以农杆菌为介导花生的遗传转化研究I.质粒载体的分子鉴定及农杆菌菌株的转换

以农杆菌为介导将外源基因转入花生是花生遗传转化的主要途径之一，本研究利用含几丁质酶和β-，3-葡聚糖酶基因的植物双价表达成体pCGⅡ进行花生的遗传转化研究。首先对质粒表达成体进行分子鉴定，对LBA4404菌株进行抗生素抗性试验，并针对原有菌株(HLBA4404)对抗生素的不敏感性将其换为另一菌株(NLBA4404)，为花生的遗传转化奠定物质基础。     

花生ASR基因的扩增和生物信息学分析

ASR基因(脱落酸、胁迫、成熟诱导基因)是近年来从植物中发现的一类基因,该基因参与植物对低温、干旱、渗透压、脱落酸的胁迫应答.目前在多个植物中克隆了ASR基因,研究以番茄ASRl基因的序列为探针,从花生EST数据库中筛选同源序列并进行拼接.根据花生的EST拼接序列设计引物进行RT-PCR扩增,获得一条大小为641bp的...     

花生miRNA与其靶基因的生物信息学预测

本研究利用生物信息学方法预测花生中的miRNA及其靶基因。将miRBase注册的已知植物miRNA与花生EST和GSS数据库进行比对搜索,筛选得到13条miRNA,进一步预测得到20个靶基因。分析结果显示大多数靶基因属于转录因子,调控植物的生长发育等多种生物过程。     

花生白藜芦醇研究进展

在花生体内,白藜芦醇合成酶是白藜芦醇生物合成途径中的关键酶之一,也是最主要的限速酶。将花生或葡萄中的白藜芦醇合成酶基因转化到其它植物中,可以有效提高植物的抗病性。本文简要介绍了白藜芦醇一般特性,对花生中白藜芦醇的分布、诱导因素作了相关介绍,并阐述了白藜芦醇在植物体内的生物合成途径及白藜芦醇合成酶基因的克隆、诱导表达及转化。     

花生启动子研究进展

启动子作为一种重要的分子工具，可以驱动外源优异基因在花生中表达，其克隆鉴定对花生分子育种等具有重要的应用价值。本文对植物启动子的结构特征、研究方法进行了介绍，对花生启动子国内外研究进展进行了综述，并对下一步研究重点及应用前景进行了展望，旨在为花生启动子的鉴定及应用提供参考。     

花生结瘤起始因子基因鉴定及其对氮肥的响应

结瘤起始因子NIN(nodule inception)是最早发现的与植物结瘤相关的转录因子,是根瘤固氮遗传通路中重要组成成分,在结瘤早期发挥重要调节作用。为了研究花生NIN基因的功能,我们对栽培种花生中的NIN基因进行了鉴定,并利用生物信息学对该基因家族理化性质、进化关系、基因结构、表达模式等进行分析。结果表明栽培种花生中共有33个NIN基因,按亲缘关系可以分为4类;同一类的基因具有相同的基因结构和保守结构域;花生NIN基因在各个组织中表达量均较低,Arahy.I65W25和Arahy.V4BGUX在根和根瘤特异表达;在单作花生和花生//玉米间作条件下,部分NIN基因对氮肥的响应模式不同。本研究为深入研究花生NIN基因在根瘤形成和固氮遗传通路中的作用提供了理论基础。     

花生油酸亚油酸比值（O/L）的遗传分析

应用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型，对花生品种“青苗豆×全州麻壳”、 “富川大花生×隆安宝湾花生”和“汕油162×Sunoleic95R”三个不同杂交组合的F2分离群体的油酸/亚油酸比值进行了单个分离世代的数量性状分离分析，结果表明：“青苗豆×全州麻壳”、“富川大花生×隆安宝湾花生”两个杂交组合结果一致，O/L受一对负向完全显性的主基因控制，F2群体表现为由主基因型AA和Aa+aa按1：3比例的混合；另一个组合“汕油162×Sunoleic95R”的油酸/亚油酸比值受两对加性-显性-上位性主基因控制遗传，两对主基因间的基因效应差异不大。第一对主基因加性效应（da）1.3586和第二对主基因加性效应（db）1.3580几乎相同。三个组合的主基因遗传力分别为61.27﹪、64.09﹪和64.66﹪，多基因的遗传力分别为33.85％、34.52％和33.45％。     

