5%时处理M2代发现了一株高油酸植株（油酸含量71%）;序列分析表明,高油酸材料FAD2A基因第614位碱基A突变成G导致天冬氨酸变成甘氨酸,FAD2B基因第59位碱基A突变成C导致天冬酰胺变成苏氨酸,在第722位碱基A突变成T导致酪氨酸变成苯丙氨酸。【结论】采用浓度1.5%的EMS处理甘蓝型油菜对油酸含量有一定的影响。高油酸材料FAD2A中第205位残基天冬氨酸变成甘氨酸和FAD2B中第241位残基酪氨酸变成苯丙氨酸都发生在油酸减饱和酶催化中心,从而影响了蛋白质的空间结构,导致油酸含量提高。     

栽培因子对油菜油酸含量的影响

采用二次正交旋转组合设计研究氮、磷、钾、硫、柠檬酸、油菜索内酯对油菜油酸含量的作用效果.单因素效应分析氮肥施用量与油酸含量呈直线负相关.磷肥、钾肥施用量与油酸含量都呈二次曲线负相关.在一定范围内,施用磷肥、钾肥有利于油菜油酸含量的提高,过量则降低油酸含量.硫肥施用量与油酸含量呈直线正相关.该试验条件下在低氮、中磷、中钾、高硫水平下可以获得较高的油酸含量:当纯氮、纯磷、纯钾、纯硫的含量分别为0、112.5、112.5、60 kg/hm2时获得最高油酸含量67.51%.油菜素内酯和柠檬酸的效果不显著,可能与施用时期和施用量有关.     

航天诱变高油酸甘蓝型油菜突变体分子标记的筛选

【目的】利用与候选基因FAD2紧密连锁的SSR标记对航天诱变的高油酸F2群体进行SSR标记分析,筛选与该高油酸性状紧密连锁的SSR标记及分析其突变位点。【方法】F2群体母本10L421为黄籽低油酸高亚麻酸自交系,父本10L422为航天诱变的高油酸低亚麻酸的突变株自交系后代。对4条染色体（A05、A01、C05及C01）上的候选基因FAD2上下游100 kb区域设计的148对SSR引物在两亲本、高低油酸混合池及F2群体中进行分析。亲本及群体油酸含量采用气相色谱分析,根据分子标记结果对F2群体油酸含量进行单标记分析。【结果】有36对引物在亲本间表现多态性,多态频率为24%。其中10对SSR引物在2个亲本和高油酸、低油酸极端群体间均具有相同的多态性。显著性检验和单标记分析表明,A05和A01上与FAD2共分离的SSR标记在0.01显著水平上与油酸性状相关,单标记分析分别解释表型变异31.1%和29.4%。【结论】A05和A01染色体上的FAD2是控制该突变体材料高油酸性状变异的主效位点,且该高油酸突变体是由于A05和A01上FAD2的双隐性突变所致。     

甘蓝型油菜种子发育过程中油脂合成基因的表达

以2个高油品系(扬36、扬3052)和一个低油品系(扬6002)发育过程中的甘蓝型油菜种子为材料,利用实时荧光定量PCR技术,比较9个参与脂肪酸合成的编码酶基因和3个相关转录因子在种子发育过程中的表达模式和表达水平差异,探讨不同含油量甘蓝型油菜油脂合成代谢的差异。结果表明:除ACCase、FAD3、LEC1外,不同高油品系之间多数基因的表达模式和表达量相近,说明这2个不同遗传来源的高油品系在油分形成过程中,其油脂合成的主要基因在表达上具有较好的一致性。但高油和低油品系之间多数基因的表达模式或表达水平则存在着明显差异,其中FatA、FAD3、L1L等基因的表达量与含油量密切相关,随种子的发育其在高油品系中表达量明显高于低油品系。     

甘蓝型油菜P5CSb和OAT基因在干旱胁迫下的表达分析

为了探明脯氨酸积累过程的分子机制,以耐旱性较强的甘蓝型油菜holiday为材料,应用酸性茚三酮染色法和RT-qPCR(实时荧光定量PCR,real-time quantitative PCR)技术分别检测在干旱胁迫0d(对照组)、1d、3d、5d、7d油菜根、茎、叶、花和青荚中脯氨酸含量以及控制其合成的关键基因P5CSb和OAT的表达量。结果表明,各器官中脯氨酸的含量和干旱胁迫时间成正比,不同器官中脯氨酸的含量存在明显的差异;P5CSb基因和OAT基因的表达量在不同器官中呈现表达特异性,P5CSb基因在青荚中随着干旱时间的增加无明显变化,在叶中逐渐上升,在其他器官中均表现为先升高后降低的趋势,OAT基因的表达量在茎中无明显变化,在叶和花中呈现先升高后降低趋势,在根和青荚中表现为上升趋势;三者对比结果显示,P5CSb基因和OAT基因共同控制脯氨酸的合成,且不同胁迫时间,2个基因所起的作用不同,其中P5CSb基因占主导地位。     

