柞蚕抗菌肽D转基因酵母的培养及表达产物的分析

采用碱金属法（醋酸锂盐），以大肠杆菌－酵母穿梭质粒表达载体在酵母中表达人工合成的柞蚕抗菌肽Ｄ基因。用电泳及抗菌肽活性检测法对表达产物进行分析。同时还研究了转基因酵母的发酵条件，如温度、ｐＨ及营养等对酵母表达的影响。试验结果表明转基因酵母表达产物为１．１４ｍｇ／Ｌ培养液，杀菌活力为０．２１６单位。     

柞蚕抗菌肽D基因在酵母中表达的研究

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能，人工合成抗菌肽Ｄ基因（１２２ｂｐ）与含α－因子及前导肽序列的穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２重组，克隆于酵母ＡＢ１０３。在缺亮氨酸的ＹＥ培养基中筛选Ｌｅｕ＋阳性的转化子。转化子菌株培养扩增后提取重组质粒与抗菌肽基因片段探针作点杂交为阳性，电泳后插入含抗菌肽Ｄ基因１２８ｂｐ的区带。在转基因酵母的发酵液中分离上清液，浓缩，对抗菌肽敏感的指示菌Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｄ３１有明显抑菌效应。证实人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因在酵母中表达。     

柞蚕抗力肽D转基因酵母的培养及表达产物的分析

采用碱金属法（醋酸锂盐），以大肠杆菌-酵母穿梭质粒表达载体在酵母中表达人工合成的柞蚕抗菌肽D基因。用电泳及抗菌肽活性检测法对表达产物进行分析。同时研究了转基因酵母的发酵条件，如温度,pH及营养等对酵母表达的影响。试验结果表明转基因酵母表达产物为1.14mg/L培养液，杀菌活力为0.216单位。     

T3代抗菌肽转基因辣椒的PCR检测及青枯病抗性测定

对T3代抗菌肽转基因辣椒的11个株系进行了PCR分子生物学检测，证明T3代抗菌肽转基因辣椒仍保持外源抗菌肽基因；对T3代转基因辣椒群体进行了抗枯病测定试验。转基因辣椒群体抗病力提高，表明在转基因辣椒中蚕抗菌肽D、B基因得到了有效表达，从而缓减了青枯病症状。     

柞蚕抗菌肽D杀菌机理研究

本文研究柞蚕抗菌肽D对水稻白叶枯病细菌及番茄、烟奇、马铃薯青枯病细菌的杀菌作用及其机理。在37°C,pH6.8条件下,最低有效剂量2ng/1×10~5活菌。通过电镜观察,抗菌肽D对大肠杆菌及白叶枯病细菌的作用,首先使其外壁层及细胞质膜损伤,尤以菌体两端更为明显。此后形成喇叭状缺口,内容物呈囊状挤出胞外而致死。抗菌肽作用的菌体表面形成微管通道,钾离子大量渗出,但菌体外形在短时间内不致崩坏。     

农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入桑树的研究

人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因通过根癌农杆菌Ｔｉ质粒载体转入桑树叶盘，获得基因转化工程苗。柞蚕抗菌肽对桑树青枯病假单孢菌有明显杀菌作用。人工合成柞蚕抗菌肽基因导入农杆菌感染桑树叶盘并诱导成苗。经卡那霉素筛选，胭脂碱电泳检测及抗菌肽基因探针进行印迹点杂交，确认抗菌肽基因转化桑苗成功，为培育抗青枯病品种打下基础。     

柞蚕凝集素ApIML基因的克隆与表达

在昆虫的免疫防御系统中,凝集素介导的免疫反应起着重要作用。本文克隆了柞蚕凝集素蛋白基因ApIML,序列分析表明：ApIML含有927bp的开放阅读框,编码309个氨基酸。柞蚕凝集素属于分泌型蛋白质,N端有21个氨基酸组成的信号肽,含有2个糖识别结构域。系统进化分析显示ApIML与二化螟Cs-1属于同一个分支,序列相似度为70.16%。构建了ET28a-ApIML原核表达载体,经SDS-PAGE检测发现蛋白在BL21(DE3)中成功表达,并且在Ca²⁺存在时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有凝集作用。     

家蚕抗菌肽Cecropin D基因的原核表达、纯化及抑菌活性测定

根据在家蚕品系菁松和菁松近等基因系添食家蚕浓核病病毒（BmDNV）前后差异表达的抗菌肽Cecropin D,构建重组表达载体pET-41b-CecD,将测序正确的载体转化到E.coli BL21菌株中进行诱导表达,并对诱导条件进行优化。诱导产物用蛋白质印迹（western blot）进行验证。可溶性分析发现谷胱甘肽硫转移酶（GST）融合抗菌肽部分可溶,部分在表达过程中形成包涵体。GST亲和层析纯化后,分别检测重组抗菌肽的抗菌活性,结果表明：纯化后的重组抗菌肽可以很好地抑制并杀灭细菌,其效果与抗生素卡那霉素相似。     

