仔猪大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌的毒力研究

为了确定不同纤毛抗原的猪大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌引起试验动物发病的最小菌(毒)含量,用不同菌数的E.coliC83549(K88)、C83644(K99)和C83710(987P)菌株培养物对出生18～24h的仔猪进行攻毒,用不同毒素含量的C型产气荚膜梭菌毒素分别对出生18～24h的仔猪和家兔进行攻毒。结果表明,引起仔猪发病的大肠杆菌三种菌株的最低含量均为150×108CFU,C型产气荚膜梭菌引起1日龄仔猪和家兔发病的最低毒素含量分别75和80小鼠MLD。     

仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症病原诊断

1988年北京，河北发生一种急性死亡的新仔猪传染病，此后，疾病逐渐蔓延到国内其他地区，发生率与死亡率也日益增高，经对来自8个省市48个猪场179窝猪中死于此病的301头仔猪检查分离病原，获得207个分离菌株，经过鉴定，将其中141株鉴定为产气荚膜梭菌A型，另66株为C型，结合着流行病学情况，临床症状和病理学观察结果，肯定了此种疾病即是由产气荚膜梭菌A型和C型引起的一种仔猪肠毒血症。     

产气荚膜梭菌所致仔猪坏死性肠炎

产气荚膜梭菌所致仔猪坏死性肠炎吴雅玲，高其栋（青海省畜牧兽医科学院西宁，８１０００３）产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎ－ｇｅｎｓ）也称魏氏梭菌（ｃｌｏｓｔｒｄｉｕｍｗｅｌｃｈｉｉ），根据该菌产生４种主要毒素（α、β、ε、）的有无，把...     

A型产气荚膜梭菌致奶牛腹泻的诊断与防制

20 0 1年 8～ 9月 ,江苏某奶牛场奶牛陆续发生腹泻 ,采用氟哌酸治疗一段时间之后 ,收效甚微 ,因而怀疑为由产气荚膜梭菌所致的腹泻 ,遂对其进行了实验室诊断和药敏试验 ,并采取了相应的措施 ,取得了较好的效果。现将内容报告如下。1　病料采集与细菌分离从发病奶牛群中随机采集病牛新鲜排粪 1 2份 ,用灭菌生理盐水做 1∶ 1稀释后 ,用酪蛋白 -硫酸亚铁 -环丝氨酸琼脂 ( TSC,购自德国 Merck公司 )平板划线分离 ,置厌氧培养罐 (购自 Merck公司 ) 37℃培养 2 4 h,TSC琼脂平板上长出多量疑似菌落 ,菌落形态为圆形、突起、边缘整齐、表面湿润…     

A型产气荚膜梭菌小鼠感染模型的建立

近年来,我国许多牛场暴发产气荚膜梭菌病,同时产气荚膜梭菌病疫苗及其致病机制的研究不断深入.本试验以牛源A型产气荚膜梭菌强毒株C987株为基础,通过灌胃或皮下注射方式接种小鼠,记录其发病和死亡情况,并剖检观察小鼠内脏各器官病变及组织学变化,建立小鼠感染模型.结果表明,灌胃和皮下注射接种方式,A型产气荚膜梭菌对小鼠的半数致死量分别为4.35×109 CFU和8.0×106 CFU.感染小鼠腹部明显膨大,剖检内脏器官均出现明显病变,组织化学染色显示内脏器官大多出现淋巴细胞浸润及不同组织学变化.皮下注射方式在接种细菌数量、试验平行性、小鼠死亡率上均优于灌胃接种方式,因此皮下注射接种方式更适合作为A型产气荚膜梭菌小鼠感染模型的接种途径.本试验为牛A型产气荚膜梭菌疫苗的评价及其致病机制的研究提供了一种合适的动物模型.     

中药治疗梅花鹿产气荚膜梭菌感染

临床上,A型和C型产气荚膜梭菌感染报道较多,而本地梅花鹿肠毒血症是由 D 型产气荚膜梭菌引起,报道如下. 1 临床症状 患病梅花鹿身体比较健壮,最早死亡的无任何临床症状.病程稍长的病鹿精神沉郁,伏卧不起,食欲减少,鼻镜干燥,反刍停止;而后出现口、鼻流出泡沫状液体,有些病鹿口流大量黄色水样物;腹部膨大,腹痛不安,3～4 d内排水样稀粪,粪便带血或带有黄白色黏液.     

