应用单引物PCR获得以Bar基因为锚定基因的转基因水稻侧翼序列

 确定外源基因在水稻基因组上的插入位置,是转基因水稻研究的重要内容之一。为了建立一种简单、快速、准确的获取外源基因在水稻基因组上插入位置侧翼序列的方法,结合前人TAIL PCR引物设计的原则和经验,以转入水稻基因组中的Bar基因为锚定基因,设计了既能作为锚定引物又能作为随机引物使用的一系列单引物,应用这些单引物通过单引物PCR成功获得了外源基因在水稻基因组插入位点的侧翼序列。这种方法与目前较为常用的TAIL PCR相比,简化了70%左右的试验步骤,节省了60%以上的试验时间,是一种简便、快捷的获得未知侧翼序列的方法。     

24个水稻抗稻瘟病单基因系的抗性评价与利用前景分析

利用抗性基因培育抗病品种是防治稻瘟病最经济、快速、有效的手段。湖南桃江病圃是湖南省及长江中下游稻区水稻区域试验新品种的抗稻瘟病鉴定基地。为明确主要抗稻瘟病基因在该病圃的应用价值,本研究于2020—2021年评价了24个抗稻瘟病单基因品系在湖南桃江病圃的田间抗性。结果表明,含Pi-z⁵、Pi-1、Pi-7与Pi-ta²等单基因的品系对苗叶瘟均表现中抗水平,含Pi-1、Pi-z⁵、Pi-ta²、Pi-12(t)与Pi-k^m等单基因的品系对穗颈瘟表现抗或中抗。综合来看,Pi-1、Pi-z⁵、Pi-ta²等单基因对苗叶瘟与穗颈瘟皆表现出较好的田间抗性,可单独或与其它抗性基因聚合应用于抗稻瘟病育种与生产中。研究结果对指导湖南省乃至长江中下游稻区水稻抗稻瘟病品种选育与合理利用均具有重要意义。     

利用基因枪转化法获得受四环素调控的水稻雄性不育植株

利用基因枪法通过pTET-BI-Bar和pTATx-BN-Bin质粒分别将TetR和Barnase基因共转化粳稻品种台北309、4008S和籼稻品种D68。通过对R0代植株不同的基因进行PCR及Southern分析,结果表明,Barnase、TetR基因和控制Barnase基因的TA29-TX启动子均已整合到水稻基因组。其中,台北309和4008S分别获得了15株和6株阳性转基因植株,其外源基因转化率分别为4.5%和1.9%,其外源基因TetR和Barnase的共转化率分别为0.6%和0.3%。D68没有获得阳性转基因植株。     

BADH基因转化水稻的方法比较

应用基因枪法与农杆菌介导法将来源于山菠菜的BADH（betaine aldehyde dehydrogenase）基因导入水稻。从获得转基因植株数量、转化率、转化植株PCR阳性率、外源基因拷贝数及其表达活性、T0代植株的结实率对两种转化方法进行了比较。结果表明,用农杆菌介导法转化BADH基因的转化效率和PCR阳性率比基因枪法更高,且用农杆菌介导法得到的转基因植株T0的结实率等农艺性状也优于基因枪法。     

水稻OsENO2-2基因过表达对水稻抽穗期的影响

【目的】 OsENO2-2是OsENO2通过可变剪切产生的短转录本,其cDNA序列从粳稻中花11中分离获得。本研究的主要目的是初步分析OsENO2-2在水稻抽穗期调控中的作用。【方法】 构建了OsENO2-2的超量表达载体,获得转基因植株,通过对表型的观察和统计,分析目的基因在过量表达条件下的功能,并利用反向遗传学方法验证该基因的功能。【结果】 OsENO2-2过量表达导致水稻在长日照条件下的抽穗期推迟,而短日照条件下抽穗期无明显变化。通过qRT-PCR方法对水稻开花关键基因的检测发现,在长日照条件下,RFT1的表达量在超表达材料中显著下调,其他开花重要基因表达量在野生型和超表达材料中没有显著变化;而在短日照条件下,所有检测基因的表达量在野生型和超表达材料中均没有显著变化。【结论】 在长日照条件下,OsENO2-2主要通过调控RFT1基因的表达来调控水稻抽穗期。     

