急性非洲猪瘟脑损伤及NF-κB介导脑水肿形成机制研究

【目的】 在试验条件下研究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）所致急性脑损伤及核因子κB （NF-κB）介导脑水肿发生的相关病理机制。【方法】 18头健康长白猪随机分为2组，攻毒组（13头）和对照组（5头），攻毒组肌内注射剂量为10²HAD₅₀/mL （HAD₅₀：半数红细胞吸附量）的ASFV毒株Pig/HLJ/18，对照组注射等体积生理盐水，试验期为15 d。试验期间观察临床症状，剖检死亡猪并观察脑部病变；利用原位PCR检测进行病毒定位；HE染色及甲苯胺蓝染色观察脑组织病理变化；免疫组化染色法检测脑组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、干扰素-γ（IFN-γ）、NF-κB、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、水通道蛋白4（AQP-4）的表达。【结果】 攻毒组9头猪表现出临床神经症状，脑部剖检病变主要为脑膜充血和不同程度的脑实质水肿；ASFV主要位于脑部微血管中；病变早期主要为脑水肿，脑皮质区结构疏松、血管周围间隙增宽、神经元肿胀变圆、染色变淡，中后期除了表现脑水肿的特征外，还可见脑血管充血、多量微血栓形成及淋巴细胞浸润；免疫组化结果显示，攻毒组TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB及MMP-9主要在神经元及胶质细胞中表达，AQP-4的阳性细胞主要是微血管周围的星形胶质细胞，与对照组相比，攻毒组上述6种因子的阳性表达率均极显著增高（P<0.01）。【结论】 急性非洲猪瘟脑损伤的主要表现为脑膜血管充血出血和脑实质水肿、组织学病变显示病毒性脑炎，ASFV感染脑部，促进炎性因子的异常高表达，通过激活NF-κB信号通路对TNF-α、IL-1β、IFN-γ的转录进行调控，使这几种炎性因子的产生和释放增多，扩大炎症反应，影响血脑屏障的通透性，还能上调MMP-9与AQP-4的表达，破坏血脑屏障，促进脑水肿的发生发展。     

PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。     

DDX19抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制

先天免疫是宿主防御病原感染的第一道防线,在抵抗病原感染过程中起着至关重要的作用。病原分子模式被模式识别受体所识别,激活天然免疫反应。其中,RLRs(RIG-I和MDA5)是细胞质中识别RNA的模式识别受体。当病毒感染细胞后,病毒基因组RNA释放进入细胞质,与细胞质中的RLRs结合,使其与接头分子MAVS相互作用。然后MAVS招募其它的免疫分子如TRAF3、TANK等。TANK能够与激酶TBK1、IKK着相互作用,使TBK1、IKK着发生自身磷酸化而激活。活化的TBK1、IKK着能够磷酸化IRF3,使其形成同源二聚体,进入细胞核,启动Ⅰ型干扰素基因的转录。     

SHP1在PRRSV诱导的抗病毒免疫反应中的作用

为了探究SHP1在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)诱导的抗病毒免疫中的作用,本研究采用200个TCID50的PRRSV感染猪肺巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),分别培养12,24,36,48h后收集细胞及上清,分别设正常细胞对照组,聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,polyI:C)刺激对照组,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激对照组。采用ELISA方法检测PRRSV感染的PAM培养上清中SHP1的蛋白表达情况。用实验室已经建立的实时荧光定量PCR方法对PRRSV感染组和各个对照组PAM细胞中IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1和IFN-β的mRNA转录水平变化进行定量分析。结果显示:激活的SHP1对PRRSV感染后PAM中IRF7、NF-kB和IFN-β的转录有促进作用,对IRF3和TRAF6的转录有抑制作用。LPS及Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM细胞均促进了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1和IFN-β的转录。结果表明,激活的SHP1会通过TLR介导的信号通路或未知通路来调节PRRSV诱导的抗病毒免疫反应水平。LPS和Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM细胞能够增强抗病毒细胞因子的转录水平。     