乳糖诱导剂对重组C型产气荚膜梭菌α毒素基因表达的影响

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含α毒素基因的重组质粒,用SDS—PAGE检测不同条件下α毒素基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pXETA02含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。结果表明,以乳糖诱导α毒素基因表达的优化条件为：培养基pH7．0,培养温度37℃,菌体生长密度D600达到1．0时分批添加0．5g／L乳糖,诱导5h,此时目的蛋白表达量为23％,实现了α毒素基因的高效表达。从而为C型产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

重组C型肉毒梭菌毒素的表达与免疫保护性分析

本研究旨在获得重组C型肉毒梭菌毒素蛋白,并评价其免疫保护性。将麦芽糖蛋白（MBP）和C型肉毒梭菌毒素重链C末端（CH_C）的编码基因序列进行优化和串联,获得基因片段GMBPCH_C。将GMBPCH_C克隆至pET28a-（＋）后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,分别在15和37℃两种温度条件下诱导表达。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的目的蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rMBPCH_C。将rMBPCH_C与Montanide ISA 201佐剂混合制备成疫苗,免疫4只家兔,剂量为100 μg/只。根据《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测一免后21 d及二免后14 d家兔血清的中和抗体效价。同时,在二免后14 d对家兔进行攻毒。结果表明,rMBPCH_C在37℃的诱导温度下,主要以包涵体的形式表达;在15℃的诱导温度下,可溶性表达的比例可达50%。一次免疫后,免疫组4只家兔血清对C型肉毒梭菌天然毒素（简称天然毒素）的中和效价均可达到1（0.1 mL血清中和1个小鼠最小致死量（MLD）的天然毒素）。二免后,家兔血清的中和抗体效价可达到4~8。用10个家兔MLD的天然毒素攻毒后,免疫组家兔得到了100%（4/4）的保护,而用1个家兔MLD的天然毒素攻毒后,对照组家兔100%（2/2）死亡。以上结果说明,rMBPCH_C具有良好的免疫原性,从而为C型肉毒梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体的基因克隆及核苷酸序列分析

应用 RT-PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 ( Mc Ab)的杂交瘤细胞 2 E3中 ,扩增出抗体 VH 和 VL 基因 ,用 linker( Gly4Ser) 3基因 ,将 VH 和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆至 p GEM-T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 72 6bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH 和VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 ( B)和轻链κ 家族     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的表达

将 2种抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 ( Sc Fv)基因 Sc Fv-2 E3和 Sc Fv-1 A8克隆至表达载体p UC1 1 9、p HOG2 1和 p ET2 0 b中 ,构建了重组质粒 p UC2 E3和 p UC1 A8、p HOG2 E3和 p HOG1 A8、p ET2 E3和 p ET1 A8后 ,分别转化至受体菌 JM1 0 5、JM1 0 9和 BL2 1 ( DE3 )中 ,得到重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)、JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)及 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 )( p ET1 A8)。 ELISA检测表明 ,经 IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)及 JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)的菌培养上清中 ,在重组菌株 BL 2 1 ( DE3 )( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的胞周质中检测到了 Sc Fv的存在。 SDS-PAGE和薄层扫描分析表明 ,重组菌株 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 0 .9%和 0 .7%,其大小约为 2 60 0 0 ,且表达的目的蛋白具有中和磷脂酶 C的活性。     

C、D型二价产气荚膜梭菌抗毒素血清的制备及保护效果评价

为治疗产气荚膜梭菌感染引起的疾病,研究制备了产气荚膜梭菌多价高效抗毒素血清。试验采用C、D型产气荚膜梭菌标准菌株,制备了高浓度外毒素和灭活疫苗,作为免疫原多次免疫绵羊,通过间接ELISA法监测绵羊抗体水平变化,采用小鼠中和试验检验绵羊抗毒素血清保护效果。结果表明:制备的高效价抗C、D型产气荚膜梭菌毒素血清每0.1 m L血清能中和400个C型毒素对小鼠的MLD和600个D型毒素MLD,有良好的应用前景。     

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906 bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54 ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。     