水稻抗白背飞虱基因Wbph2的初步定位

 鉴定了ARC10239/明恢63 F2群体对白背飞虱的抗性，混合F2感虫稻株的DNA，构建感虫池。应用129个RFLP探针，结合4种限制性内切酶，检测抗虫亲本ARC10239、感虫亲本明恢63和感虫DNA池的多态性。检测到6个阳性探针，分布在5个染色体上(染色体3、6、8、11和12)。应用阳性探针分析了F2群体的142个个体，发现抗虫基因Wbph2与第6染色体上的标记RZ667、RG64和RG264连锁,其中， Wbph2与RZ667的遗传距离为25.6 cM (LOD=4.50)。     

水稻粒宽基因GS5的功能标记开发和单倍型鉴定

水稻粒宽是影响籽粒粒形的重要因素之一,也是一个与水稻产量和稻米品质密切相关的重要性状。在基因GS5序列分析的基础上,对该基因第2外显子的ACC/CTA和第9外显子A/C的两个变异位点分别开发了功能标记,并将其用于294份水稻微核心种质和2007-2013年江苏省审定的65份粳稻品种的基因型鉴定。研究结果表明,这两个变异位点的等位变异在水稻籽粒的粒长、粒宽和长宽比性状上存在显著或极显著的差异;其在水稻微核心种质中组成的4种单倍型在水稻籼亚种的粒宽、粒厚和长宽比性状上存在极显著的差异,在粳亚种的粒宽和长宽比性状上存在极显著的差异;而江苏省审定的粳稻品种中仅发现Hap1和Hap2两种单倍型,其分别有64个和1个代表性品种。这些研究结果为水稻产量和稻米品质育种中充分利用GS5的优异等位基因或单倍型奠定了基础。     

水稻隐花色素基因Cry1a/Cry2/Cry1bRNAi表达载体构建及遗传转化研究

构建一个包含3个水稻隐花色素基因片段的RNAi表达载体pSC 1301-347-Cry1aCry2Cry1b并转化水稻,以期导致Cry1a、Cry1b与Cry2集体沉默,观察它们对水稻重要农艺性状的影响.结果表明,转基因水稻开花期显著延迟,结实率骤降,株高增加,剑叶变短,谷粒变长、变宽;而剑叶宽、穗长与对照无显著差异.     

转PAL基因水稻抗稻瘟病性和过氧化物酶活性的研究

 用PAL(苯丙氨酸解氨酶）基因正义和反义转化水稻，获得了70株转基因植株。选择正义转化植株(1s)和反义转化植株(4a)进行稻瘟病菌([i]Magnaporthe grisea[/i])接种，针对病原物侵染，1s的PAL活性上升更快，幅度更大。观察水稻叶片超微结构发现，1s的细胞具有更强的抵抗病原菌入侵的能力，其过氧化物酶活性也比对照和4a要高。     

抗水稻白叶枯病新基因Xa-25(t)的RAPD分析

利用RAPD标记对从体细胞突变体HX-3中鉴定出的抗水稻白叶枯病新基因Xa- 25 (t)进行了研究,在306个随机引物中,两个引物S1269和S1327在亲本和抗感池（均由12个高抗或高感植株组成）之间表现多态性。用这两个引物对龙特甫A和HX-3的F2群体的114个单株进行连锁分析,表明 S1269和 S1327与Xa-25 (t)的连锁距离分别为5.3和23.7 cM,且位于Xa-25 (t)的两侧。     

农杆菌介导的转ICE1基因提高水稻的耐寒性

利用农杆菌介导的转基因技术,成功地将通过RT PCR克隆的拟南芥ICE1基因导入垦鉴稻10号中,经PCR和Southern检测确认目的基因已整合到水稻基因组中。潮霉素抗性测定结果表明,与未转基因水稻相比,T1代表现出对潮霉素较高的抗性和孟德尔式的单位点遗传。抗寒能力检测结果表明,在同等低温胁迫条件下T1代转基因株系的死亡率明显低于未转基因对照。脯氨酸含量增幅明显高于未转基因对照。上述结果表明,转ICE1水稻提高了抗寒能力。     

