coxⅢ基因转录本的编辑与V型小麦育性恢复的关系

RNA编辑现象普遍存在于高等植物线粒体中,RNA编辑的不充分或偏离与植物细胞质雄性不育具有相关性.以V型小麦的细胞质雄性不育恢复基因的近等基因系为材料,研究了不育系、保持系、恢复系和杂种F1coxⅢ基因转录本编辑位点的差异,发现coxⅢ基因转录本共有14个编辑位点,其中有12个引起了氨基酸种类的变化.通过对不育系、保持系、恢复系和杂种F1线粒体RNA编辑频率的比较,表明在引入恢复基因后,不育胞质中coxⅢ基因转录本的编辑频率明显提高,说明coxⅢ基因转录本的RNA编辑与细胞质雄性不育具有一定相关性.     

球毛壳菌cox5基因克隆及特性分析

利用BlastX将球毛壳菌(Chaetomium globosum)ESTs序列与GenBank的Nr数据库进行相似性搜索,获得含有细胞色素c氧化酶亚基5基因(cox5)全长cDNA序列的EST(BP099084),以此设计引物。以球毛壳菌总RNA反转录产物为模板进行PCR扩增,获得球毛壳菌cox5的cDNA序列。cDNA全长685bp,编码169个氨基酸的多肽,蛋白质分子量18.3KD。蛋白质家族预测其属于cox4家族。球毛壳菌cox5是具有导肽的跨线粒体内膜的蛋白质。BlastP相似性分析表明cox5氨基酸序列保守性不高,与其相似性最高的是柄孢霉的cox5(Podospora anserina,CAB76570),相似性为75%。cox5基因的cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank上登录(登录号分别为DQ082750、AAY85812)。     

红麻细胞质雄性不育系UG93A和保持系UG93B cox1的克隆和表达分析

利用hiTAIL-PCR技术扩增红麻cox1全长及侧翼序列,结果表明,在红麻不育系UG93A和保持系UG93B中分别获得长度为2 149和3 244bp的序列,包含cox1基因CDS全长及其5′和3′部分侧翼序列,通过分析得出不育系和保持系中cox1的CDS序列长度为1 602bp,编码533个氨基酸残基,分子量为58.31ku。BLAST序列比对发现,UG93A和UG93Bcox1的CDS序列虽然存在4个碱基差异,但推导的氨基酸序列一样,并且UG93A和UG93Bcox1两端侧翼序列结果一致。RNA Blot分析显示cox1基因在红麻UG93A、UG93B和F1(UG93A/992)的转录本大小基本相同,推测cox1基因不是导致红麻CMS(cytoplasmic male sterility)的直接因子。qRT-PCR结果表明,UG93A中cox1的表达量显著低于UG93B和F1(UG93A/992),推测cox1在红麻花粉发育能量代谢过程中有着重要的作用。     

紫稻型细胞质雄性不育水稻樱香不育系的细胞学研究

使用 I2-KI染色法、硝酸银染色法和石蜡切片法对紫稻型细胞质雄性不育水稻（Oryza sativa L.）樱香不育系樱香 A及其保持系樱香 B进行细胞学研究,观察到紫稻细胞质樱香 A在减数分裂过程中存在异常分裂的现象,表现为不均等分裂;从减数分裂时期到单核小孢子时期,败育基本完成,仅观察到极少量的败育小孢子;败育完全、彻底,未发现正常成熟的花粉粒;败育花粉粒形态与典败型败育相似;从花粉母细胞时期到花粉粒成熟时,花药中始终存在绒毡层细胞。而在保持系减数分裂过程中未发现异常分裂;从花粉母细胞时期到四分体时期,花药中存在绒毡层细胞,而在花粉粒成熟时,未观察到绒毡层细胞。可见,樱香不育系败育主要发生减数分裂时期,在单核小孢子时期完成败育。推测樱香 A绒毡层细胞的异常可能是导致花粉败育的原因,绒毡层细胞可能影响了花粉粒的发育使其不能正常的花粉粒,从而导致败育。而且,樱香 A败育非常彻底,对于杂交稻遗传育种有着重要的意义。     

棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组文库的构建

【目的】构建棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,为研究棉花线粒体基因组结构以及棉花细胞质雄性不育的形成机理提供基础。【方法】在借鉴其它作物的线粒体基因组BAC文库构建方法的基础上,对棉花线粒体DNA的提取及其BAC文库的构建进行探索和优化,构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,并采用同源克隆的方法克隆棉花线粒体的功能基因。【结果】构建的不育系和保持系的线粒体基因组文库分别包括2 600个克隆,插入DNA片段大小在10.3 kb和37.5 kb之间,平均分别为22.29 kb和21.36 kb。重组子的覆盖率分别达到棉花线粒体基因组的79倍和76倍。获得了3个棉花线粒体功能基因序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系的这3个基因序列无差异;以这3个基因为探针筛选文库,均获得阳性克隆。【结论】分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。获得了晋A不育系与其保持系的orfB,coxⅠ和nad4L 3个基因的全序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系在orfB、coxⅠ和nad4L基因全序列上无差异。     