甘蓝型油菜叶绿素含量的主基因+多基因遗传分析

油菜是我国食用油的主要原料,为了明确甘蓝型油菜叶片叶绿素含量的遗传机制,指导以高产及品质性状为目标的高光效育种实践,应用植物数量性状主基因+多基因混合遗传分离分析方法,以甘蓝型油菜高叶绿素含量品系APL01、低叶绿素含量品系Holly及2个品系杂交后衍生的198个重组自交家系群体(AH群体目前已发展到F_2:13代)为材料,利用SPAD-502叶绿素仪于2019—2021连续3年测定9张叶片期叶片的叶绿素含量,进行3个年份环境的叶绿素含量的遗传分析。结果表明,在3个年份环境下,该群体中叶片的叶绿素含量存在广泛变异,叶绿素含量的变异系数分别为9.57%、8.45%、10.49%,频率分布图呈正态分布,符合主基因+多基因遗传特点。叶绿素含量最适模型为MX3-AI-AI,即3对加性-上位性主基因+多基因加性-上位性混合遗传模型,3个年份环境下主基因的遗传率为分别为63.22%、73.09%、73.33%,多基因遗传率分别为35.70%、26.32%、25.94%。主基因和多基因共同决定了油菜叶片叶绿素的含量,以主基因的遗传贡献占主要部分。     

甘蓝型油菜DGAT1重复基因的克隆与表达分析

二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT1)是十字花科植物种子三酰甘油积累主要的贡献者。甘蓝型油菜为异源四倍体,存在多个DGAT1重复基因,目前还缺乏对这些基因的系统研究。以甘蓝型油菜为试验材料,根据TAIR已公布的拟南芥DGAT1基因序列在BRAD数据库中进行BLAST比对,根据比对得到的2个白菜型油菜与2个甘蓝的DGAT1基因序列设计引物,利用RT-PCR技术获得4个甘蓝型油菜DGAT1包含完整编码区的基因片段,并对所得到片段进行测序和生物信息学分析。结果表明:克隆得到的基因片段分别为BnDGAT1-1,1 509bp;BnDGAT1-2,1 533bp;BnDGAT1-3,1 515bp;BnDGAT1-4,1 506bp。这4个基因具有极高的相似性,BnDGAT1-1与BnDGAT1-2、BnDGAT1-3与BnDGAT1-4的2个基因相似度均高达97%以上。跨膜结构分析表明BnDGAT1-1与BnDGAT1-2这1对基因所编码的蛋白质含有9个跨膜结构域,而BnDGAT1-3与BnDGAT1-4这对基因所编码的蛋白质含有8个跨膜结构域。包含有BnDGAT1-1与BnDGAT1-3的基因对BnDGAT1-a与包含有BnDGAT1-2与BnDGAT1-4的基因对BnDGAT1-b在含油量不同的各种甘蓝型油菜种子中表达无明显差异,表明这2对DGAT1基因的表达差异并不是影响所选材料种子含油量的决定因素。     

不同栽培方式对高油酸油菜的影响

通过高油酸油菜780的不同田间栽培对比试验,采用完全随机试验法对油菜的生物学性状、经济学性状以及品质性状进行研究。试验结果显示,最优的栽培方式为复合DP1W机除和有机DP1W机除,即施复合肥80 kg/667m~2,或施有机肥720 kg/667m~2,直播,1万株/667m~2,机械除草方式。以这两种方式栽培油菜,经济性状好,单株产量高,折合产量分别可达130.17和128.83 kg/667m~2。     

甘蓝型油菜高油酸材料的正反交遗传研究

用4个高油酸品系和4个常规(低含量型)油酸品系为亲本材料,通过正反交试验,用FOSS近红外分析仪测定油酸含量,初步分析了甘蓝型油菜中突变产生的高油酸特性的遗传规律.结果表明,常规亲本与高油酸亲本油酸含量稳定;高油酸含量在正交组合F1代种子中表现,且其高油酸含量介于常规亲本油酸含量与高油酸亲本油酸含量均值之间;甘蓝型油菜的高油酸特性由显性多基因控制,并具有累加作用,不受母性遗传的影响.     

基因枪法向甘蓝型油菜转移反义FAD2基因的研究

为了获得高油酸油菜品种,以湘油15号子叶柄为受体材料,用基因枪法,将反义油酸脱饱和酶FAD2基因连在种子特异表达载体上后导入油菜,使用可裂膜压力7700kPa,样品室真空度9.5×104Pa,质粒质量浓度为1.0μg/μL,靶距9cm,通过对子叶柄的预处理48h,高渗处理1h,获得8株再生植株.经PCR与PCR-Southern杂交检测,其中有2株为转化株,证明反义FAD2基因已整合到湘油15号基因组中.     

