聚乙二醇(PEG)在水稻普矮病毒(RDV)抗血清制备上的应用

在进行水稻普矮病毒(RDV)的抗血清制备上,在缺乏超速离心机设备条件下,采用了聚乙二醇(Polyethlene Glycol 即 PEG-MW6000)结合用低速离心机达到抗原的部份纯化。试验结果说明在抗原制备上,PEG 的浓度达6%(重量/容积),NaCl0.3M,磷酸缓冲液0.03M,pH6.8,是最适条件。抗原—抗体反应用小管沉淀反应技术及琼脂扩散技术,均获得良好效果,反映制备出的 RDV 抗血清具有相当高的效价。例如:免疫化过程上,以抗原注射家兔一次的,抗血清效价,在多数的试验中为1/640;经注射三次或四次的,效价高的达1/2560,有一只兔经注射一次,另一只注射六次,其抗血清效价高达1/5120。     

烟草丛顶病毒ORF1蛋白的多克隆抗体制备及应用

PCR扩增烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)的ORF1序列并克隆到原核表达载体pEHISTEV中,转化大肠杆菌Rosetta菌株经IPTG诱导表达TBTV ORF1蛋白。利用切胶纯化的ORF1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备并获得抗血清,间接ELISA检测效价为1:24 3000。经抗原亲和纯化从抗血清中得到特异性和灵敏度俱佳的ORF1多克隆抗体。Western blot分析显示,TBTV ORF1多克隆抗体既可以检测田间发病的烟草丛顶病样品中ORF1蛋白,也可检测在体内和体外翻译体系中的TBTV ORF1蛋白的表达。另外发现ORF2蛋白以ORF1延长蛋白的形式存在,根据ORF1和ORF2的重叠情况及潜在的七核苷酸滑动序列和下游的稳定二级结构,推测此ORF1延长蛋白是移码翻译产物。     

玉米黄花叶病毒运动蛋白的原核表达纯化与抗血清制备

为实现对玉米黄花叶病毒（maize yellow mosaic virus,MaYMV）的血清学检测,丰富该病毒的检测方法,将编码MaYMV运动蛋白（movement protein,MP）的基因连接到原核表达载体pDBHis-MBP上,将构建成功的原核表达质粒转化到大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达融合蛋白,将纯化后的融合蛋白对新西兰大白兔Oryctolagus cuniculus进行免疫并制备MaYMV MP多克隆抗血清,并采用Western blot对抗血清的效价、灵敏度和特异性进行检测。结果显示,利用成功构建的原核表达载体经诱导表达获得分子量大小约为62 kD的融合蛋白,纯化后对新西兰大白兔进行免疫获得MaYMV MP抗血清,该抗血清的效价为1∶128 000,灵敏度为1∶32,且该抗血清能够特异性地检测到本氏烟Nicotiana benthamiana中瞬时表达的MaYMV MP,而不与马铃薯卷叶病毒属Polerovirus及黄症病毒属Luteovirus的其他病毒发生血清学交叉反应,证明该抗血清具有良好的特异性。表明本研究制备的MaYMV MP抗血清能特异性...     

玉米矮花叶病毒HC-Pro的纯化及抗血清制备

 本实验提纯了玉米矮花叶病毒(MDMV)的辅助成份-蛋白酶(HC-Pro),并制备了其抗血清。MDMV HC-Pro的分子量约为57kD,提纯产量为0.3mg/100 g病叶。琼脂免疫双扩散测定证明MDMV HC-Pro抗血清的效价为1:16;微量免疫沉淀法测定时其效价为1:1024。该抗血清只与MDMV HC-Pro有明显的反应,与健康玉米汁液和MDMV无反应。MDMV HC-Pro抗血清可以专化性地抑制HC-Pro的蚜传活性。     

湖北省稻细条病菌与其它地方稻细条病菌血清学关系比较

以稻细条菌Ｒ２９免疫大耳白兔获取的抗血清，同湖北的以及广西福建和湖南的共１１个菌株进行琼胶双扩散反应，结果是同其中９株菌产生清晰吻合的沉淀线，说明这９株为同一血清型，但同广西的ＲＩ和福建的Ｒ１７不产生沉淀线，说明这两株为不同血清型。     

苹果茎痘病毒外壳蛋白的原核表达及抗血清制备

利用基因重组技术将苹果茎痘病毒Applestempittingvirus(ASPV)完整cp基因在大肠杆菌中表达,以纯化蛋白为抗原免疫新西兰兔制备其抗血清,并采用ACP-ELISA法测定其效价和应用PAS-ELISA法对其抗血清的有效性进行初步鉴定。结果显示,cp基因获得了高效表达,表达产物与Anti-His抗体产生特异性免疫反应。制备的抗血清具有较强的特异性,效价为1:800。PAS-ELISA检测结果显示,9个苹果样品中有8个样品与RT-PCR检测结果一致,仅1个样品RT-PCR检测为阳性,而PAS-ELISA检测为阴性。表明所制备的抗血清具有一定的应用潜力。     