紫稻型细胞质雄性不育水稻樱香不育系的细胞学研究（英文）

使用I2-KI染色法、硝酸银染色法和石蜡切片法对紫稻型细胞质雄性不育水稻(Oryza sativa L.)樱香不育系樱香A及其保持系樱香B进行细胞学研究,观察到紫稻细胞质樱香A在减数分裂过程中存在异常分裂的现象,表现为不均等分裂;从减数分裂时期到单核小孢子时期,败育基本完成,仅观察到极少量的败育小孢子;败育完全、彻底,未发现正常成熟的花粉粒;败育花粉粒形态与典败型败育相似;从花粉母细胞时期到花粉粒成熟时,花药中始终存在绒毡层细胞。而在保持系减数分裂过程中未发现异常分裂;从花粉母细胞时期到四分体时期,花药中存在绒毡层细胞,而在花粉粒成熟时,未观察到绒毡层细胞。可见,樱香不育系败育主要发生减数分裂时期,在单核小孢子时期完成败育。推测樱香A绒毡层细胞的异常可能是导致花粉败育的原因,绒毡层细胞可能影响了花粉粒的发育使其不能正常的花粉粒,从而导致败育。而且,樱香A败育非常彻底,对于杂交稻遗传育种有着重要的意义。     

异常线粒体基因ORF25可能导致烟草雄性不育

克隆和测定烟草胞质雄性不育系MS革新3号及其保持系革新3号线粒体基因ORF25的序列.结果表明:保持系的ORF25基因序列能推导出完整的氨基酸序列,应该具有正常的生物学功能;而雄性不育系的ORb25基因序列与保持系有较大差异,共有11个位点发生了变化,特别是在89位点发生的碱基C→A的变化及336位点发生的碱基T→A的变化,使得雄性雄性不育系在这2个位点出现终止密码子(TAA和TCA),导致不育系的ORF25基因不能推导出完整的氨基酸序列,使该基因不能产生完整的蛋白质多肽.因此,烟草雄性不育系的ORF25基因不能发挥其在保持系中所发挥的作用,这是否与烟草的雄性不育性有关还有待于进一步深入研究.     

水稻线粒体基因atp6启动子突变导致的一种细胞质雄性不育型

内江杂交水稻科技开发中心从恢复系 "万恢88/内恢92-4" 杂交组合F2代不育株选育的细胞质不育系,被暂时定名为"万恢88型水稻细胞质雄性不育系".利用PAGE电泳、琼脂糖凝胶电泳和克隆测序等技术对其不育系和保持系线粒体基因组进行研究,分析其雄性不育的分子基础和分子机理.通过PAGE电泳发现,其不育系线粒体基因组PCR带型与野败型(WA)、印水型(ⅡA)、D型(Di)、冈型(GA)存在差异.对其不育系内香2A和保持系内香2B的差异片段回收测序,获得两条667 bp长度的mtDNA片段2A和2B,通过序列比对和电子杂交分析,获得片段为atp6基因的部分序列及其上游序列.2A和2B相比有3个碱基不同,分别是第57位G→T,第100位T→C,第161位C→T.功能分析第100 位T-C点突变使atp6基因启动子核心序列遭到破坏.通过对atp6基因上游序列的RT-PCR分析,发现不育系内香2A的atp6基因不能正常表达.故而推测万恢88型水稻细胞质雄性不育是由于不育系线粒体atp6基因核心启动子区域发生点突变,导致atp6基因不能正常转录,致使线粒体供能不足,最后导致花粉败育.     

水稻配子体雄性不育细胞质多态性及恢保关系差异研究

为解释育种实践中常出现的相同类型不育系与不同恢复系杂交组合F1代育性恢复有明显差异的现象,笔者通过对同核异质的5个配子体不育系W15A、W20A、W34A、W46A和YA线粒体DNA进行RAPD扩增聚类,不育基因orf(H)79基因及基因间区序列测序,测配F1分析其恢保关系,展示同型细胞质的差异与恢保差异的关系。结果表明,通过RAPD扩增聚类,这5个配子体细胞质雄性不育系在线粒体基因组可聚分为3类,而W34A与其他4个不育系的细胞质亲源关系较远。不育基因及基因间区序列均存在多个差异位点,5个水稻配子体雄性不育细胞质在大部分水稻材料的测恢中,恢保关系一致,而一部分材料的恢保关系差异较大。该研究为新型配子体不育系的选育、组合配制和同核多胞质混合杂交水稻亲本的选择提供一定的理论依据。     