甘蓝型油菜生物节律钟输出基因BnGI的克隆和表达分析

利用同源克隆的方法,以拟南芥GIGANTEA基因为种子序列,在甘蓝型油菜中克隆得到GI基因,命名为BnGI。序列分析结果表明:该基因编码区全长为3 516bp,编码1 171个氨基酸,与白菜GI基因序列同源性达99%,与拟南芥GI基因同源性达87%。成熟蛋白的等电点为6.59,分子量为127.15kDa,亚细胞定位预测在细胞核定位。荧光半定量检测结果表明:BnGI基因在根、茎、顶端分生组织、叶、花等中均有表达,但表达水平具有组织特异性。     

转基因高油酸甘蓝型油菜新种质的获得

在获得转fad2基因ihpRNA的甘蓝型油菜的基础上,应用气相色谱技术分析了转基因株系W-4(T_1代)单株自交种子(T_2代)的脂肪酸组成.结果显示:由49个单株组成的T:代群体油酸(C_(18:1))含量变幅为55.87%84.73%,其中有19个(占38.8%)单株种子油酸含量大于75%,有11个(占22.4%)单株种子油酸含量大于80%;受体(对照)的油酸含量变幅为55.28%～67.43%;获得的转基因高油酸材料(油酸含量≥75%)种子中亚油酸(C_(18:2))和亚麻酸(C(18:3))含量明显低于受体;高油酸材料的油酸脱饱和指数ODP值为5%~12%,而受体的ODP值高达20%～36%.基于ODP值,可以推测转基因高油酸材料种子中的FAD2活性受到有效抑制,从而阻止了油酸向亚油酸、亚麻酸的合成.     

甘蓝型油菜BnaSOT12a基因的抗性作用研究

磺酸转移酶(SOT,EC2.8.2.–)催化的磺酸化反应在植物的生长发育和植物抗逆过程中起着重要的作用。甘蓝型油菜BnaSOT12a基因是与拟南芥中AtSOT12基因同源的一个磺酸转移酶基因。为探寻BnaSOT12a基因的抗性相关功能,对其在油菜中不同部位的表达和在拟南芥中过表达情况下对转基因植株的影响进行了分析。结果显示:BnaSOT12a基因在甘蓝型油菜的根、叶、花芽和花中都有表达,其在花中的表达量最高,而在茎与果荚中没有表达;甘蓝型油菜BnaSOT12a基因在拟南芥中的过表达,能提高转基因植株在发芽和根生长方面对NaCl胁迫的耐受能力,但在盐胁迫下,BnaSOT12a的磺酸化作用并不影响拟南芥中抗病途径的信号传导,与抗病途径无关。     

甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体构建

[目的]为研究质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转化叶绿体奠定基础。[方法]根据GeneBank上的甘蓝型油菜的叶绿体DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增获得与甘蓝型油菜叶绿体基因组可发生同源重组的DNA片段,构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体,并在大肠杆菌中通过平板定性分析和Western印迹对所构建载体上的表达盒进行功能鉴定。[结果]以甘蓝型油菜的叶片叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得4 357 bp的DNA片段,包含2个开放阅读框RbcL和β-CT。成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体pHBM720,而且同一多顺反子的3个基因均在大肠杆菌中得到表达。[结论]该叶绿体多顺反子单交换表达载体具有较强的通用性与安全性,比双交换表达载体更具优越性。     

Cloning and Expression Level Analysis of Two BnaANT Candidate Genes in Brassica napus

AINTEGUMENTA （ANT） gene has been proved to have a novel function on controlling the organ size and the seed weight in Arabidopsis thaliana, the research on its orthologous gene in Brassica napus will be of potential interest to elucidate the molecular mechanism of rapeseed development and increase the rapeseed output. A SMART cDNA library of the flower bud from B. napus cultivar Zhongshuang 9 was constructed, and the full-length cDNAs of two homologous BnaANT candidate genes were cloned by PCR in B. napus, namely BnaX.ANT.a （GenBank accession no. DQ211969） and BnaX.ANT.b （accession no. DQ211970）. They shared 87.1 and 83.4% amino acid identity with ANT of A. thaliana, respectively. There is 87.4% amino acid identity between BnaX.ANT.a and BnaX.ANT.b. By quantitative real-time PCR, the obviously differential expression levels of the two BnaANT candidate genes were detected in the 28 DAF seeds of the big and small grains B. napus lines, the expression abundance of BnaANT in the 28 DAF seed of 9311 was over three times compared to that of 9260, which indicates that these two BnaANT genes are also likely related to the floral organ size and the seed weight in B. napus.     

甘蓝型油菜反义 Fad2 基因 RNAi 载体无选择标记转化研究

利用甘蓝型油菜种子特异性贮存蛋白基因cruciferin启动子及NOS终止子构建了无选择标记基因且含有反义结构的油酸脱饱和酶基因(Fad2)的RNA i表达载体。通过农杆菌介导法,获得了无选择标记转基因植株;再生植株的PCR检测表明,外源基因已高频率地整合到油菜基因组中,而且获得的转基因种子通过脂肪酸含量分析表明,油酸含量比对照有了很大的提高。