哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立

 【目的】哈密瓜细菌性果斑病在中国为新发生的病害，其病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. Citrulli），危害瓜果造成品质下降。该病为典型的种传细菌性病害，因此种子检疫成为防治此病害的重要手段。【方法】通过实验，将生物学、免疫学和分子生物学检测技术有机结合，建立了一套针对哈密瓜果斑病的种子带菌检测方法Bio-IMS-Real-time PCR。【结果】经过人工模拟种子带菌检测实验，结果表明该方法可成功地检测出1 000粒种子中的1粒带菌种子（带菌量约为1.04×105 CFU/种子，经计算，可以检测的最初浓度为2 CFU•ml-1 ASCM培养液），且信号较强。【结论】该检测方法的建立，大大提高了对哈密瓜细菌性果斑病菌检测的精度，也为生产实践中哈密瓜果斑病的防治提供了重要的技术支持。     

巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌

【目的】建立nested-PCR方法,快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli,Aac）,为西瓜细菌性果斑病（bacterial fruit blotch of watermelon,WFB）的防控提供技术支持。【方法】 根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,以5 µL样品处理液于99℃高温裂解10 min,再放置冰上冷却5 min,以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增,采用50 μL反应体系：5 μL 10×PCR buffer（25 mmol?L-1 MgCl2）,4 μL dNTP （D4030RA,2.5 mmol?L-1）,引物（5 μmol?L-1）各3 μL,0.4 μL Taq DNA酶（DR001B,5 U?μL-1）,通过退火温度优化,反应条件为：引物BX-L1/BX-R5各3 μL进行第一轮扩增,95℃,2 min;95℃,30 s;65℃,45s;72℃,1 min;35个循环;72℃,延伸7 min;取扩增后的产物1 μL为模板,以引物BX-L1/BX-S-R2各3 μL进行第二轮扩增,95℃,2 min;95℃,30 s,66℃,45 s,72℃,1 min,30个循环,72℃,7 min。在此条件下对梯度Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液进行特异性、灵敏性及重复性检验,对不同带菌率的西瓜种子提取液进行检测。【结果】引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2在检测不同来源的Aac菌株时都产生了预期大小的片段,并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种（A. avenae subsp. cattleyae）、魔芋假单胞菌（A. avenae subsp. konjaci）及其不相关菌株未扩增出目标片段。以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,对Aac纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测限4.7×101 cfu/mL,比direct-PCR灵敏度高出1 000倍。当西瓜种子带菌率在0.1%-0.5%时,nested-PCR阳性检测率为66.7%;当种子带菌率为1%-10%时,nested-PCR的阳性检测率为83%-100%。【结论】以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR方法,能够快速、高效检测携带微量Aac的西瓜种子,检测结果重现性高。     

西瓜细菌性果斑病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

根据西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）与相关细菌16SrDNA序列差异，设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac—probe，利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号，其它细菌无荧光增强信号。该方法特异性强，灵敏度高，重复性好，可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。     

甜瓜细菌性果斑病菌检测技术研究进展

综述了近年来甜瓜细菌性果斑病害检测技术的研究进展,强调了检测技术的发展对我国入世以后植物病害检测检疫的重大意义。     

甜瓜种子细菌性果斑病菌PCR检测方法的研究

以携带细菌性果斑病菌(Acidovoras avenae subsp. citrulli)的甜瓜种子为材料,比较了不同引物、不同种子处理方式、不同浸提液及不同提取时间对细菌性果斑病菌PCR及实时荧光定量PCR检测结果的影响。结果表明:以完整带菌种子浸提液为模板进行PCR扩增,操作最简单且特异条带亮度最高,种壳+种仁处理次之,而以磨碎种子浸提液为模板,未能扩增出特异条带。以无菌水作为浸提液的PCR扩增效果明显优于磷酸缓冲液和液体KB培养基,浸提时间以3—12 h为宜。实时荧光定量PCR检测结果与普通PCR一致。在3对特异引物中,引物BX-L_1/BX-S-R_2的普通PCR扩增效果最佳,引物SEQID4~m/SEQID5更适用于实时荧光定量PCR检测。     

西瓜细菌性果斑病菌在不同场所存活期的检测

选择西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的抗利福平菌株RifAac,通过人工模拟接种试验,采用选择性平板分离、菌落PCR(Bio-PCR)和常规PCR方法,观察该病原细菌在西瓜种子、土壤、病残体和田水中的存活期。结果表明,果斑病细菌在种子表面可存活4～5个月,在田水中可存活2个月,在不含植物残体的土壤中可存活8个月,在含西瓜残体的土壤中可以存活12个月以上。     