利用线粒体DNA酶切电泳带型对水稻雄性不育细胞质源的分类

为了研究水稻细胞质雄性不育，我们建立了一套提取纯化水稻线粒体DNA的方法轻珍汕97不育系和保持系为材料，发现线粒体DNA的HindⅢ酶切电泳带型存在显著差异，而叶绿体DNA没有差异。细胞质类型为野败型的珍汕97A，V20A、常菲22A的线粒体DNA BamHI酶切电泳后的带型没有差异。属不同细胞质类型的珍汕97不育系和六千辛不育系的线粒体DNA EcoRI BamHI酶切电泳带型不同，它们分别代表了不同的水稻雄性不育细胞质遗传特征。此结果提示，利用线粒体DNA酶切电泳带型可以对水稻不育系的细胞质源进行分类。     

红麻线粒体基因NAD3和COB的RNA编辑与表达分析

以红麻细胞质线粒体近等基因系UG93A(不育系)、UG93B(保持系)及UG93A×福红992(恢复系)的F1代为材料,研究花药线粒体基因NAD3和COB的转录与表达。结果发现,在3种供试材料中,基因NAD3的CDS区在DNA水平和RNA编辑水平上均无差异;不育系与保持系的COB基因DNA编码序列无差异,但在RNA水平上发生了编辑,8个位点的编辑均发生于密码子的第一或第二位碱基,且导致氨基酸种类变化,主要为亲水性氨基酸转变为疏水性氨基酸;COB基因在UG93A中的RNA编辑频率低于UG93B;NAD3和COB基因在3种材料中的转录本大小基本相同,但在表达水平上表现为不育系显著低于保持系和F1代。由此推测NAD3和COB基因在红麻花药发育过程中有着重要的作用。     

二化螟线粒体cox1基因的克隆、序列测定和分子系统学分析

[目的]克隆并分析二化螟线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因（cox1）。[方法]利用PCR方法扩增了二化螟线粒体cox1基因,并测定了其全序列。通过检索GenBank数据库获得了其他21种鳞翅目昆虫的cox1序列,并进行了同源性比较和分子系统学分析。[结果]cox1基因编码框包含1531个核苷酸,编码510个氨基酸的蛋白;起始密码子为CGA,终止密码子仅由一个T组成。利用ML方法构建了基于cox1基因编码氨基酸序列的鳞翅目昆虫的分子系统树,发现分子系统树与从形态学角度的系统分类在大方面上是基本一致的,但也略有差异。[结论]为进一步研究cox1基因的表达和应用奠定了基础     

二化螟线粒体cox1基因的克隆、序列测定和分子系统学分析

[目的]克隆并分析二化螟线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因（cox1）。[方法]利用PCR方法扩增了二化螟线粒体cox1基因,并测定了其全序列。通过检索GenBank数据库获得了其他21种鳞翅目昆虫的cox1序列,并进行了同源性比较和分子系统学分析。[结果]cox1基因编码框包含1531个核苷酸,编码510个氨基酸的蛋白;起始密码子为CGA,终止密码子仅由一个T组成。利用ML方法构建了基于cox1基因编码氨基酸序列的鳞翅目昆虫的分子系统树,发现分子系统树与从形态学角度的系统分类在大方面上是基本一致的,但也略有差异。[结论]为进一步研究cox1基因的表达和应用奠定了基础。     

苎麻NAD7基因的克隆与分析

线粒体中泛醌氧化还原酶的7亚基基因(NAD7)是与植物呼吸代谢和植物细胞质雄性不育相关的重要基因之一。本研究利用NAD7的保守序列设计引物,用RT-PCR方法克隆了苎麻(Boehmeria nivea)NAD7的cDNA片段,其长度为969 bp,编码322个氨基酸。序列比对表明该cDNA序列及预测的蛋白序列与拟南芥、油菜有98%的同源性。聚类分析表明苎麻NAD7基因的进化处在很古老的地位。为深入研究苎麻雄性不育的分子生物学机理提供依据。     

辣椒不育系和保持系线粒体差异基因获得及SNP分析

通过对辣椒细胞质雄性不育(CMS)系及其相应保持系育性相关基因的分析,检寻SNP位点,旨在探索其与辣椒细胞质雄性不育性的关系。以高盐-蛋白酶K法提取线粒体DNA,采用AFLP技术分析了辣椒不育系和保持系的mtDNA的差异,从128对引物扩增产物中发现了不育系和保持系的差异片段,经回收、克隆获得不育系特异片段CanLE长度140 bp,保持系特异片段CanLB长度126 bp。利用Blast对其进行序列比对分析,其中CanLE与细胞色素P450家族蛋白同源,CanLB和赖氨酰-tRNA合成酶同源。进一步分别克隆并获得了不育系和保持系辣椒细胞色素P450全长,序列分析发现,两者存在单核苷酸多态性(SNP),其中5个碱基差异,3个为同义突变,2个氨基酸发生改变。     