一种新的适用于ELISA的抗血清纸片保存法

用特异性抗血清制备的抗血清纸片应用于酶联免疫吸咐实验（ＥＬＩＳＡ），取得了良好的结果。目前已将抗血清纸片用于南芥菜花叶病毒（ＡｒＭＶ）、番茄环斑病毒（ＴｏｍＲＳＶ）、烟草环斑病毒（ＴＲＳＶ）、南方菜豆花叶病毒（ＳＢＭＶ）等进境植物危险性病毒的检测，取得与使用冻干保存抗血清相同的效果。应用抗血清纸片方便、经济、便于保存和邮寄。     

甘蔗花叶病毒VPg蛋白的原核表达及其在玉米中的免疫定位

 利用RT-PCR方法从感染甘蔗花叶病毒北京分离株(SCMV-BJ)的玉米叶片中扩增得到VPg基因,将VPg基因连接到原核表达载体pET-28a上。获得的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,VPg在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子量为30 kD。将融合蛋白纯化后免疫兔子获得了特异性较高的抗血清。ACP-ELISA测定抗血清的效价为1/4096。利用该抗血清对健康玉米和病毒侵染的玉米茎、叶脉和叶片进行免疫金标记,结果表明在茎和叶脉的韧皮部筛管的细胞壁处有金颗粒。     

樱桃病毒A北京分离物外壳蛋白的原核表达及抗血清制备

根据前期研究获得的樱桃病毒A北京分离物(Cherry virus Aisolate Beijing,CVA-BJ)外壳蛋白基因序列设计引物,将此基因克隆到原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21(DE3),以终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。Ni珠吸附法纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。间接ELISA测得抗血清效价为1∶2048。以纯化后的蛋白和樱桃叶片总蛋白为检测材料,Western blot分析表明抗血清具有高度特异性。间接ELISA方法检测樱桃病叶,结果呈阳性,与RT-PCR检测结果一致。表明制备的抗血清可用于感病樱桃样品中CVA的检测。     

马铃薯X病毒运动蛋白基因的原核表达、抗血清制备及应用

构建马铃薯X病毒运动蛋白(P25)原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达融合蛋白,所表达的P25蛋白经SDS-PAGE电泳纯化后免疫小鼠,抗血清效价为1∶4000,抗血清与PVX有特异性反应(P/N>2),且具有较强的反应特异性,而与PVY、TMV均不发生反应.该方法制备的抗血清可用于ELISA检测PVX感病植株及Western blot检测转基因植株.     

植物次生物质对棉铃虫谷胱甘肽S-转移酶和乙酰胆碱酯酶的影响

分别用含０．０１％的芸香甙,槲皮素２－十三烷酮的人工饲料连续饲养棉铃虫Ｈｅｌｉ－ｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａＨｕｂｎｅｒ１～７代,测定不同处理的棉铃虫种各谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）和乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ）的活性变化以及幼虫对杀虫剂的反应,以单独人工饲料养的各种作对照,芸香甙Ｆ１代对甲基硫磷的耐药性提高３倍,槲皮素Ｆ１,Ｆ２代和２－十三烷酮Ｆ１代对甲基对硫磷的耐药性有所提高,对灭多威和溴氰菊酯     

大螟与寄主植物关系的研究

大螟成虫产卵对寄主植物种类和生育期有明显选择性。寄主植物种类和理化性状影响幼虫的成活率,蛹体重量和性比,从而影响成虫产卵量,表明寄主植物对大螟种群数量有明显的影响。幼虫在田间的分布状况主要也是由于田边寄主植物更适合其生长发育之故。     

A蛋白-金颗粒复合物(pAg)诊断和检测植物病毒的研究

 以A蛋白-金颗粒复合物(Protein A-Gold complexes)标记植物病毒粒体。利用抗原抗体特异性反应和A蛋白与抗体中免疫球蛋白IgG结合的特性,在电镜下观察到同源关系中的金颗粒吸附于病毒粒体周围;而异源关系中,金颗粒则被冲洗掉或随机分布。该法专化性受抗血清稀释度和吸附时间等因素影响。对杆状、线状病毒粒体来说,抗血清最适稀释度为1×10²-10³倍,对球形病毒粒体来说,抗血清稀释度以1.2×10³倍为佳。抗血清吸附时间以3-10分钟的效果最好。     

玉米穗腐病和茎基腐病镰孢菌间相关性的RAPD分析

 利用随机扩增多态性DNA (RAPD)技术对玉米穗腐病和茎基腐病镰孢菌之间的相互关系进行了研究,证实了引起2种病害的串珠镰孢菌同源性很高,在遗传上具有较高的相似性,病菌不易受地域或环境和寄生部位选择作用的影响,同一类型的串珠镰孢菌可以是穗腐病和茎腐病的共同病原菌。禾谷镰孢菌间的遗传变异性很强,易受地域、环境和寄生部位选择作用的影响,出现明显的分化现象,穗腐病和茎基腐病可以由同一禾谷镰孢菌分化类型侵染所致,也可由不同分化类型侵染所致。     