cGAS介导牛分枝杆菌诱导小鼠髓源树突状细胞成熟

旨在深入研究小鼠髓源树突状细胞(BMDC)感染牛分枝杆菌(M.bovis)后环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶(cGAS)的调控作用。通过体外诱导C57BL/6骨髓细胞分化为树突状细胞,建立牛分枝杆菌感染模型,运用siRNA技术沉默cGAS基因的表达,分别设置对照组、感染组、沉默组。通过流式细胞仪检测BMDC表型变化,Western blot和免疫荧光技术检测cGAS信号通路中STING、TBK1、p-TBK1及IRF3的表达情况,ELISA检测细胞上清液中细胞因子分泌水平。结果表明,牛分枝杆菌可刺激BMDC引起细胞表面标志物CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ表达升高,相关细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-6分泌量提高,BMDC的抗原提呈能力增强。同时cGAS信号通路被激活,下游STING、p-TBK1、IRF3蛋白活化,而沉默cGAS基因后相关指标均显著下调。这表明牛分枝杆菌感染BMDC可激活cGAS信号通路,且cGAS有助于BMDC的成熟和活化。     

FADV-4感染LMH细胞STING依赖的干扰素及细胞因子转录水平动态变化

为了探讨干扰素刺激基因(STING)依赖的干扰素及细胞因子在血清4型禽腺病毒(FADV-4)感染鸡肝癌细胞(LMH)后的表达量情况。试验将FADV-4感染LMH细胞，观察病变，收集感染后24,48,72,96,120 h的细胞样品，抽提RNA反转录成cDNA,通过实时荧光定量PCR技术监测FADV-4病毒复制情况及STING、TANK连接酶(TBK1)、干扰素调节因子7(IRF7)、干扰素α(INF-α)、干扰素β(INF-β)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、白介素1β(IL-1β)基因表达量动态变化。结果表明：FADV-4感染LMH细胞24 h后，细胞开始出现病变迹象，随着感染时间延长，细胞出现变圆变亮、脱落、死亡等典型病变。病毒在24～48 h快速增殖，72 h出现增殖高峰(9.13×10¹⁰ copies/μL),96～120 h呈现下降趋势。与对照组相比，STING和IRF7的表达量在感染72 h后显著上调(P<0.05),96～120 h极显著上调(P<0.01);其中TBK1表达量在24～72 h上调，96～120 h下调；I...     

蓝舌病毒NS4基因真核表达对IFN-β信号通路基因mRNA表达的影响

通过构建蓝舌病毒(BTV)NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,转染HEK-293T细胞,利用Western blot及荧光显微镜分析NS4蛋白的表达与亚细胞定位特征;pcDNA3.1-NS4-eGFP转染的HEK-293T细胞添加20 HAU/mL仙台病毒(SeV)刺激后,qRT-PCR法分析NS4基因表达对SeV诱导的上游识别基因RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、干扰素基因(IFN-α、IFN-β)以及干扰素刺激基因ISG15和USP18的mRNA表达水平的影响。在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP质粒24 h后,分别添加20 HAU/mL SeV刺激24,48 h,qRT-PCR结果表明,细胞内表达NS4-EGFP后,RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15及IFN-β基因mRNA表达极显著下降,随着SeV诱导时间的延长,VISA、TBK1、IKKε、USP18基因mRNA表达差异呈不显著趋势。本研究成功构建BTV NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,NS4-EGFP融合蛋白在HEK-293T细胞中主要分布于细胞核周围及细胞核内。BTV NS4基因在HEK-293T细胞内的表达显著下调SeV诱导的IFN信号通路相关基因RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β的表达,为进一步探究NS4基因在BTV拮抗宿主细胞免疫应答中的机制奠定基础。     