红菜薹胞质雄性不育系线粒体DNA的RAPD分析

为研究和获得红菜薹线粒体DNA中与细胞质雄性不育相关的片段,对其不育系和保持系的线粒体DNA进行了RAPD分析.结果表明,在285条引物的扩增图谱中,不育系和保持系的线粒体DNA之间存在差异,在不育系中获得两条特异带AY1200和RD800;序列分析发现,AY1200与拟南芥的铁氧化还原蛋白依赖的谷氨酸盐合成酶的65个氨基酸有33%的相似性;RD800序列与贝氏柯克斯体QpH1质粒全基因组序列的132个氨基酸有47%的相似性.     

红麻RPT4全长cDNA的克隆及其在红麻花药中的表达

[目的]克隆红麻细胞质雄性不育系与保持系花药中差异表达蛋白RPT4相应基因的cDNA全长,分析该基因在花药中的表达.[方法]采用同源克隆法和RACE技术相结合,从保持系L23B花药总RNA中克隆RPT4全长cDNA.通过半定量RT-PCR检测花粉小孢子败育前,败育期间和败育晚期该基因在不育系和保持系间花药中的表达差异.[结果]克隆得到1 596 bp的cDNA全长,最长开放阅读框(ORF)1 197 bp,编码398个氨基酸的肽序列;该蛋白与蓖麻中直系同源蛋白的相似性最高,达91.93%,内含3个模体Walker A、Walker B和arginine finger的保守域,暗示其具有复杂多样的重要功能.RPT4的mRNA在红麻不育系和保持系花药中均有表达,但在四分体前(败育前),不育系和保持系中的表达量一致;在小孢子单核期(败育期),不育系花药中的表达量比保持系中的低;而小孢子双核期(败育晚期)的表达变化则相反.[结论]RPT4参与红麻小孢子的发育过程,可能具有与红麻细胞质雄性不育相关的复杂分子功能.     

洋葱atp6基因的克隆与系统进化分析

细胞质雄性不育(CMS)在作物遗传育种研究中占有重要地位,多种植物的细胞质雄性不育均与线粒体基因结构变异及新嵌合基因的产生有关。为探索线粒体atp6基因与洋葱CMS的关系,以13份不育系和11份保持系为材料克隆洋葱atp6基因编码序列,测序结果表明不同材料atp6基因间存在一个C/A多态性位点,该多态性位点在不育系和保持系间随机出现,而不是不育系与保持系的特征差异。蛋白质分析表明这一多态性位点的变异并未改变atp6蛋白跨膜结构。进一步的蛋白比对分析揭示了atp6蛋白在物种间有一定的保守性,特别是第IV跨膜结构域的Arg在所有物种中是高度保守的,也是H+转运所必需的。基于atp6蛋白序列的系统进化树显示细菌和病毒位于树的基部,其次是真菌、低等藻类以及原生生物,然后高等藻类、苔藓和蕨类,高等绿色开花植物处于树的顶端,单子叶植物处于树的最顶端。     

辣椒细胞质雄性不育系与其保持系线粒体DNA的RAPD分析

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B为试材,从苗龄10~15 d的黄化苗中分离纯化线粒体并提取线粒体DNA。线粒体负染后电镜观察发现,分离纯化的线粒体形态完整,呈椭球形,杂质较少。电泳检测提取的线粒体DNA的琼脂糖,结果表明,线粒体DNA纯度较高,无降解现象,浓度为20~50 ng/μl,可用作RAPD分析。经初步筛选,100个RAPD随机引物中有8个引物表现出多态性,经再次重复筛选,获得了辣椒细胞质雄性不育系21A线粒体DNA与雄性不育性相关的RAPD标记CMSAG3430。     

萝卜细胞质雄性不育的分子鉴定及orf138/orfB基因序列差异性分析

【目的】本研究旨在了解萝卜雄性不育细胞质的分子特征。【方法】以8份萝卜细胞质雄性不育系及其保持系、5份不育材料及6个萝卜品种为试材,利用线粒体基因orf138及orf B为分子标记,设计特异引物对材料进行扩增,并对扩增产物进行测序分析。【结果】8份萝卜细胞质雄性不育系、5份不育材料及5个萝卜品种检测到含有orf138特异片段,为Ogura胞质类型,不育系相应保持系则未检测到特异片段;对扩增产物测序发现所有Ogura胞质材料可分为2种类型,Type A和Type H;27份材料orf B特异扩增后,其产物按编码区核苷酸序列的差异可分为2个类型,Ogura胞质中序列一致,普通胞质中序列一致。【结论】由此可见,orf138与orf B基因在Ogura胞质与普遍胞质间均差异明显,可利用orf138的有无及orf B基因的核苷酸序列差异进行胞质类型鉴定。