抗菌肽D基因转化广东桑的研究(初报)

采用前文[1]报道的广东桑转基因技术方法,由叶盘法将人工合成柞蚕抗菌肽D基因导入广东桑。抗菌肽基因由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒携带,对桑树叶盘进行感染和转化,并通过施加Km选择压力,经过诱导和分化,得到了Km~R表型的桑树转化苗。通过桑树叶片胭脂碱合成酶活性电泳检测及其DNA与α—~(32)P—dCTP标记的含抗菌肽基因的探针作点杂交,初步判断柞蚕抗菌肽D基因已在转化细胞中整合,为培育桑树抗青枯病品种奠定了基础。     

柞蚕孵化酶样基因的全长cDNA克隆及表达特征分析

孵化酶是后生动物卵孵化过程中起关键作用的一类蛋白酶。基于生物信息学和RACE方法,从柞蚕胚胎中克隆了一个998 bp的孵化酶样基因全长cDNA,命名为ApHEL(GenBank登录号:JN205047)。ApHEL由15 bp 5'-UTR,98 bp 3'-UTR和885 bp ORF组成。ORF编码294个氨基酸残基,预测蛋白分子质量为33.51 kD,等电点为5.50。在ApHEL N-端存在16个氨基酸的信号肽。ApHEL蛋白酶功能区中含有锌结合序列(HEWMHILGFLHMQSTHNR)和Met-转角基序(YDYVSCLHY)等孵化酶保守功能区域。ApHEL与其他物种孵化酶氨基酸序列的相似度为30.0%～85.0%。基于孵化酶氨基酸序列的进化分析表明,柞蚕、家蚕、库蚊和果蝇聚为一类,亲缘关系较近。ApHEL在早期胚胎中没有转录,至催青第6天开始转录并维持较低水平,在催青第9天剧增至最高值直至孵化,显示ApHEL在柞蚕卵孵化过程中起重要作用。ApHEL在5龄期幼虫的中肠组织中特异性表达,暗示ApHEL可能还有其他生物学功能。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人工合成Cecropin AD基因在酵母中表达

Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 是由Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ的Ｎ 端１ １１ 位氨基酸残基和Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｄ 的Ｃ 端１２ ３７ 位氨基酸残基构成的一个杂合肽,抗菌活性高于天然抗菌肽。根据Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 的氨基酸序列,以酵母偏爱密码设计了Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因,全长１４０ｂｐ 。采用基因片段化学合成结合ＰＣＲ 法合成Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因。合成的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因克隆到ｐＣＲＴＭ２１ 上,进行ＤＮＡ 序列测定,证实合成的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因的ＤＮＡ 序列与设计序列完全一致。将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因定向克隆到大肠杆菌 酵母穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２ 的Ｂａｍ ＨＩ和Ｓａｌ Ⅰ位点上,构建成含Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因的重组质粒ｐＣＡＤ,将重组质粒转化入宿主酵母ＡＢ１０３ ,以大肠杆菌Ｋ１２Ｄ３１ 为指示菌,用活性蛋白酸性ＰＡＧＥ 法测定,具有抑菌活性,表明Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因在酵母中获得表达。     

柞蚕溶菌酶基因的克隆和序列分析

采用cDNA末端扩增(RACE)方法及简并引物克隆了柞蚕溶菌酶(Antheraea pernyilysozyme)基因(Gen-Bank登录号:DQ353869)。该基因cDNA序列全长675 bp,由3个外显子和2个内含子组成,其开放读码框(ORF)长420 bp,编码140个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的1-20位氨基酸为信号肽序列,21-140位氨基酸为柞蚕溶菌酶成熟蛋白(分子质量14 kD,等电点8.46)。柞蚕溶菌酶氨基酸序列中含有c型溶菌酶分子所特有的活性中心Glu32、Asp50以及8个半胱氨酸残基,与鳞翅目昆虫溶菌酶的氨基酸序列同源性较高,属非钙结合型c型溶菌酶。柞蚕溶菌酶的模拟三级结构与印度柞蚕(Antheraea mylitta)溶菌酶的三级结构十分相似。     

