怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因克隆和功能分析

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆该病毒增殖蛋白3基因,并进行序列分析、亚细胞定位、器官表达分析和功能分析.结果表明:怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因cDNA总长度为873 bp,G+C含量为44.22％;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3由29...     

怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

【目的】对怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因进行克隆和表达分析,为进一步揭示怀玉山三叶青黄酮醇合酶的生物学功能奠定基础。【方法】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的核心片段通过其转录组数据库进行筛选,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因利用逆转录PCR进行克隆,序列分析采用生物信息学进行分析,器官表达采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行比较。【结果】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因cDNA总长度为987 bp,G+C含量为47.92%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶由329个氨基酸组成,分子量37578.03 Da,理论等电点5.39,为亲水性蛋白;其二级结构中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲的比例分别占27.66%、21.88%和50.46%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶主要存在内质网中,在进化上与山甜菜（Nekemias grossedentata）、河岸葡萄（Vitis riparia）和葡萄（Vitis vinifera）的亲缘关系较近,尤其是与山甜菜（N.grossedentata）黄酮醇合酶在进化上具有最高的亲缘关系。qRT-PCR分析结果表明,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达在2个栽培种中存在器官特异性表达,怀玉2号在根中的相对表达量最高,怀玉1号在茎中的相对表达量最高。【结论】怀玉山三叶青黄酮醇合酶具有典型黄酮醇合酶的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,且怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达存在组织器官差异性。     

怀玉山三叶青TOM2B isoform X1基因克隆和功能分析

为揭示怀玉山三叶青TOM2B isoform X1(tobamovirus multiplication protein 2B isoform X1)的生物学功能提供理论依据,本研究通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青TOM2B isoform X1基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆了该基因,并采...     

月季RhD14基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】克隆月季独脚金内酯（SLs）信号应答底物受体即α/β折叠水解蛋白基因Dwarf 14(D14),对其进行亚细胞定位及表达分析,为探究该基因的生物学功能及其在SLs调控月季侧枝发生中的转导机制提供理论支持。【方法】以月季品种滇红为材料,克隆RhD14基因并进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在不同组织中的表达情况,利用烟草瞬时转化系统对RhD14基因编码蛋白进行亚细胞定位。【结果】克隆RhD14基因（GenBank登录号OP009358）cDNA序列1094 bp,包含完整的开放阅读框（ORF）,长度为1045 bp,编码347个氨基酸残基,蛋白分子式为C1738H2703N441O510S15,相对分子量为38.41 kD,理论等电点（pI）为5.71,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,且RhD14为无跨膜结构和信号肽的稳定蛋白,属于α/β水解酶家族,亚细胞定位于细胞质和细胞膜上。同源序列比对和系统发育进化树分析结果显示,RhD14蛋白的氨基酸序列与同属的古老月季品种月月粉RcD14(XP＿024283944.1)的相似性最高为98.05%,...     

油茶CoFAD2-1基因的克隆、亚细胞定位及组织表达

【目的】克隆油茶CoFAD2-1基因,并进行亚细胞定位和组织表达研究。【方法】采用CTAB法提取油茶4种组织中的总RNA;运用RT-PCR方法,设计基因特异性引物,从油茶未成熟胚中克隆CoFAD2-1基因;用生物信息学手段分析了CoFAD2-1基因的结构和进化关系;利用实时荧光定量PCR技术研究CoFAD2-1基因在不同组织的表达;同时运用烟草瞬时表达技术对该基因进行亚细胞定位分析。【结果】该基因编码区全长为1 149 bp,共编码382个氨基酸,具有FAD2基因家族保守的3个组氨酸簇。系统树分析显示该基因与种子特异表达的FAD2基因聚在一起,组织表达分析也表明CoFAD2在种子中特异表达,转化烟草叶片验证CoFAD2-1蛋白定位于内质网膜上。【结论】CoFAD2-1基因在种子中特异性表达,且定位在内质网膜上。     