关中奶山羊源D型产气荚膜梭菌全基因组序列测定及其分子特征分析

本研究自陕西省富平县某规模化关中奶山羊养殖场腹泻奶山羊肛门拭子中分离到5株产气荚膜梭菌,命名为21-D-1~21-D-5。毒素基因检测表明,其均为携带etx的D型产气荚膜梭菌,且21-D-5携带食源性致病毒素基因cpe。全基因组序列测定显示,5株D型产气荚膜梭菌基因组大小、GC含量和基因数量稳定;单核苷酸多态性（SNPs）分析显示,21-D-1和21-D-2以及21-D-3和21-D-4之间的SNPs差异极低（<25）,表明其大概率属于相同的产气荚膜梭菌菌株。分离的D型产气荚膜梭菌基因组中共检测到15种毒素基因,其中,毒素基因etx在分离的D型菌株中高度保守、基因环境相似,且在菌株21-D-5中毒素基因cpe位于etx下游。此外,包括噁唑烷酮类耐药基因optrA在内的9种耐药基因也在分离株中被检测到,并且erm（A）、optrA和fexA具有共同传播的可能性。本研究为国内首次对D型产气荚膜梭菌进行全基因组序列测定分析,结果对产气荚膜梭菌疾病的防治和基因组的进一步研究具有参考价值。     

C型产气荚膜梭菌外毒素致小鼠肠道损伤的转录组分析

旨在探索产气荚膜梭菌外毒素造成机体炎性损伤及免疫调控紊乱的毒性机制,为产气荚膜梭菌病的致病机理研究提供理论基础。将C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2培养上清腹腔注射BALB/c小鼠,采集小肠样本进行转录组测序,筛选差异表达基因,并对其进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。结果显示,共获得40.99 Gb有效碱基,筛选后共得到795个差异表达基因,其中,229个基因表达上调,566个基因表达下调,对随机选取的10个基因进行q-PCR验证,其相对表达量与转录表达谱一致。GO功能注释主要涉及G蛋白偶联核苷酸受体活性和G蛋白偶联嘌呤核苷酸受体活性等。KEGG通路富集分析发现,主要富集在TNF信号通路、IL-17信号通路、p53信号通路、FOXO信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路等。产气荚膜梭菌外泌毒素侵入机体,会激活TNF等炎性信号通路,进而造成肠道发生炎性损伤甚至坏死。     

A型魏氏梭菌α毒素Asp-56基因定点突变与结构分析

为探索A型魏氏梭菌α毒素第56位天冬氨酸(Asp-56)对其生物学活性的影响,将α毒素Asp-56密码子(GAT)定点突变成甘氨酸(Gly-56)密码子(GGT),构建了含α毒素D56G突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G),该突变体蛋白表达量约为22.48%。α毒素和α毒素D56G突变体蛋白的二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成,两者的圆二色(CD)光谱检测有微小变化。生物学活性检测结果表明,α毒素D56G突变体蛋白失去了α毒素的磷脂酶C活性,且α毒素D56G突变体蛋白免疫的小鼠能够保护1MLD的A型魏氏梭菌标准株C57-1毒素攻击。此研究为进一步研究α毒素分子结构与生物学功能的关系奠定了基础。     

Prevalence,Molecular Characterization and Antimicrobial Resistance of Thermophilic <Emphasis Type="Italic">Campylobacter</Emphasis> Isolates from Cattle,Hens, Broilers and Broiler Meat in South-eastern Italy

Eleven cattle farms, 8 layer farms, 7 broiler farms and 30 broiler meat samples were investigated in south-eastern Italy throughout 2003 to evaluate the prevalence, the molecular type and antimicrobial resistance of thermophilic Campylobacters. A total of 398 samples were analysed. One Campylobacter isolate for each positive faecal swab and three isolates per positive broiler meat sample were selected for further analysis. Multiplex PCR was performed for species-level identification and PCR-RFLP of the flagellin A gene for genotyping. Resistance to 14 antimicrobials was studied in 188 Campylobacter isolates. Prevalence of campylobacters was high both on farms (100%) and in food samples (73%). On 4/11 cattle farms and on 10/15 poultry farms more than one species was isolated. The presence of more than one genotype was found on 8/11 cattle farms, on 10/15 poultry farms and in 8/22 Campylobacter-positive food samples. High rates of resistance to quinolone were observed: 9/31 (29%) C. jejuni bovine isolates, 4/22 (18%) C. jejuni poultry isolates, and 14/26 (54%) C. coli poultry isolates. Resistance to sulphamethoxazole-trimethoprim was also observed frequently: 18/26 (69%) of the avian C. coli strains, 25/31 (80%) of the C. jejuni strains isolated from poultry and 15/22 (68%) of those isolated from cattle were resistant. There was a significant difference between the rate of resistance to macrolides of C. coli and C. jejuni isolated in poultry, which amounted to 23% and 3%, respectively. This study provided data on the prevalence and antimicrobial resistance of thermophilic campylobacters in south-eastern Italy and confirmed that flaA-typing is an efficient tool to study the epidemiology of Campylobacter strains in short-term investigations.