柞蚕核多角体病毒lef-12基因序列及转录分析

为加强柞蚕核多角体病毒 （Altthraea pernyi nucleopolyhedrovirus, ApNPV ）的分子基础研究,对ApNPV lef-12基因进行序列及转录分析。ApNPV lef-12基因长516个核苷酸,编码171个氨基酸,预测分子质量19．0kD。ApNPV lef-12基因5′端非编码区含有杆状病毒晚期基因启动子模序（ATAAG）,但终止密码子（TAG）下游没有典型的多聚腺苷酸信号（AATAAA）。PSI-BLAST表明18种鳞翅目NPV编码ApNPV LEF-12同源蛋白：ApNPV LEF-12蛋白与类群INPV LEF-12的氨基酸一致性高于其与类群ⅡNPV LEF-12的氨基酸一致性。ApNPV LEF-12蛋白及与其关系较近的同源蛋白的有效密码子数较低。转录分析表明,ApNPV lef-12基因属晚期表达基因。     

柞蚕核糖体蛋白基因S3a的克隆及表达分析

核糖体蛋白在蛋白质的生物合成、细胞的代谢与凋亡、机体免疫、信号转导等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)核糖体蛋白基因S3a的开放阅读框(ORF),ORF序列长795bp,编码264个氨基酸。序列比对表明,柞蚕S3a蛋白与其它10个物种S3a蛋白的相似性介于72%～99%之间,其中与柳蚕(Actias selene)S3a蛋白的相似性最高。用RT-PCR方法分析该基因在柞蚕幼虫组织中的表达情况,结果显示柞蚕S3a基因在柞蚕幼虫的血液、中肠、丝腺和脂肪体组织中均有表达,且转录水平无显著差异。SDS-PAGE和Westernblotting检测显示柞蚕S3a基因在大肠杆菌中获得了正确表达。     

应用16S rRNA基因序列鉴定柞蚕空胴病病原菌

20世纪70年代末,采用形态分类学方法,将引起柞蚕空胴病的致病菌鉴定为柞蚕链球菌(Streptococcus pernyi sp.nov)。分别提取已分离柞蚕空胴病的5株病原菌株的基因组DNA,PCR扩增16S rRNA基因片段,经克隆、测序后,与GenBank中登录的相关肠球菌、链球菌菌株的16S rRNA基因序列进行同源性比对并构建系统进化树。结果表明,供试的5株菌株的16S rRNA基因序列相似性在99.5%～99.9%之间,相互之间存在着10个可变位点,推测5株菌株属于同一个菌种;5株菌株的16S rRNA基因序列与肠球菌属(Enterococcus)16S rRNA基因序列的相似性较高,在92.4%～99.8%之间,而与链球菌属(Streptococcus)16S rRNA基因序列的相似性相对较低,在87.3%～87.8%之间;5株菌株与肠球菌属在系统进化树上聚为一类。基于菌株的16S rRNA基因序列分析,鉴定柞蚕空胴病的病原菌应归属于肠球菌属。     

柞蚕胆绿素还原酶基因ApBVRB的克隆及表达分析

柞蚕(Antheraea pernyi)幼虫体壁颜色表现出高度多样性。胆绿素还原酶(biliverdin reductase B,BVRB)可催化血红素降解过程中产生的胆绿素还原成胆红素,参与昆虫体色形成。为明确BVRB在柞蚕幼虫体色形成中的作用,克隆柞蚕胆绿素还原酶基因ApBVRB,检测其mRNA表达水平,同时调查胆绿素还原酶的活性。ApBVRB编码205个氨基酸,预测蛋白质分子质量为50.67 kD,等电点为5.15。氨基酸序列比对表明,ApBVRB与家蚕的黄素还原酶(flavin reductase,FR)具有75%的序列相似度。qRT-PCR检测结果表明,ApBVRB在柞蚕幼虫的所有受试组织器官中均表达,除丝腺外,青、黄体色幼虫之间的相对表达量并没有显著差异。酶活性检测发现,胆绿素还原酶活性在青、黄蚕的血淋巴和丝腺中有极显著差异,推测可能由于血淋巴中该酶活性的差异而导致柞蚕幼虫表现为青、黄2种体色。     

用cDNA末端扩增法克隆柞蚕攻击素(attacin)基因及序列分析

利用cDNA末端扩增(RLM-RACE)方法,克隆了柞蚕攻击素(attac in)基因cDNA序列(GenBank登陆号:AY960680)。柞蚕攻击素基因cDNA序列全长912 bp,其中699 bp的蛋白质编码区可编码233个氨基酸。预测蛋白质分子量为25 kD,等电点(pI)为7.54。柞蚕攻击素基因中包含2个内含子。S ignal P 3.0 Server程序分析结果显示,柞蚕攻击素第1-17位氨基酸为信号肽序列。蛋白质功能区分析预测,柞蚕攻击素在第47-112氨基酸之间为攻击素-N(attac in-N)功能区,第113-233位氨基酸之间为攻击素-C(attac in-C)功能区。以邻接法(ne igh-bor-join ing,NJ)建立了与其它昆虫攻击素的系统关系图。