高羊茅FaGST1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

[目的]克隆高羊茅谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因FaGST1,并进行亚细胞定位及表达分析,为深入研究该基因的抗逆分子调控提供理论依据.[方法]采用RT-PCR和RACE从高羊茅黔草1号中克隆FaGST1基因,对其进行生物信息学分析,构建植物融合表达载体pCAMBIA1300-FaGST1-GFP,通过农杆菌介导转入烟草叶片表皮细胞,观察FaGST1基因亚细胞定位情况,并利用实时荧光定量PCR检测高盐、高温、干旱及低氮胁迫处理下高羊茅叶片中该基因的表达情况.[结果]克隆获得FaGST1基因cDNA全长序列为1003 bp,开放阅读框(ORF)为681 bp,编码227个氨基酸残基,其编码蛋白的分子量约25.60 kD,理论等电点(pI)为5.58,亲水指数平均值-0.342,不稳定系数32.96,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核.FaGST1蛋白二级结构中,α-螺旋占50.44%,β-转角占5.75%,无规则卷曲占30.54%,延伸链占13.27%.FaGST1蛋白的保守结构区域为含有G位点的N末端结构域和含有H位点的C末端结构域.FaGST1蛋白与黑麦草GST蛋白(AMY26594.1)的氨基酸序列相似性最高,为93%,其次是海滨雀稗GST蛋白(AMN87043.1),为91%,与玉米(ACG39365.1)和小米(KQK86785.1)GST蛋白氨基酸序列相似性均在80%以上,与系统发育进化树分析结果基本相符,即FaGST1蛋白与黑麦草、海滨雀稗、玉米和小米等禾本科植物GST蛋白亲缘关系较近.高羊茅FaGST1基因在干旱、高温、高盐胁迫和低氮胁迫处理下均出现抑制表达.[结论]FaGST1基因负向调控高羊茅逆境胁迫响应.     

烟草扭脉病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

烟草丛顶病是近年来在云南省西部的保山、大理等各大烟区频繁爆发流行的一类新的烟草病害。Ｍｏ等认为云南发生的这类病害与津巴布韦发生的由幽影病毒属 (Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ)的烟草丛顶病毒 (Ｔｏｂａｃ ｃｏｂｕｓｈｙｔｏｐｖｉｒｕｓ,ＴＢＴＶ)引起的烟草丛顶病是同一种病。ＳＭＩＴＨ等认为烟草丛顶病由两种病毒———ＴＢＴＶ及黄症病毒科 (Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅ)的烟草扭脉病毒(ｔｏｂａｃｃｏｖｅｉｎ ｄｉｓｔｏｒｔｉｎｇｖｉｒｕｓ,ＴＶＤＶ)复合侵染引起。自然界幽影病毒属病毒主要依赖黄症病毒科病毒作为辅助病毒进行蚜…     

高羊茅FaFKF1基因克隆、亚细胞定位及节律表达分析

【目的】克隆高羊茅蓝光受体家族基因（FaFKF1）,分析其序列特征及亚细胞定位,并检测其在不同光照处理下的节律表达特征,为探索其在成花中的调控机制及高羊茅光周期适应性育种提供理论依据。【方法】采用RACE方法克隆FaFKF1基因cDNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并构建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白亚细胞定位情况。同时,利用实时荧光定量PCR检测FaFKF1基因不同光照处理和不同生长阶段的节律表达特征。【结果】克隆获得FaFKF1基因cDNA全长为2266 bp,开放阅读框（ORF）为1881 bp,编码626个氨基酸残基,蛋白分子量为68.89 kD,理论等电点（pI）为5.76,脂肪系数为80.99,不稳定指数为39.81,属于较稳定的亲水性蛋白,亚细胞定位于细胞核。FaFKF1蛋白的二级结构包含α-螺旋（24.92%）,无规则卷曲（44.89%）、延伸链（23.16%）和β-转角（7.03%）。FaFKF1蛋白与大豆（NP_001235886.2）、大麦（KAE8795993.1）和二穗短柄草（XP_003577479.1）的氨基酸序列相似性较高,为79.50%~87.68%,且与二穗短柄草FKF1蛋白的亲缘关系最近,其次是大麦和小麦。长日照处理下,FaFKF1基因在苗期、分蘖期、孕穗期和抽穗期的叶片中均有表达,相对表达量变化趋势也较相似,均在ZT8时（即下午16:00）达最高峰,呈现出24 h的昼夜节律,但在孕穗期和抽穗期的相对表达量明显较高。在长日照和短日照基础上施加不同光照处理下,FaFKF1基因均能通过自身调节来适应环境的变化,虽然表达峰出现时间不一致,但整体上能维持24 h的昼夜节律。【结论】FaFKF1基因在细胞核发挥作用,且在不同光照下均呈现节律表达,受光周期的诱导调控。     

枣ZjWRKY22基因克隆、亚细胞定位及表达载体构建

WRKY是植物特有的锌指型转录调控因子,参与调控植物抗逆、生长发育和新陈代谢。为探索易裂品种壶瓶枣WRKY转录因子ZjWRKY22的生物学功能,同时为揭示枣WRKY响应非生物胁迫的分子机制提供理论基础,对克隆ZjWRKY22基因编码区序列进行生物信息学预测,并对枣吊、茎、叶、花、果实进行差异表达分析。结果表明,从壶瓶枣中克隆得到ZjWRKY22基因CDS序列长1 068 bp,共编码335个氨基酸,分子质量约为38.9 ku,等电点为5.92,分子式为C₁₆₈₂H₂₅₈₂N₄₇₂O₅₆₈S₁₃;该蛋白中丝氨酸最多,占18%,为亲水不稳定蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,含有76个磷酸化位点;二级结构类型以无规则卷曲为主,该基因具有典型的WRKY结构域,三级结构预测主要由4个β-折叠组成,分别为WRKYGQK、RGYYR、RKQVER、FIVTYT;属于WRKY家族Ⅱe组。同源序列比对显示,枣与杨梅、桃、扁桃、梅的同源性分别为75.86%、74.88%、74.41%和74.88%,系...     

