山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究对2003年广西部分地区山羊群发生的疑似山羊痘进行了病毒分离鉴定及生物特性的研究。取疑似山羊痘病羊的皮肤丘疹、水泡或脓泡组织的病毒悬液，接种初生羔羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变，免疫荧光试验结果显示，病毒能与山羊痘标准阳性血清反应，在感染的细胞浆内发出特异性的黄绿色荧光。病毒悬液接种乳鼠、小鼠、豚鼠、兔子都未发病，而接种3月龄山羊则出现典型的山羊痘症状和病理变化，接种9～10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，未见出现痘斑，连传3代，均无异常变化。通过病理组织学观察可以看到在细胞浆内有大小不一圆形或椭圆形的包涵体，在电子显微镜下可以观察到150nm～300nm大小，卵圆形、砖形，有囊膜的病毒颗粒。利用一对山羊痘病毒P32基因引物进行了PCR扩增，将所得序列与GenBank收录的5株山羊痘病毒P32基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析。结果与疫苗株的同源性分别为99．8％和99．4％。与国外其它毒株的同源性为99．6％和98、8％～99．4％。研究结果表明，所分离的病毒为山羊痘病毒，在生物学特性上与资料记载存在一定的差异，P32基因与疫苗毒和国外毒株之间同源性非常高。将该毒株命名为山羊痘病毒LiuJiang／2003株。     

恶性型山羊痘的诊断和防治报告

保定地区曲阳县虎山村的山羊在口唇、头颈、腹背等处皮肤广泛发生一种以痘样疹为特征的传染病,发病迅猛,羔羊和幼羊病、死亡率极高。根据流行病学、临床症状、病理剖检和实验室鉴别诊断结果,证实为山羊痘。报告如下。一、流行病学调查1986年11月,在三     

山羊痘间接免疫荧光检测方法的建立

山羊痘是由山羊痘病毒引起的以发热、呼吸困难、流黏液性或脓性鼻液及皮肤黏膜出现痘疹为特征的高度接触性传染病,是严重危害山羊生产的疫病之一。试验旨在建立一种简便快捷、特异性、敏感性、稳定性和重复性良好的间接免疫荧光方法,为山羊痘的监测和诊断提供可靠的依据。1材料与方法1.1材料山羊痘病毒,已确诊为山羊痘的广西柳江疫区的发病山羊皮肤痘组织;山羊痘标准阳性血清,购自中国兽医生物药品监察所;兔抗羊IgG荧光二抗,购自上海生物制品研究所;初生羔羊睾丸细胞,自制;83份临床待检血清;2~3月龄健康未免疫山羊,购于广西马山县,山羊痘检…     

感染细胞与痘疹样本中山羊痘病毒PCR检测方法的建立

比较Trizol法和SDS-蛋白酶K法提取山羊痘病毒DNA后,根据山羊痘病毒P32基因设计引物,建立了能检测感染细胞培养物与组织病料的PCR方法,结果显示以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量与纯度上均明显高于Trizol法;该PCR方法对山羊痘标准毒株细胞感染物能扩增出特异性的DNA条带,最小检出量为40.625ng;且能检出山羊痘疫苗毒Y株、贵州现场分离毒LD株和QL株的细胞感染物以及山羊痘疹样本中病毒DNA,而对鸡痘疫苗毒株感染细胞、正常细胞及正常山羊皮肤均为阴性反应。这些结果表明,建立的PCR方法具有特异性强、可靠性好、灵敏度高等特点,可用于山羊痘的临床诊断。     