TNF-α在IFN-γ诱导的感染牛分枝杆菌的THP-1细胞凋亡过程中的作用及相关信号通路分析

为研究IFN-γ对感染牛分枝杆菌的THP-1细胞的促凋亡作用,及TNF-α在此细胞凋亡过程中的作用和相关信号分子的变化,使用浓度为15 ng.mL-1的IFN-γ作用于不同剂量牛分枝杆菌北京株(MOI10∶1,20∶1)感染的THP-1细胞,在感染后12、24、36、48和72 h,使用流式细胞仪测定细胞凋亡百分比。结果显示,IFN-γ诱导了M.bovis北京株感染的细胞凋亡,并且凋亡呈时间相关性。随着细胞凋亡百分比的增加,牛分枝杆菌的CFU降低。在IFN-γ和M.bovis北京株(MOI10∶1)处理的巨噬细胞内加入抗TNF-α单克隆抗体,感染后36 h,细胞凋亡百分比测定结果显示,加入抗TNF-α单抗抑制了IFN-γ诱导的M.bovis感染的THP-1细胞的凋亡,与对照组相比,差异显著(P0.05);用分光光度计检测表明Caspase-3和Caspase-8的激活是TNF-α依赖性的。在IFN-γ和M.bovis北京株(MOI10∶1)作用的THP-1细胞内分别加入JNKinhibitor I或NEMO-Binding Domain BindingPeptide,或同时加入2种抑制剂,36 h后测定细胞凋亡情况,与对照组相比,加入抑制剂后,细胞凋亡无显著差异(P0.05),说明在本试验中,JNK通路和NF-κB凋亡通路未被激活。本研究初步阐明了TNF-α在IFN-γ诱导的感染牛分枝杆菌的细胞凋亡过程中的作用及相关信号通路。     

H3N2亚型猫流感病毒抑制Ⅰ型干扰素机制分析

家猫对高致病性和低致病性禽流感病毒(AIV)均易感,感染后可以导致肺炎的发生,而其易感机制无相关报道。本研究利用H3N2亚型AIV家猫分离株(FIV)为模型,分析了感染后对IFN-β应答的影响及机制。结果显示H3N2 FIV可以很好的在猫肾细胞(CRFK)上复制并导致明显的细胞病变(CPE),在感染48h后病毒滴度达104±0.25TCID50/mL;通过荧光素酶报告系统发现该病毒感染后不能激活IFN-β应答,反而能够抑制SeV介导的IFN-β通路激活。机制分析发现病毒能够抑制IRF3通路进而阻断IFN-β应答。本研究首次发现猫源H3N2亚型AIV能够抑制Ⅰ型干扰素应答,为理解H3N2亚型AIV如何跨种感染家猫提供了科学参考     

MDA5在先天性免疫抗病毒作用中的研究进展

黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene-5,MDA5)是胞浆内核酸受体,与病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)相结合,特异性地识别较长的双链RNA,功能与视黄酸诱导表达基因Ⅰ(retinoic acid-inducude gene Ⅰ,RIG-Ⅰ)相似,通过自身级联激活和招募结构域(CARD)与接头蛋白CARD同源相互作用之后,与接头蛋白线粒体连接蛋白(MAVS)(也叫VISA、Cardif或IPS-1)结合,相互作用后会导致RIG-Ⅰ样受体(RLR)在内膜上重新定位,一边招募来TRAF2/TRAF6活化IKK激酶复合物,从而激活转录因子NF-κB;另一边招募来TRAF3和TBK1,从而促进IRF3的磷酸化激活,活化后的转录因子NF-κB及IRF会进入细胞核,共同协作促进Ⅰ型干扰素基因的表达.     

火炭母缓解鼠伤寒沙门菌致小鼠肝损伤的机制研究

【目的】探讨火炭母口服液对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏的保护作用及其机制。【方法】将48只雄性BALB/c小鼠随机分为6组：空白对照组、模型组、阳性药物组及火炭母高、中、低剂量组,每组8只。阳性药物组小鼠灌胃庆大霉素(20 mg/kg),火炭母高、中、低剂量组小鼠分别灌胃16、8和4 g/kg火炭母,空白对照组和模型组小鼠分别给予等体积的PBS,连续给药8 d。预防性给药2 d后,空白对照组小鼠灌胃0.2 mL PBS,其他组小鼠一次性灌胃0.2 mL 5×10⁴ CFU/mL鼠伤寒沙门菌溶液。给药结束后处死小鼠,解剖取肝脏,制作组织切片并经HE染色观察肝脏病理变化,平板培养基培养肝脏组织悬液检测小鼠肝脏载菌量,Western blotting检测α干扰素(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、TANK结合激酶1(TBK1)、干扰素调节因子3(IRF3)蛋白表达水平。【结果】肝脏病理观察结果显示,模型组小鼠肝脏有淤血,大量炎性细胞浸润,肝细胞明显肿胀、排列紊乱,胞质染色加深,肝细胞坏死和凋亡;经火炭母处理后,高剂...     