花生中蔗糖合成酶基因AhSuSy在花生中的组织表达及对非生物胁迫响应研究

低温、高盐和干旱胁迫严重影响植物的生长和产量。本研究以花生品种花育33号为实验材料,根据cDNA文库中已知的蔗糖合成酶基因AhSuSy全长序列设计引物,通过RT—PCR克隆到该基因。通过荧光定量PCR分析了该基因在花生各组织中的表达及在低温、高盐等非生物胁迫下的表达。结果显示,该基因为组成型表达基因,在叶片和根中表达量较高,在花中表达量最低;AhSuSy基因在花生的叶片和根中对低温均没有明显响应,但在花生根中受高盐胁迫和干旱胁迫明显诱导,说明该基因可能参与了花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控;AhSuSy在花生根中受ABA的明显诱导,说明该基因对花生非生物胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式进行的。     

花生AhCLE基因家族鉴定及对土壤紧实和氮素复合胁迫响应分析

花生是我国重要的油料作物，其生长过程面临多种土壤环境逆境胁迫。CLE(CLAVATA3/Embryo Surrounding Region)多肽是目前研究最深入的植物多肽(多肽激素),具有类似传统植物激素的调节功能，广泛参与植物生长发育及抗逆过程。目前关于花生CLE(AhCLE)家族基因鉴定及抗逆功能的研究尚未见报导。本研究基于花生基因组注释信息，系统鉴定AhCLE家族成员并对其进行基因亚细胞定位、染色体定位、多序列比对、基因保守基序、基因结构及系统进化等分析；利用转录组信息结合实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测AhCLE基因家族各成员在花生不同组织部位及不同的土壤紧实及氮素胁迫条件下的表达情况。研究结果表明：AhCLE基因家族由9个成员组成，均含有12个氨基酸组成的CLE保守结构域序列；亚细胞定位预测结果显示该基因家族成员均位于细胞外，为分泌型蛋白；启动子区顺式作用元件分析发现，该家族成员具有多个逆境胁迫及植物激素响应元件，表明AhCLE家族可能与多种植物激素协同参与调控植物逆境胁迫；聚类分析发现，该家族成员分布于4个不同的分支中，分别与拟南芥的AtCLE家族不同成员聚在一...     

花生△12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建

从花生的幼嫩叶片中提取总DNA，应用PCR方法分离到了两个FAD2基因片段，分另4命名为FAD2-1和FA192-2，将反向的FAD2-1和FAD2-2片段分别与所克隆的大豆油体蛋白基因启动子片段oleosin-a与oleosin-b相连，在中间表达载体pSPROK中构建了三个带T-nos的融合基因，进而把融合基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300中，酶切鉴定后进行测序，结果表明，所构建的三个植物表达载体均分别带有Oleosin启动子和反义FAD2基因序列，FAD2-2的长度为593bps，与引用序列的同源性达到97％，包含一个起始密码子；FAD2—1的长度为1175bp，与引用序列的同源性达到99％，包含一个起始密码子与一个终止密码子。将构建好的植物表达载体已经转化农杆菌LBA4404并用于侵染花生外植体。     

花生多胺氧化酶基因的克隆与鉴定(英文)

多胺作为一类新型植物生理活性物质,对植物生长发育起着重要作用,在细胞工程与农业生产中具有广阔的应用价值。多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)是催化多胺降解的关键酶之一,对调控植物细胞中多胺浓度非常重要,影响植物的生长发育、形态建成过程。根据国际DNA数据库中已报道的PAO蛋白的保守结构域,设计简并引物(degenerate pri mer),通过RT-PCR方法首次从花生(仲恺花1号)中克隆PAO基因cDNA序列,并利用BLASTn、BLASTp及多重序列排比(Multiple Sequence Alignment)等生物信息学方法对所克隆的cDNA进行序列分析与鉴定,初步确定已从花生中克隆到PAO基因的同系物(homolog)。根据克隆的花生PAOcDNA序列(AhPAO1)设计特异引物,通过半定量RT-PCR方法检测花生胚根、胚芽和幼叶中AhPAO1基因的表达,结果发现胚根中AhPAO1基因表达最强,胚芽和幼叶中的表达无明显差异。本研究为进一步了解花生种子萌发和幼苗生长发育过程中多胺氧化酶基因表达的时空特异性奠定实验基础,并对进一步利用植物基因工程技术综合调控花生体内多胺水平有重要实践意义。     