利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌

将hrpB2基因作为检测靶标,根据hrpB2基因设计了1对特异性引物HB2F2/HB2R2,用此特异引物从瓜类细菌性果斑病菌菌株中扩增出290 bp的特异性片段,而其余参试菌株和甜瓜组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度试验证明可以检测到103CFU/ml靶标菌体。对市售的17个品种的甜瓜种子进行PCR检测,其中4个品种检测出携带有瓜类细菌性果斑病菌。将hrp基因作为靶标,为快速检测瓜类细菌性果斑病菌提供了新的方法。     

PMA-qPCR方法快速检测细菌性果斑病菌活菌的研究

本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与qPCR技术相结合,建立了一种适于细菌性果斑病菌株活细胞快速检测的PMA-qPCR方法。通过试验控制单因素变化,对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为9μg·mL^-1,曝光时间为8 min的PMA预处理体系,能有效抑制1.0×10⁷ mL^-1灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在2.0×10¹～2.0×10⁶ mL^-1,qPCR反应体系中活菌数与Ct值呈线性相关(R²=0.982 7)。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除细菌性果斑病死菌的干扰,定量检测出活菌数量,研究结果可为植物细菌性果斑病的流行规律研究提供新的技术支撑,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。     

山东省西瓜细菌性果斑病的病原菌鉴定

近年来,在山东省临沭县、昌乐县、章丘县等地西瓜育苗基地的西瓜苗上发现了一种新病害——西瓜细菌性果斑病。从病果和病叶片上分离到15个细菌菌株,选取8个菌株进行致病性测定,结果表明,该8个菌株均能侵染西瓜,发病症状和自然发病症状完全一致;从接种发病的病果上可重新分离到相同的细菌。对该8个菌株菌体形态、染色反应、培养性状及其生理生化特性等项目进行观察测定,确认供试菌株为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli Willems et al.,1992)。     

西瓜细菌性果斑病的检测与防治

西瓜细菌性果斑病是西瓜、甜瓜上的毁灭性病害,Crall和Schenck于1969年初次报道该病的发生,现主要分布在美国、澳大利亚、马利亚纳群岛、印度尼西亚、土耳其等国家[1-3].     

瓜类细菌性果腐病病原IAS-PCR检测研究

本研究采用免疫磁珠吸附与PCR相结合的技术,对瓜类细菌性果腐病病原快速检测方法进行了研究。对新疆昌吉、海南、上海等地的西、甜瓜细菌性果腐病病叶、种子进行检测结果表明,用特异性引物,带菌病叶、种子均出现360bp特异条带,该方法对该菌悬浮液最低检出量为1×10cfu/mL,检出种子最低带菌率1‰。与常规PCR方法相比,检测时间周期为4h,且不需进行细菌DNA提取,灵敏度高出常规PCR100倍。这一方法的建立对于田间该病原的准确诊断,控制西、甜瓜种子带菌传播及进出口西、甜瓜种子检疫将起到重要作用。     

葫芦种子带菌对幼苗细菌性果斑病发生和侵染途径的影响

采用葫芦砧木种子人工接种燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae ssp.citrulli,Aac)的方法,观察由Aac经种传方式对葫芦砧木苗期发病的影响和Aac在葫芦砧木苗期的定殖情况,并在温室条件下分析种子中不同带菌量与葫芦砧木幼苗细菌性果斑病发病的关系。结果表明:Aac在随着葫芦砧木幼苗生长过程中先侵染幼苗子叶,随后沿叶脉侵入下胚轴并定殖于下胚轴的韧皮部和木质部中,继而引起幼苗下胚轴发病;随着砧木种子带菌浓度的提高,幼苗发病率和病情指数也越高。     

药物浸种处理防治西瓜嫁接苗细菌性果斑病试验

【目的】筛选防治西瓜嫁接苗细菌性果斑病（BFB）的种子处理有效药剂,为防治BFB提供科学依据。【方法】先以17种药剂的200倍液对西瓜种子进行浸种处理,依据嫁接苗BFB的发病率初步筛选防治BFB的有效药剂;以初选有效药剂进行不同浓度、不同混合组合及不同浸种方法处理对嫁接苗BFB的防治效果试验。【结果】初试结果表明,2%春雷霉素处理西瓜嫁接苗BFB病株率较低,可用于下一步试验。复试结果表明,2%春雷霉素100、200、300、400、500倍液浸种处理有籽西瓜种子,嫁接后12d嫁接苗BFB发病率分别为1.0%、36.7%、94.3%、95.7%、98.1%;2%春雷霉素200倍＋乐无病、72%农用链霉素、72%农用硫酸链霉素800倍液浸种处理有籽西瓜种子,嫁接后12d嫁接苗BFB发病率为1.0%~2.4%;2%春雷霉素100、200、300、400倍液处理西瓜干种子,嫁接后12d有籽西瓜嫁接苗BFB发病率为0.5%~5.7%,无籽西瓜嫁接苗BFB发病率为8.1%~11.4%;2%春雷霉素400倍＋乐无病、72%农用链霉素、72%农用硫酸链霉素1000倍液处理西瓜干种子,嫁接后12d有籽西瓜嫁接苗BFB发病率为1.0%~2.0%,无籽西瓜嫁接苗BFB发病率为6.7%~9.5%。【结论】2%春雷霉素可作为防治西瓜嫁接苗BFB的首选特效药,推荐浓度为2%春雷霉素400倍或以2%春雷霉素400倍搭配其他杀菌剂使用。     