辣蓼上调cGAS-STING信号通路改善鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的脾脏免疫损伤

为了探究辣蓼水提液对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠脾脏免疫损伤的保护作用及其潜在机制，试验将48只健康、体重接近的SPF级雌性Balb/c小鼠随机分为6组，分别为空白对照组、模型组、阳性药物组及辣蓼高、中、低剂量组，每组8只。空白对照组和模型组灌胃PBS,阳性药物组每天按体重灌胃给予庆大霉素20 mg/kg,辣蓼高、中、低剂量组分别灌胃给予20,10,5 g/kg的辣蓼水提液，小鼠给药体积为按体重0.2 mL/10 g,连续给药8 d。给药2 d后，除空白对照组外其余组小鼠均灌胃LD₅₀(5×10⁴ cfu/mL)鼠伤寒沙门氏菌0.2 mL,末次给药后禁食不禁水12 h,麻醉小鼠安乐死后取脾脏组织进行组织病理学检查、鼠伤寒沙门氏菌负荷量测定，以及α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素(IFN-γ)、干扰素调节因子3(IRF3)、磷酸化干扰素调节因子3(p-IRF3)、TANK结合激酶1(TBK1)、磷酸化TANK结合激酶1(p-TBK1)、干扰素刺激基因(STING)与环腺苷酸鸟苷酸合成酶(cGAS)蛋白相对表达量的检测。结果...     

非洲猪瘟病毒MGF360-14L靶向MAVS抑制Ⅰ型干扰素的产生

本研究旨在探究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）多基因家族成员MGF360-14L对Ⅰ型干扰素（IFN）的抑制作用及其作用机制。通过双荧光素酶试验检测MGF360-14L对线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）诱导的干扰素β（IFN-β）启动子活性的影响,免疫共沉淀和激光共聚焦检测MGF360-14L与MAVS的互作关系,及Western blot分析MGF360-14L对MAVS和TRIM21诱导的TBK1和IRF3磷酸化的影响。结果表明,ASFV非结构蛋白MGF360-14L抑制MAVS诱导的IFN-β启动子活性。MGF360-14L能够与MAVS互作,并且对MAVS和TRIM21诱导的TBK1和IRF3磷酸化具有抑制作用。此外,当过表达MGF360-14L时,MGF360-14L蛋白与TRIM21竞争结合MAVS,抑制TRIM21对MAVS的泛素化作用,从而降低IFN-β的水平。综上所述,MGF360-14L可能通过竞争性结合MAVS,抑制TRIM21对MAVS的泛素化,从而下调Ⅰ型IFN的产生。研究结果为探究ASFV的免疫逃逸机制提供了新线索。     

禽呼肠孤病毒感染对SPF鸡外周血淋巴细胞中天然免疫相关基因转录的影响

为了明确禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)感染对宿主天然免疫应答的影响,利用实时荧光定量PCR方法检测ARV感染SPF鸡后外周血淋巴细胞中天然免疫相关基因,包括Toll样受体(TLRs)、MDA5、IPS-1、IRF-3、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFITM3、Mx1和OASL等基因在感染后0、12h以及1、2、3、5和7d的转录水平变化。结果表明,ARV感染SPF鸡后7d以内,外周血淋巴细胞中TLR3和TLR21的mRNA转录水平显著降低(P0.05或P0.01);而TLR7和MDA5的mRNA转录水平则在整个试验过程中显著升高,分别在7dpi和1dpi达到峰值(P0.05或P0.01)。IPS-1的mRNA转录被抑制;IRF-3则呈显著转录上调趋势;IFN-α、IFN-β和IFN-γ均表达上调,分别在2~3dpi达到峰值(P0.05或P0.01)。IFITM3、Mx1、OASL的mRNA转录水平也显著升高,均在3dpi达到峰值(P0.01)。试验结果表明ARV在感染早期能够显著性引起TLR7、MDA5、IRF3、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFITM3、Mx1和OASL的转录上调,抑制TLR3、TLR21和IPS-1的转录,为进一步阐释ARV的分子致病机制和免疫应答机制奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通过阻碍STAT1/STAT2核转位抑制Ⅰ型干扰素的信号转导