花生CONSTANS-Like（COL）家族基因的克隆与表达分析

开花是植物从营养生长到生殖生长的重要过程,CONSTANS-Like（COL）基因是植物光周期诱导开花途径中的关键转录因子,但是在花生中的具体功能尚不清楚。本研究通过生物信息学的方法对花生COL 基因家族成员序列特征、系统进化关系、基因结构、保守结构域及表达模式进行分析,最终克隆了17个AhCOL 基因（AhCOL1-Ah⁃COL17）。花生17个AhCOL 基因氨基酸长度范围为327aa~617aa,等电点（pI）均小于7,在蛋白质序列的氮端与碳端 均含有保守的BBX和CCT结构域。此外,不同组织中的基因表达模式分析,表明多数AhCOL 基因在叶片中的表达量显著高于其他组织。不同时期的表达量分析表明多数AhCOL 基因的表达量从苗期到开花期呈现递增。本研究为研究花生AhCOL 基因的潜在功能奠定了重要基础。     

花生AT-hook家族基因的生物信息学分析

AT-hook蛋白不仅在植物生长发育、器官构建、胁迫和激素信号应答中起重要作用,而且还作为染色质重塑的转录因子和辅助因子,调节基因的转录活性.为全面了解花生AT-hook基因家族的结构特征,利用生物信息学技术比对花生基因组数据库,分析AT-hook基因家族成员的理化性质、基因结构、保守结构域和系统发育关系以及在12个组...     

以农杆菌为介导花生遗传转化研究

应用花生丛生芽再生体系，以农杆菌为介导将含有几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶抗病基因的植物双价表达载体pCGII转入花生品种泉花10号和金花1012，获得转基因植株，并已通过PCR和Southern blot鉴定，研究表明，侵染时间以5－15min的效果较好，侵染时间过长不利于提高转化率；0－1d预培养对基因转化有利，预培养2d可使转化率下降。     

花生中FAR1-5转录因子的克隆和功能分析

FARl是一类起源于转座子酶的转录因子,在光敏色素A(phyA)信号通路启动、植物光形态建成中具有重要作用。本试验对抗旱花生品种J11的FAR1-5基因进行了克隆,通过序列比对进化分析,表明其与野生花生Arachis duranensis,A.ipaensis相关基因具有较高相似度。干旱胁迫状态下,转基因植株抗旱性强于野生型植株,抗氧化酶活性增强,表明该转录因子可积极响应花生抗旱胁迫。研究结果可为花生抗旱育种提供新的基因资源。     

花生籽仁黄酮含量遗传模式分析

黄酮是花生种子中重要的功能性成份,明确花生籽仁黄酮含量的遗传模式,为培育高黄酮花生品种奠定基础。本研究以花育22号和P76为亲本构建的重组自交系群体为材料,鉴定其种子黄酮含量,结果表明,亲本花育22号及P76的黄酮含量分别为19μg RTE/g FW、70μg RTE/g FW,群体花生种子黄酮含量在4~181μg RTE/g FW之间。采用植物数量性状分离分析软件分析其遗传模式,结果表明花生种子黄酮含量受四对主基因控制,主基因遗传力为98.48%,具有加性效应,加性效应值在-46.7535~234.6343之间,基因之间具有互作效应,三对基因间的互作可提高花生籽仁黄酮含量。     