立体栽培模式对三叶青植株生长的影响

[目的]研究立体栽培对三叶青植株生长的影响。[方法]针对三叶青大田平作栽培生长后期茎蔓匍匐在地、重叠郁蔽严重,导致位于下层的茎叶提前衰败死亡而严重影响生长的问题,借鉴立体农业的栽培技术原理,设计立体、平作等栽培模式试验,研究采用立体栽培技术对三叶青的生长效应。[结果]采用立体限根栽培技术能有效改善三叶青田间通风、透气、透光条件,显著提高植株抗病性,降低根腐病发病率,减少死苗率,提高三叶青地下块根产量和品质。[结论]立体限根栽培对降低三叶青病害、提高植株生长、提高单株产量具有很好的促进效果。     

三叶青种质资源遗传多样性的随机扩增多态性DNA分析

利用RAPD技术对64个三叶青种质资源样本进行遗传多样性分析,从40对引物中筛选出10对引物进行批量PCR实验。结果表明:64个三叶青样本的观测等位基因数(Na)为1.666 7~2.000 0,有效等位基因数(Ne)为1.247 9~1.701 3,Nei's基因多样性指数为0.167 0~0.398 4,Shannon多样性指数(I)为0.262 8~0.583 0,平均多态位点为7.5,平均多态百分数为93.145%;在遗传相似系数0.720 56处,可以将64个三叶青样本分成11大类;在遗传相似系数0.697 04处,则可将64个三叶青样本分成4大类;聚类分析的结果与种源的地理距离存在不一致性,这可能与种质资源库的地形、气候等自然因素有关。表明所测三叶青种质资源遗传多样性丰富,具有一定的开发利用价值,可为合理保护三叶青的基因资源及其遗传改良提供科学依据。     

不同光照强度对林下栽培三叶青块根产量及总黄酮含量的影响

[目的]提高林下栽培三叶青单株块根产量和总黄酮含量。[方法]选择光照强度差异较大的5个地块,研究不同光照强度对林下栽培三叶青块根产量和总黄酮含量的影响。[结果]林下栽培三叶青随着光照强度的增强,三叶青单株块根产量明显提高,块根中总黄酮含量随着光照强度的增强而增加。[结论]建议种植地光照强度在2 000 lx以上,三叶青块根产量和总黄酮含量较高。     

水稻OsSsr1基因的生物信息学分析、亚细胞定位及其表达模式

为了探明盐敏感相关基因[OsSsr1（Oryza sativa L.salt-sensitive related gene 1,GenBank登录号为NM₀01065574）]的亚细胞定位及在水稻不同组织和各种逆境胁迫下的表达模式,通过生物信息学手段、洋葱表皮亚细胞定位、RiceXPro数据库和Real-time PCR对其进行研究。序列分析表明OsSsr1的开放阅读框为2 004 bp,编码一个由667个氨基酸组成并含有5个跨膜区的蛋白质,该蛋白质N端含有一个信号肽;其启动子序列包含TGACG-motif、ABRE、TCA-element和W box等多个与逆境相关的顺式作用元件。GFP融合表达显示,OsSSR1蛋白质定位于细胞膜。RiceXPro数据库中数据分析表明,OsSsr1基因在水稻不同发育期的不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,胚中的表达量最低。Real-time PCR结果表明,OsSsr1表达水平受干旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌、MeJA和ABA的诱导上调。这些结果显示,OsSsr1基因可能在水稻胁迫反应中发挥重要作用。     

马铃薯StDWF1基因克隆及表达分析

DWF1是油菜素内酯(BR)生物合成途径中的关键基因。为探索StDWF1在马铃薯生长发育中的功能,本实验以马铃薯品种费乌瑞它(Favorita)试管苗为材料,克隆StDWF1基因全长序列,开放阅读框(ORF)为1 704 bp,编码567个氨基酸,蛋白质相对分子质量为66.08 ku,理论等电点为7.96。利用农杆菌介导法在烟草中瞬时表达StDWF1,共聚焦显微镜观察显示StDWF1定位于细胞质。荧光定量分析表明,嫩叶中StDWF1表达量最高,其次是老叶、匍匐茎、主根、茎、块茎。对马铃薯生育期叶片StDWF1表达量进行分析,结果表明在出苗期表达量最高。本实验结果为进一步阐释BR对马铃薯生长发育的调控机制奠定理论基础。     