Ⅰ型干扰素(IFNs),IFN-α/β诱导抗病毒应答,在天然免疫抗病毒感染中起着重要作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制Ⅰ型干扰素的合成,但其是否抑制IFN的信号转导尚未明确。本研究结果发现PRRSV干扰IFN的信号转导通路。用PRRSV VR2385株感染MARC-145细胞,经IFN-α处理的感染细胞中,干扰素刺激基因ISG15和ISG56的转录、信号转导蛋白及转录激活因子(STAT)2水平均显著低于未经过IFN-α处理过的对照感染细胞。在PRRSV感染的细胞中,IFN诱导的STAT1和STAT2磷酸化及其异源二聚体的形成都未受影响,但大部分的STAT1/STAT2/IRF9的三聚体仍存在于PRRSV感染细胞的细胞质中,表明三聚体的核易位受到了阻碍。PRRSV VR2385感染的细胞中过度表达的NSP1β抑制了ISG15和ISG56的表达,并阻止STAT1的核转位,这些都表明NSP1β可能是抑制IFN信号转导的病毒蛋白。PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)也抑制INF-α刺激的ISG基因和STAT2蛋白的表达。相反,已获批上市的的低致病性疫苗株Ingelvac PRRSV MLA感染PAMs,不需要添加外源的IFN就能活化包括趋化因子和抗病毒细胞因子等IFN诱导基因的表达,且检测不出其对IFN的信号转导产生影响。这些发现都说明PRRSV通过阻碍ISGF3的核转位阻止Ⅰ型干扰素的活化和信号转导通路。     

Poly(I:C)对PRRSV诱导的抗病毒免疫反应的影响

为了研究聚肌苷胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)诱导的抗病毒免疫反应的影响,本研究采用200个TCID50的PRRSV感染猪肺巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),吸附1h后用100μg/L的聚肌苷胞(poly(I:C))处理细胞,分别培养12、24、36、48h后收集细胞及上清,同时设PRRSV感染对照组、poly(I:C)刺激对照组和健康细胞对照组,用实验室已经建立的Real-time qPCR方法对poly(I:C)刺激PRRSV感染组和PRRSV感染对照组中PRRSV复制水平及各组PAM细胞中IFN-α、TNF-αmRNA转录水平变化进行定量分析。结果显示,PRRSV在感染PAM细胞后12~24h期间可促进PAM细胞IFN-αmRNA的转录,36~48h期间抑制PAM细胞IFN-αmRNA的转录;TNF-αmRNA转录水平在12、48h后略微升高,在24、36h后均略微下降。Poly(I:C)处理PAM细胞后IFN-α、TNF-αmRNA转录水平均上调。Poly(I:C)+PRRSV组IFN-αmRNA的转录水平与PRRSV组相比在12~36h均显著升高,在48h后则显著下调。Poly(I:C)+PRRSV组TNF-αmRNA转录水平与PRRSV组相比,12~36h后均升高,在12h升高较显著,48h后则显著下调。结果表明,PRRSV感染PAM细胞经Poly(I:C)刺激后IFN-α、TNF-αmRNA转录水平在12~36h后显著升高,从而抑制了PRRSV在PAM细胞内的复制。     

免疫复合物对猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导的PAM细胞因子转录的影响

本试验通过研究免疫复合物影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在巨噬细胞内增殖的因素,来进一步探讨免疫复合物经FcγR介导的PRRSV感染机制.本研究将含200 TCID50 PRRSV病毒液与等体积的终浓度为1.30 mg· mL-1的猪IgG-兔抗猪IgG复合物分别先后和同时接种于PAM细胞,分别于12、24、36、48 h收集细胞液,同时设PRRSV感染对照组、免疫复合物对照组和健康细胞对照组,利用建立的相对荧光定量PCR和绝对荧光定量PCR方法分别检测巨噬细胞中IFN-α、IL-10和TNF-α的mRNA转录水平及PRRSV的RNA水平,并进行定量分析,同时采用ELISA方法检测健康细胞中IFN-α的蛋白水平.结果显示,在感染后12～36 h期间,免疫复合物能够抑制PRRSV诱导的IFN-α的mRNA水平,TNF-α mRNA水平在感染后12 h被促进,而在24～36 h期间被抑制.在感染后48 h,免疫复合物能促进IFN-α和TNF-α的mRNA水平,而在12～48 h期间均能抑制IL-10的mRNA水平,此外,免疫复合物在感染12、24和36 h时间段内均能明显促进病毒的增殖,但在48 h后不显著.健康细胞中IFN-α的蛋白水平在培养12～48 h之内呈“降-升-降”的趋势.结果表明,IFN-α蛋白的表达与其mRNA的转录不同步.在PRRSV感染初期,免疫复合物能抑制PRRSV诱导的抗病毒因子的mRNA水平,病毒的复制被促进,而在感染后期,抗病毒因子达到一定的浓度后发挥抗病毒作用,在一定程度上抑制病毒的复制.而TNF-α的转录规律不明显,表明免疫复合物可能同时与激活型和抑制型FcγR结合来共同调节PRRSV诱导的细胞因子的转录.     