不同转化方法培育无抗性选择标记转基因水稻效率的比较

 为研究不同的转化方法培育无抗性选择标记转基因水稻的效果,以4个籼粳稻品种为受体材料,比较了用农杆菌介导的双菌双载体和双T DNA单载体两种共转化技术的共转化频率及随后获得的无抗性选择标记基因转化子的效率。结果表明,在双菌双载体介导的转化中,4个水稻品种的平均共转化频率为10.1%,其中55.6%的共转化植株自交后代中可筛选出无抗性选择标记的转基因水稻植株。在单载体双 T DNA介导的共转化中,平均共转化频率为45.0%,从其中600%的共转化植株自交后代中可获得无抗性选择标记的转基因植株,即双T DNA单载体法的去选择标记的效率（270%）要较双菌双载体法（5.6%）高。     

转几丁质酶基因（RC24）水稻中大2号抗纹枯病特性研究

导入外源几丁质酶基因“RC24”的水稻中大2号接种纹枯病菌的结果表明,接种病菌后病斑扩展速率和田间病情指数小,表现为对水稻纹枯病高抗。组织病理学研究表明纹枯病菌能侵入中大2号,并引发纹枯病,入侵时间和症状出现的时间与非转基因感病对照没有显著差异,但病菌菌丝体消解现象出现早于对照,其抗病性主要表现为限制病菌扩展。以中大2号与非转基因水稻材料配制的杂交组合的抗病性表明,杂交组合的抗病性均高于非转基因亲本,但其抗病性也会因母本的不同而有所变化。     

Characteristics of Resistance to Rice Sheath Blight of Zhongda 2, a Transgenic Rice Line as Modified by Gene “RC24”

The transgenic rice, Zhongda 2, which was genetically modified from an indica rice line Zhuxian B by rice chitinase gene (RC24), had high resistance to rice sheath blight (Rhizoctonia solan!) in laboratory and a two-year field experiment. The pathogen could invade sheath of Zhongda 2 and induce symptoms of the disease. No difference was noted in time of penetration or incubation period between Zhongda 2 and non-transgenic rice control, Zhuxian B, but the hyphae lysate could be observed earlier than control. Its resistance expressed as to inhibit the growth of mycelium in host tissue. Fis from Zhongda 2(4) crossed with other five non-transgenic rice lines showed higher resistance than donor non-transgenic parents, but the resistance was different along with the different maternal parents.     

转基因与常规杂交相结合改良水稻耐盐性

通过农杆菌介导法和基因枪法将CMO、BADH、mtlD、gutD和SAMDC基因以单价或双价的形式导入水稻常规品种中,再结合常规杂交育种,选育5价强耐盐性的转基因水稻植株。1~5价9类组合的水稻品系,经PCR分子检测,在转基因后代中多价目的基因聚合,遗传稳定,且分子检测与田间耐盐性的表现一致。转基因植株在盐碱地中能正常生长,拓展了水稻常规品种耐盐性。并已获得耐0.5%~1.0%NaCl的T秀水11——品3、品6和品7等9份优良株系或中间材料。     

农杆菌介导的转高赖氨酸蛋白基因（sb401）水稻T4代分析

通过农杆菌介导的方法用富赖氨酸蛋白基因（sb401）转化粳稻品种日本晴,获得了独立的10个转化株系,对转化株系进行连续自交,通过筛选得到9个纯合的T4代转化株系。 Southern blotting分析发现,整合位点是随机的,并为低拷贝（1~3个）。TAI-PCR扩增得到8个T-DNA侧翼序列,并定位于日本晴的7条染色体上。蛋白质和氨基酸测定分析发现,sb401基因对各株系的蛋白质、赖氨酸和其他氨基酸组分的提高起到了一定的作用。将杂交结果与T-DNA插入位置结合分析发现,在低拷贝的情况下,表达量的差异不明显。     

抗稻瘟病Pi2/9/z-t基因特异性分子标记的开发

通过对已克隆的抗稻瘟病基因Pi2、Pi9以及Piz-t进行序列比对,寻找各自特异的核苷酸差异,成功开发了基于PCR技术以及电泳检测技术的Pi2/Pi9/Piz-t以及Piz-t的基因特异性分子标记,能有效地将Pi2/Pi9/Piz-t与该位点上的其他抗性等位基因及感病等位基因区分开,这为分子标记辅助育种及抗病基因聚合提供有效的分子标记。用Pi2/Pi9/Pizt基因特异性分子标记对来自全国各稻区的共101份水稻品种和育种亲本进行分子检测,结果发现,除2个品种检测到Piz-t带型之外,大部分水稻品种不携带这3个抗性基因,这为有目的地开展品种的抗性改良提供了重要的参考信息。