海南甜瓜细菌性果斑病病原菌鉴定

通过田间采集病样,分离到致病性细菌菌株LD101206,采用柯赫氏法则对分离物进行致病性测定,通过对其形态学、培养性状、生理生化性状和16S rRNA基因序列分析,将菌株LD101206鉴定为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli Willems)。     

浙江省甘薯上发现瓜类细菌性果斑病菌

通过对浙江宁海县疑似甘薯茎腐病等检疫性病害的调查,在甘薯病株上分离纯化获得能够引起烟草过敏反应的4株分离物,通过菌落形态观察、革兰氏染色反应、16S rRNA序列分析以及致病性测定等细菌学测定,将这4株菌株都鉴定为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,原Acidovorax avenae subsp. citrulli),序列同源性高达99.00%~100.00%。瓜类细菌性果斑病菌为我国的检疫性有害生物,务必引起高度重视,以保障浙江重要经济作物西甜瓜产业的健康发展。     

广西甜瓜细菌性果斑病病原鉴定及16S rDNA序列分析

【目的】对广西区内疑似甜瓜细菌性果斑病的病原菌进行分离鉴定,明确引起该病害的病原菌,为甜瓜细菌性果斑病的抗病育种及综合防治提供理论依据。【方法】分别采集南宁市和贺州市疑似甜瓜细菌性果斑病的病叶(编号:WM0922)和病果(编号:XD0611)样品,对样品进行分离纯化,并通过测定分离菌株的致病性、观察菌落形态和培养性状、测定其生理生化性状及比对分析16S rDNA序列,对供试病原菌进行鉴定。【结果】从编号WM0922的病叶上分离得到5株菌株,经致病性测定有3株菌株(WM0922-2、WM0922-3和WM0922-4)具有致病性;从编号XD0611的病果上分离得到8株菌株,经致病性测定有4株菌株(XD0611-5、XD0611-6、XD0611-7和XD0611-8)具有致病性;择优选取具有代表性的菌株WM0922-3和XD0611-7进行后续试验,发现二者均可侵染葫芦子叶,革兰氏反应均为阴性,培养性状及生理生化测定结果一致,对比分析16S rDNA基因序列,与Acidororaxcitrulli的相似性均在99%以上。【结论】引起甜瓜细菌性果斑病的病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(A.avenae subsp.citrulli)。     

Application of droplet digital PCR in detection of seed-transmitted pathogen Acidovorax citrulli

Bacterial fruit blotch caused by Acidovorax citrulli is a serious threat to cucurbit industry worldwide. The pathogen is seed-transmitted, so seed detection to prevent distribution of contaminated seed is crucial in disease management. In this study, we adapted a quantitative real-time PCR (qPCR) assay to droplet digital PCR (ddPCR) format for A. citrulli detection by optimizing reaction conditions. The performance of ddPCR in detecting A. citrulli pure culture, DNA, infested watermelon/melon seed and commercial seed samples were compared with multiplex PCR, qPCR, and dilution plating method. The lowest concentrations detected (LCD) by ddPCR reached up to 2 fg DNA, and 10² CFU mL⁻¹ bacterial cells, which were ten times more sensitive than those of the qPCR. When testing artificially infested watermelon and melon seed, 0.1% infestation level was detectable using ddPCR and dilution plating method. The 26 positive samples were identified in 201 commercial seed samples through ddPCR, which was the highest positive number among all the methods. High detection sensitivity achieved by ddPCR demonstrated a promising technique for improving seed-transmitted pathogen detection threshold in the future.     

布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]根据DNA序列数据库上已公布的布鲁氏菌外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)Omp 25基因,设计一对引物和荧光探针,通过反应体系优化,建立一种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法.[方法]以构建的外膜蛋白目的片段重组质粒为标准品,验证该方法的灵敏度、特异性,通过优化反应条件,建立标准曲线.通过对34份已知临床背景的样品检测,验证该方法的敏感性.[结果]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,特异性验证符合率100％,最低检测限约为100 copies/μL,敏感度的检出率为100％,建立标准曲线的R2为0.994,扩增效率99.73％.[结论]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于布鲁氏菌的检测.