山羊痘病的诊断与防制

山羊痘是山羊痘病毒感染山羊所致的一种急性、热性、接触性传染病。该病毒可随呼吸道分泌物、痘疱渗出液、脓汁、脱落的上皮和痂皮排出 ,经呼吸道和损伤的皮肤粘膜感染。传播快、发病率高 ,只感染山羊 ,羔羊较成年羊易感。临床上以山羊皮肤、口角、腹侧和粘膜上发生蔷薇疹和疮疱为特征。2 0 0 1年秋季 ,我省部分地区暴发此病 ,具体情况报道如下。1　发病情况2 0 0 1年 10月上旬 ,句容某村有 4个养羊户 ,共养山羊 70余只 ,5ｄ内有 48只山羊发生痘病 ,14只死亡 ;9月到 10月 ,泗洪县各乡镇均有山羊痘病发生 ,其中某农场一养羊户养羊180余只 ,先…     

山羊痘病毒NM株的分离鉴定

从内蒙古牛场疑似山羊痘病毒感染的病羊中分离到1株病毒,命名为NM株。取病羊的皮肤痘疹和水疱作病料样品,分别接种BHK-21传代细胞和10日龄SPF鸡胚。结果表明,BHK-21细胞出现了明显的、规律的细胞病变,鸡胚接种部位出现了明显的痘斑;NM株细胞毒和胚毒均能够被山羊痘病毒阳性血清所抑制。利用1对山羊痘病毒特异性检测引物对NM株病毒进行PCR扩增,获得445 bp片段,与预期大小一致。将扩增产物提纯后克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定正确后,对阳性克隆株进行序列测定,结果表明,NM株的基因片段与已发表的山羊痘病毒毒株的相应基因片段具有高度同源性,同源性在99.2%~100%之间。     

江苏地区2株山羊痘病毒的分离与鉴定

为对江苏部分地区羊场羊痘病毒进行有效的监测和防控,及时了解病毒遗传进化趋势,降低规模化养羊业的风险,本研究从江苏部分地区养羊场采集疑似羊痘病羊的皮肤丘疹、水疱或脓疱组织病料样品,分别接种9日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜、胎羊睾丸细胞(LT)和牛肾细胞(MDBK),观察鸡胚病变和细胞病变情况。同时通过PCR方法扩增羊痘病毒p32基因进行序列分析,并进行p32基因限制性片段长度多态性分析。结果显示,接种鸡胚绒毛尿囊膜形成典型的痘斑,胚体出血;系统进化分析显示,两株分离株属于山羊痘病毒(GTPV);限制性片段长度多态性分析结果也显示符合GTPV的特征。本研究所分离到的2株GTPV,为当地制定山羊痘的防控策略提供依据。     

绵羊痘病毒PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒(CaPV)P32和ITR基因序列,设计合成了2对引物,建立了不同基因片段检测羊痘病毒核酸的PCR方法。结果表明针对2种基因的PCR方法敏感性较高,最小DNA检出量分别为20.15 ng(P32)和25.80 pg(ITR);扩增禽痘疫苗毒株、羊口疮病毒细胞培养物、口蹄疫病毒细胞培养物,结果均为阴性,特异性较强。扩增产物进行序列分析,与GenBank收录的其他株病毒P32核苷酸同源性为99.5%～99.9%,与ITR基因同源性为98.3%～100%。本方法为羊痘的快速诊断提供了可靠、简便的检测技术。     

重庆地区山羊痘病毒分离鉴定及其动物模型构建

该研究旨在对重庆地区一疑似山羊痘病病例进行病原分离鉴定,并构建动物模型,分析其致病性。利用临床诊断与实验室诊断技术,对山羊痘进行鉴定,并利用BHK21细胞对山羊痘病毒进行分离纯化,将纯化到的毒株人工感染3月龄羔羊,构建动物模型,分析羔羊发病情况。分子鉴定结果表明:PCR扩增出了山羊痘病毒P32基因特异性条带,经测序共815 bp,该序列在NCBI中经BLAST比对与山羊痘病毒(NCBI登录号:AY880717.1)的同源性最高(99%),且在系统进化发育树中也与其聚为一簇;细胞培养结果表明,在接种72 h后,细胞出现变圆、聚集和脱落的现象;攻毒结果显示,实验组羊只体温升高(42℃),第7天在唇部和尾根部出现红色丘疹和水泡,第15天唇部出现褐色结痂。该研究为山羊痘的防治和致病机理研究奠定了基础,也为山羊痘地方株疫苗研究提供了理论依据。     