花生GSTs家族基因的全基因组分析

谷胱甘肽转移酶(glutathione-S-transferase, GST)是一类重要的多功能超家族酶,普遍存在于植物体中,作为配体或结合蛋白,在调控植物的生长发育、解除外界毒素作用过程起到重要作用。为全面了解花生GSTs基因家族的结构特性,本论文通过生物信息分析技术对花生GST基因家族进行全基因组鉴定和表达特性分析,结果表明,在花生全基因组中一共有163个GSTs基因,其中A组基因中含有76个,B组基因中含有87个。基因结构和发育进化树将花生GST基因分为6类:Tau、Theta、Lamda、EF1Bγ、Phi和DHAR,花生GST家族基因结构进化相对保守,但各基因的内含子数量及长度有较大差异,其中EK5R9的外显子数最多,达19个;而K7JNV的内含子最长,约18 kb。MEME分析发现,花生GST家族基因中存在9个保守域,各基因中的保守结构域为6～8个不等。染色体定位显示,花生GSTs家族基因在花生A、B染色体组上呈不均匀分布,在A02、A03、A07、A09、B02、B03、B05、B08和B09号染色体上存在1～2个基因簇。表达分析发现,只有80个花生GST基因具有组织表达差异,其中6个的组织表达有极显著差异。本研究为GSTs基因的功能研究及花生抗逆性提高提供了理论依据。     

花生NRT1基因对盐胁迫的响应

盐胁迫属于一类重要的非生物胁迫,抑制植物的生长发育,影响植物对营养元素的吸收利用。氮元素是构成生物体核酸和蛋白质的主要元素,在维持植物生命活动以及作物产量和品质等方面有重要作用。设置不同盐胁迫浓度,测定盐胁迫后花生叶片硝酸盐含量,分析NRT1基因家族特征及其对盐胁迫的响应。结果表明,盐胁迫抑制叶片中硝酸盐的积累,并随盐浓度上升叶片中硝酸盐含量下降,推测盐胁迫可能抑制了硝酸盐转运蛋白的表达。硝酸盐转运蛋白1(NRT1)家族是植物中最大的硝酸盐转运蛋白家族。利用生物信息学分析发现,花生基因组中有37个NRT1基因,按亲缘关系的远近可以分成6类。基因结构与表达分析发现,NRT1基因间跨膜区和外显子数目差异较大,在22个不同组织中的表达具有明显的组织特异性。在栽培花生品种Tifrunner中发现了9个对盐胁迫响应的NRT1基因,推测这些基因可能参与盐胁迫条件下氮素的吸收和转运。本研究为深入研究硝酸盐转运蛋白的功能及其在盐胁迫条件下花生氮素吸收转运中的作用奠定了基础。     

野生种花生钙依赖蛋白激酶基因家族的生物信息学分析

Ca2+是植物中重要的第二信使,几乎介导了植物生长发育的全部反应。钙依赖蛋白激酶(CDPKs)是植物中重要的钙传感蛋白,在植物生命活动中扮演着重要角色。目前2个二倍体野生种花生全基因组序列已经公布,而由2个野生种杂交后形成的异源四倍体栽培种花生的全基因组序列还没有公布,野生种花生CDPKs的生物信息学分析结果可以为栽培种花生CDPKs的研究提供参考。本研究采用生物信息学方法和工具对2个野生种花生CDPKs基因家族的全基因组分布、基因结构、进化和理化性质等进行分析。结果表明:2个野生种花生全基因组均比对到35个CDPKs基因序列,野生种花生与拟南芥CDPKs基因结构类似,蛋白质结构具有典型的蛋白质激酶和EF手型结构域,2个野生种花生与其它物种在进化过程中CDPKs变异较小,可能作为钙传感蛋白在细胞内各个部位和细胞器中行使功能。本研究结果可为栽培种花生的CDPKs结构和功能研究提供参考。     

花生DREB类转录因子基因AhDREB3的序列及非生物胁迫下表达分析

DREB类蛋白属于AP2/ERF转录因子家族的一个亚家族,在植物非生物胁迫抗性调控中具有重要功能。为了挖掘花生逆境胁迫相关功能基因AhDREB3,从已公布的花生基因中找到干旱应答元件结合蛋白3（AhDREB3）的编码基因全序列,做编码蛋白的进化分析。根据已知序列设计引物,通过荧光定量PCR检测了该基因在低温、高盐和干旱胁迫下及对外源ABA响应和表达。荧光定量PCR结果显示,AhDREB3基因在花生的叶片和根中对低温没有响应,对高盐（叶片和根）和干旱（根）胁迫有较大响应,说明它可能参与了花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控。此外,AhDREB3基因的表达在花生叶片和根中对外源ABA响应变化小,暗示了该基因在花生中可能通过不依赖于ABA的方式起作用。