番茄 SlMAPK7基因的亚细胞定位与组织表达特性

分离番茄 SlMA PK7基因,利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应技术分析在番茄不同组织和花发育不同时期 SlMA PK7的表达特性,发现该基因在雄蕊的表达量明显高于其他组织,在长度4.6～6.5 mm 的花蕾中表达量最高;通过构建黄色荧光蛋白融合表达载体,利用基因枪介导洋葱内表皮细胞的瞬时表达,发现SlMA PK7基因表达蛋白定位在细胞核和细胞膜中;为进一步研究 SlMA PK7的表达特性,分离克隆了SlMA PK7基因的启动子序列,利用 PLACE 和 PlantCARE 软件预测出其含有多种典型的 SlMA PK 启动子顺式作用元件;通过瞬时表达分析该启动子活性,经农杆菌介导转化拟南芥,GUS(β‐glucuronidase ,β‐葡萄糖苷酶)组织化学染色发现,在幼苗期 SlMA PK7主要集中在顶端分生组织和根尖分生组织中表达,在成年植株中则集中在花器官中表达.以上结果表明,SlMA PK7可能在细胞核和细胞膜中参与番茄多种信号的传导,并可能在花器官的发育过程中行使功能.     

紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。     

小麦病程相关蛋白1基因的亚细胞定位及信号肽鉴定

前期研究克隆获得了一个叶锈菌诱导的小麦病程相关蛋白1基因TaLr35PR1,明确了其基因结构和表达特征。本研究首先预测TaLr35PR1的信号肽和亚细胞定位情况,进而通过试验予以佐证。将信号肽编码的核酸序列克隆、连接到酵母信号肽诱捕载体pSUC2T7M13ORI上,并转化到酵母蔗糖酶缺陷菌株YTK12中,明确了TaLr35PR1基因的信号肽具有分泌功能。同时,利用酶切连接的方法成功构建亚细胞定位重组体pCamA-TaLr35PR1-GFP,利用基因枪轰击技术瞬时转化洋葱表皮细胞。结果表明,pCamA-TaLr35PR1-GFP融合蛋白主要在细胞外表达,与亚细胞定位预测的结果一致。这些研究结果丰富了小麦病程相关蛋白1基因的研究内容,为进一步探索该类基因的生物学功能及其作用机制提供了研究基础。     

Gene cloning and expression analyses of WBC genes in the developing grapevine seeds

White-brown complex (WBC) transporters, also called half-size ATP binding cassette G (ABCG) transporters, are involved in many biological processes, including seed development; however, the WBC transporters in grapevines received less attention to date. To reveal the molecular characteristics of WBCs and the connection between WBCs and agronomic traits of stenospermocarpic (seedless) grapevine, we carried out a genomic census and analysis of ovule-associated expression for VvWBC genes in grapevine. We identified 30 VvWBC genes and cloned full-length complementary DNAs (cDNAs) for 20 of these. The tissue or organ-specific expression analysis showed that several VvWBCs exhibited distinct expression patterns with some showing tissue specificity. Twelve VvWBC genes were found to be expressed in the developing ovules. Moreover, the results of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) suggested that four of twelve ovule-expressed VvWBCs have distinct expression profiles during the development of ovules between seeded and stenospermocarpic grapevines. These four genes might be involved in ovule abortion. Meanwhile, chromosome mapping, multiple sequence alignments, exon/intron structure analyses and synteny analyses were preformed on VvWBC genes. Our experiments provide a new perspective on the mechanism of stenospermocarpic seedlessness and put forward a framework for further study of WBC transporters.     

苹果砧木山定子MbNas1的克隆、表达与亚细胞定位

以苹果砧木山定子(Malus baccata)为试材,根据小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)中克隆得到的尼克烟酰胺合成酶基因Mx Nas1(登录号:DQ403256)的全长序列设计特异引物,通过RT-PCR方法从山定子c DNA中克隆到Nas1基因并命名为Mb Nas1,该基因全长为978 bp。预测该基因可编码325个氨基酸,理论等电点为5.26,相对分子质量为36.09 ku。Real-time PCR结果表明,正常供铁(EDTA-Na Fe,40μmol/L)时,该基因在山定子水培苗的新叶、老叶、根、茎的韧皮部中均有表达,在木质部表达量较低;缺铁处理(4μmol/L)时,该基因在根和新叶中的表达加强,第6天达到最高值,之后开始下降;在老叶中表达逐渐减弱;高铁处理(160μmol/L)时,该基因在根和新叶中的表达减弱,在第9天达到最小值,之后有所上升;在老叶中表达逐渐增强。基因枪亚细胞定位试验表明,Mb Nas1蛋白质定位在细胞质膜上。