山羊痘病毒属病毒检测技术研究进展

山羊痘病毒属包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛结节疹病毒,分别引起山羊痘、绵羊痘和牛结节疹,感染动物发热、局部或全身出现丘疹或结节,损坏皮张,产乳量下降,造成严重经济损失并具有重要的公共卫生意义。文章就近年来国内外对该类病毒在病原学、血清学、分子生物学等方面的检测技术与方法进行综述,以促进对羊痘病毒检测技术的进一步研究和发展。     

山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达与细胞凋亡的相关性

以贵州本地分离纯化的山羊痘病毒为试验材料,感染Vero细胞,通过台盼蓝、吖啶橙/溴乙锭荧光染色分析细胞的死亡及凋亡比例;经特异性PCR从山羊痘病毒基因组中分离出山羊痘病毒抗凋亡蛋白样基因,基因长531bp,含有完整的编码框,与绵羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的相似性为97%,因此确定为山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因。进一步研究山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因在Vero细胞中的表达,结果显示,病毒感染Vero细胞24h时没有检测到凋亡现象,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的mRNA水平最高;感染48h时,Vero细胞的凋亡率上升到13%,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量随之下降。结果表明,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量与Vero细胞的凋亡呈负相关,有助于病毒在细胞内的生存和侵染等过程。     

羊口疮病毒内蒙古株的分离与初步鉴定

[目的] 确定内蒙古地区规模化养殖场发生的疑似羊口疮的病原。[方法] 无菌采集疑似羊口疮病料7份,经剪碎、研磨、离心等处理后接种山羊皮肤成纤维细胞（goat skin fibroblasts,GSFs）培养;对分离到的病毒毒株进行电镜观察;利用B2L基因引物进行特异性PCR鉴定,对获得的B2L基因序列测序,构建系统发育树,并进行同源性分析。[结果] 3份病料经GSFs培养48 h后出现明显病变,分离的病毒经负染后在电镜下观察呈卵圆形,病毒粒子长220~250 nm,宽125~200 nm,符合羊口疮病毒（orf virus,ORFV）粒子的形态特征,并将其命名为NM-ORFV-1株、NM-ORFV-2株、NM-ORFV-3株。分离株经B2L基因PCR鉴定获得1 137 bp的扩增产物,与预期一致;系统发育树及同源性分析显示,NM-ORFV-2株与NM-ORFV-3株遗传关系密切,处于同一分支,且与ORFV KP336704（中国）分离株的亲缘关系最近,同源性达到99.4%;NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株及NM-ORFV-3株处于不同分支,NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株的同源性为99.1%,与NM-ORFV-3株的同源性为99.0%,且与ORFV JQ904789（中国）疫苗株亲缘关系最近,同源性为99.6%。[结论] 内蒙古地区规模化养殖场疑似羊口疮病例的病原是ORFV。     

戈壁草原蒙古羊春季羔羊铜缺乏症的研究

[目的] 确定内蒙古苏尼特左旗北部地区春季发生的戈壁草原蒙古羊羔羊发病、死亡现象的主要原因。[方法] 选取3户羔羊发病情况最为严重的牧户采样,每户各采集5只发病羔羊的血液样本、放牧草场的饮用水样本,以及羔羊所处环境中3种主要牧草（红砂、珍珠猪毛菜和盐爪爪）样本和土壤样本,同时采集当地种羊场15只相同品种健康羔羊的样本作为对照,测定上述样本中的10种矿物质元素（钙、磷、铁、锰、铜、锌、镁、钼、硒、钴）的含量。[结果] 发病羔羊血液中铜和镁的含量显著（P<0.05）低于同品种健康羔羊,钼的含量显著（P<0.05）高于同品种健康羔羊,其他矿物质元素的含量差异不显著（P>0.05）。发病羔羊所处环境中饮用水的镁和钙含量较高。发病羔羊所处环境中红砂的钼、铁、锰和硒含量均高于文献报道值,其他矿物质元素含量均处于正常范围;盐爪爪的钼、铁、锰、硒、镁和钴的含量高于文献报道值,其他矿物质元素含量均处于正常范围;珍珠猪毛菜、红砂和盐爪爪的铜钼比分别为15.96∶1、0.23∶1和2.34∶1。发病羔羊所处环境中土壤样本的铜、铁、锰、硒、钴含量均低于文献报道值,镁、钙和磷含量均高于文献报道值,钼和锌含量在正常范围内。[结论] 该地区戈壁草原蒙古羊羔羊发病、死亡的原因主要是放牧羊摄入铜不足、钼超标、铁和锰等矿物质元素摄入量过多,导致羔羊对铜的吸收发生障碍,最终引起继发性铜缺乏症。     