PCV2人工感染对猪肺泡巨噬细胞干扰素信号通路的调控研究

通过建立PCV2亚临床感染模型,探究感染仔猪肺泡巨噬细胞中干扰素的变化及其调控,为PCV2复制和发病机制研究提供补充。30日龄猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性的仔猪15头,随机分成PCV2阴性对照0d组、PCV2感染14d组和PCV2感染28d组。感染后荧光定量PCR方法检测肺泡巨噬细胞中干扰素、模式识别受体和模式识别受体接头分子mRNA水平。结果显示,IFN-β和IFN-γmRNA转录水平在14和28d均显著高于对照组(P0.05);模式识别受体RIG-1、MDA-5、TLR4和TLR9mRNA转录水平在14和28d显著升高(P0.05);DAI mRNA转录水平在14d显著升高(P0.05),但28d迅速下降;TLR3、TLR7和TLR8mRNA转录水平无明显变化。接头分子MAVS、MyD88、IRF3和IRF7mRNA转录水平在14和28d均显著高于对照组(P0.05)。以上结果表明,PCV2亚临床感染仔猪后导致肺泡巨噬细胞内IFN-β和IFN-γ的表达量上调,其上调和PCV2激活的TLR4/TLR9/MyD88和RIG-1/MDA-5/DAI/MAVS/IRF3信号通路有关。     

PRRSV在感染早期通过活化CREB竞争抑制p65与CBP结合

为研究细胞内cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的结合蛋白(CBP)在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染后的结合动态对Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)表达的影响,本研究利用HP-PRRSV强毒Hu N4株感染宿主细胞,采用CO-IP方法分析CREB的磷酸化情况及其结合动态。结果显示Hu N4株感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)能够引起CREB明显磷酸化,Hu N4株感染PAMs和Marc-145细胞使p38磷酸化水平显著上调,PKA通路抑制剂可以明显抑制Marc-145细胞中CREB的磷酸化水平,但不影响PAMs中CREB的磷酸化水平。并且Hu N4株感染Marc-145细胞1 h后磷酸化的CREB能够与CBP结合,并抑制了p65与CBP的结合。当抑制剂H-89和SB203580抑制Marc-145细胞中CREB的磷酸化后,CREB与CBP的结合同时受到抑制。本研究表明HP-PRRSV Hu N4株感染细胞后,可以通过激活p38 MAPK通路而活化CREB,活化的CREB与p65竞争结合CBP,而抑制p65与CBP的结合,使得HP-PRRSV在感染早期抑制了IFN-β的表达。本研究为深入研究HP-PRRSV的免疫抑制机理提供了实验依据。     

H9N2亚型流感病毒感染过程中神经介素B及受体对NF-κB信号通路泛素酶的调控

神经介素B(neuromedin B,NMB)及受体(NMB receptor, NMBR)通过NF-κB信号通路参与抑制甲型流感病毒(influenza A virus, IAV)H1N1亚型(IAV/H1N1)的感染。但关于NMB和NMBR对NF-κB信号通路相关泛素蛋白酶的调控如何，尚未见报道。为探究NMB和NMBR调控IAV诱导的NF-κB信号通路相关的泛素蛋白酶表达的影响，本研究基于IAV/H9N2感染sh-NMBR细胞与NMB刺激的A549细胞，采用RT-PCR、qRT-PCR及Western blot(WB)分析NMB和NMBR对H9N2感染引起的NF-κB信号通路相关的E3泛素连接酶Mind bomb-2(MIB2)和Ring Finger Protein 8(RNF8)及去泛素蛋白酶Cylindromatosis(CYLD)的表达变化。结果显示：H9N2感染sh-NMBR细胞中，RNF8和CYLD表达增加，MIB2表达和P65磷酸化水平降低；NMB激活A549细胞中NMBR的表达后，诱导细胞中RNF8和CYLD的表达水平下降，MIB2表达和P65磷酸化水平增加。结果表...