植物系统性获得抗病性的产生机理和途径

坏死型病原物侵染或某些生化制剂诱导处理后,植株未受侵染或处理部位产生对随后病原物侵染的抗性,称为植物系统性获得抗性,ＳＡＲ具有抗性表现系统、持久、抗病对象广谱三大特点。坏死型病原物侵染或某些生化制剂处理后,植株受处理部位迅速产生系统性信号,经韧皮部传导到未侵染或处理部位,诱发ＳＡＲ基因表达。水杨酸是诱发ＳＡＲ的系统性信号之一。此外,上部非处理部位处于敏化状态,能更迅速有效地产生针对挑战接种病原物的     

玉米穗粒腐病的病原菌鉴定及致病性测试

在陕西省25个县调查玉米穗粒腐病,采集病穗标样570份。霉坏籽粒达到果穗面积1/3以上的发病严重果穗占35.61％。分离得到1308个菌株,鉴定为17个种,分属14个属,其中串珠镰刀菌出现频率最高,占42.58％,其次为禾谷镰刀菌,占20.34％。对串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌等10种主要病原菌进行致病性测试,平均病级1.14～2.41,病情指数22.9～48.4。串珠镰刀菌是玉米穗粒腐病的优势病原菌,禾谷镰刀菌为次优势菌种。     

棉花不同生育期棉盲蝽的为害损失及防治指标的研究

本项研究以绿盲蝽(Lygus Lucorum Mey Dur)及中黑盲蝽(Adelphocoris Suturalis Jak.)为对象。棉花从子叶、真叶、现蕾到结铃各个阶段都能遭受棉盲蝽的为害。由于盲蝽成、若虫以刺吸口器刺伤幼嫩器官和生长点,使部份器官受到直接损伤并影响到棉株正常生长,导致减产。两种盲蝽不同种群数量在真叶期和蕾铃期为害造成籽花产量的损失均呈抛物型曲线。绿盲蝽在真叶期和蕾期为害,其经济阈限按防治费用与产量损失金额相等时,分别为百株有虫4.7头和12.57头,中黑盲蝽在蕾期的经济阈限为百株10.77头。据此,提出在真叶期及蕾期的防治指标依次为百株5头及10～12头。     

侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及RT-PCR扩增外壳蛋白基因研究

 从杭州市郊区及本校附近菜园地表现严重花叶症状的花椰菜上分离到一种线状病毒,接种6科31种鉴别寄主,能侵染5科22种植物。病组织超薄切片可见风轮状内含体和片层聚集状内含体。感病的芥菜叶片,用0.5mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.5)匀浆后汁液加4% PEG-8000沉淀3h,5%~40%甘油梯度离心纯化病毒,可获得较高的产量。提纯的病毒均为一弯曲的线状颗粒,长度740nm左右。病毒提纯液于264nm处有一吸收峰,为典型的核蛋白紫外吸收。TuMV-H分离株抗血清包被的铜网能大量吸附病毒颗粒。用特异的PCR引物扩增其外壳蛋白基因,可得-0.9Kb的片段。     

水稻生理抗病的研究:稻株淀粉与稻瘟病发生的关系

稻株淀粉含量与稻瘟病的发生规律是明显的,有密切相关的。水稻一生,有二个时期稻株淀粉含量较少,一个是分蘖期,一个是抽穗期,而这二个时期又是最易感染稻瘟病的时期。因此,稻瘟病的发生与水稻生理有着内在的特殊关系,总的规律是稻株淀粉(在这二个时期)含量高,稻瘟病轻,反之则重。稻株淀粉含量与水稻品种的抗性有关,而且,对于气候、栽培等因素也有相互关系,而这些因素与稻瘟病的发生又有密切的关系,在几个因素中,品种的抗性是内因,而气候、栽培对于水稻属外因。然而,外因可以促使品种的抗性产生变化。因此,品种的抗性应该有两个含义,一是品种本身的(基因)抗病,另一种是外界因素给予的抗病能力,而了解稻株淀粉,掌握水稻的生理规律,对于预测预报和加强综合防治都是有实践意义的。     

玉米杂交种穗粒腐病原鉴定

对来自我国不同地区的玉米杂交种穗粒腐病原分离鉴定的结果表明,镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）和蠕孢菌（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）是引起杂交种穗粒腐的优势菌群,分离频率较高的病原菌还有本霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、曲霉菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）等。种子产地来源地原菌的分离频率有很大影响,辽宁和山西玉米杂交种穗粒腐病原菌的优势种群是蠕孢菌,而山东和河南则以镰刀