山羊痘继发细菌感染病例诊断

采用细菌学方法与分子生物学技术对疑似山羊痘猝死山羊进行病原学检测。结果:以GPV ITR基因特异性引物从皮肤、肠黏膜、蹄部痘疹中均扩增到289 bp目的条带,并从肝脏中分离到1株革兰氏阳性杆菌,经生化鉴定为产气荚膜梭菌,其表现较强耐药性。由试验结果初步判断,该病例为山羊痘病毒(GPV)继发产气荚膜梭菌感染所致。猝死山羊病因的确定性诊断,将对山羊养殖场切断病原传播,预防健康山羊发病提供技术支持。     

贵州省山羊流产的病原学鉴定

为了解贵州省山羊流产与山羊痘的相关性,采用琼脂扩散试验和PCR法对本省10个市(县)流产羊群的血清和病料样本进行山羊痘抗原抗体及病原核酸检测,同时血清进行布氏杆菌抗体检测,流产胎儿病料进行羊流产亲衣原体病原核酸检测。结果发现山羊痘羊群流产率达37.1%(4329/11660),山羊痘血清抗体阳性率为38.2%(34/89),抗原阳性率为72.7%(32/44),流产胎儿山羊痘病毒核酸检出率为83.3%(10/12),发病羊群未检出布氏杆菌和羊流产亲衣原体感染。结果表明,山羊流产与山羊痘感染有一定关系,提示在山羊养殖中应加强饲养管理,防止山羊痘感染引起孕羊流产。     

Infection of two goatherds with Mycoplasma mycoides subsp. capri in Hungary,evidence of a possible faecal excretion

During epidemic outbreaks in two goatherds clinical symptoms and deaths occurred in five (14%) of the 3-week-old goat kids in farm A, and in six (33%) of those in farm B. In the latter farm, three female goats aborted before the clinical symptoms in the kids emerged. Mycoplasma could be isolated from both healthy and sick goat kids and from female goats, which had diseased kids or had aborted. Three goat kids (one from herd A and two from herd B) were sent for post-mortem examination. In all these cases septicaemia caused by Mycoplasma was diagnosed. Based on the bacteriological examination the Mycoplasma strains proved to be Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc). This was confirmed by the PCR examination. Mmc was isolated from several locations including from the rectum of one healthy female goat, and from two diseased kids. In addition, bacteria were detected in the small intestine in two of the necropsied kids by bacteriological and/or immunohistochemical methods. The finding suggests that Mmc may be transmitted via faeces in goatherds, kept under conventional conditions.     

动物组织中GLUD1基因表达与GDH蛋白结构分析

[目的]研究动物不同组织中GLUD1基因的表达情况,比较不同物种中GDH蛋白的结构差异,明晰GLUD1基因的表达模式与GDH蛋白的功能。[方法]分别采集大鼠、绵羊、梅花鹿的肝脏、肾脏、皮肤、脂肪和肌肉5种新鲜组织样品。以β-actin为内参基因,采用荧光定量PCR法（qRT-PCR）分析3种动物不同组织中GLUD1基因的表达情况;利用无重复双因素分析方法表征GLUD1基因在不同组织中的表达量差异。比较人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛和猪7个物种GDH蛋白氨基酸序列,模拟这7个物种的GDH蛋白三维空间结构。[结果]GLUD1基因在大鼠、绵羊和梅花鹿的5个组织中均有表达,在肝脏中的表达量均高于其他组织;该基因在大鼠和梅花鹿肝脏组织中的表达量极显著（P<0.01）高于绵羊肝脏组织中的表达量,在大鼠肾脏组织中的表达量极显著（P<0.01）高于梅花鹿肾脏组织中的表达量。人GDH蛋白的氨基酸序列与猪、牛、山羊和绵羊的序列相似度较高,而大鼠与小鼠GDH蛋白的氨基酸序列相似度达到99.10%。大鼠、人、猪的GDH蛋白氨基酸序列中分别存在2个（第8位丙氨酸→缬氨酸、第40位丙氨酸→缬氨酸）、1个（第23位丙氨酸→丝氨酸）、2个（第33位丙氨酸→苏氨酸、第39位丙氨酸→苏氨酸）物种特异性突变位点。小鼠、大鼠、人的GDH蛋白预测为三聚体结构,山羊、绵羊、牛和猪的GDH蛋白预测为同源六聚体结构。[结论]GLUD1基因在大鼠、绵羊、梅花鹿不同组织中的表达量存在差异,在肝脏中都有较高水平的表达。不同物种GDH蛋白的氨基酸序列相似度较高,但依旧存在一定的序列差异性,并且存在数个对应物种特异性的氨基酸突变位点。     

内蒙古锡林郭勒盟犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性试验

[目的] 确定内蒙古锡林郭勒盟多伦县某养殖场犊牛腹泻的致病菌,为选择敏感药物治疗该病提供依据。[方法] 无菌采集腹泻犊牛肛拭子进行细菌培养鉴定、致病性试验及体外药物敏感试验。[结果] 肛拭子经培养后的菌落形态一致,经表型鉴定、生理生化鉴定及16S rDNA鉴定确定分离菌为大肠杆菌;大肠杆菌分型引物鉴定分离菌株为ETEC型;且分离菌株可致小鼠死亡;分离菌株对氨苄西林、氨曲南、头孢唑啉、四环素、氧氟沙星、左氧氟沙星、复方新诺明等21种药物表现为耐药,对头孢哌酮、头孢曲松、克林霉素、多黏菌素B、米诺环素等10种药物表现为中度敏感,对头孢西丁、万古霉素、环丙沙星及呋喃妥因4种药物表现为敏感。[结论] 该养殖场的犊牛腹泻是由大肠杆菌ETEC型所致,临床治疗过程中可使用环丙沙星。     

规模化驴场中马流感病毒H3N8亚型感染情况调查

[目的]调查山东省聊城市规模化驴场中马流感病毒的感染情况,并分析其可能的来源。[方法]从聊城的规模化驴场采集病料和血清,通过HI试验检测驴血清中的马流感病毒H3N8亚型抗体的阳性率。使用RT-PCR技术扩增肺脏和鼻腔棉拭子样品中的马流感病毒M基因,对获得的马流感病毒M基因与不同流感病毒的M基因进行序列比对,推测其来源。[结果]HI试验表明,120个血清样品中马流感病毒H3N8亚型血清抗体阳性率为33.3%(40/120);其中,母驴的马流感病毒H3N8亚型血清抗体阳性率为42.5%(17/40)、公驴为32.5%(13/40)、驴驹为25.0%(10/40)。通过RT-PCR检测发现,32.3%(21/65)的样品可测出目的条带。通过序列比对得出,该试验获得的流感病毒M基因与马属动物的H3N8亚型流感病毒高度同源(CY032222、CY032318、CY028821等),同源性最高可达99.8%。[结论]马流感病毒在聊城周边的数个规模化养驴场发生流行。该研究从驴体内分离的流感病毒M基因属于马流感病毒H3N8亚型M基因。