qseC及luxS双基因缺失对多杀性巴氏杆菌毒力及其交叉免疫保护性的影响

qseC和luxS是多杀性巴氏杆菌群体感应系统相关基因,为探讨其双缺失对多杀性巴氏杆菌致病性及交叉免疫保护的影响,本研究在前期构建的牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株(PmCQ2)qseC基因缺失株(ΔqseC)的基础上进行了luxS基因缺失,构建了qseC及luxS双基因缺失株(ΔqseCΔluxS)。与野生型PmCQ2相比,该双基因缺失株在生物膜产生方面显著上升,而其荚膜生成量、血清敏感性及其毒力却显著下调,与qseC单基因缺失相比,双基因缺失在调节菌株部分生物学特性方面具有正向或负向叠加效应。疫苗交叉免疫保护性方面,与ΔqseC及野生型PmCQ2比较发现,双基因缺失株中luxS基因的缺失,减弱了部分qseC基因缺失所赋予菌株的交叉免疫保护效果,但却增强了菌株对牛源F型多杀性巴氏杆菌的交叉免疫保护作用,相比PmCQ2的无交叉免疫保护作用,qseC及luxS双基因缺失仍赋予了菌株很好的交叉免疫保护性。研究结果表明,群体感应基因qseC和luxS均可调控多杀性巴氏杆菌毒力及其交叉免疫保护性,该双基因缺失株可作为多杀性巴氏杆菌广谱型疫苗候选菌株。     

牛源多杀性巴氏杆菌新型交叉保护性抗原的筛选

为了筛选多杀性巴氏杆菌潜在的交叉保护性抗原,首先对牛源多杀性巴氏杆菌PmCQ2株(A型)、PmCQ6株(A型)、PmB株(B型)、PmF株(F型)全基因组序列进行分泌蛋白及膜蛋白预测,并使用Signal、TMMHM在线分析筛选到48个候选共有抗原基因;然后分别克隆于pET-28α中构建原核重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,SDS-PAGE检测获得31个重组表达蛋白。间接ELISA检测重组蛋白对3种不同血清型牛多杀性巴氏杆菌多抗的反应原性,发现13个重组蛋白具有较强的反应原性。最后选择5个重组蛋白免疫小鼠后,分别采用10LD50PmCQ2、PmB和PmF进行攻毒保护性试验,结果显示:r-PmCQ2_1g0376免疫后的小鼠对PmCQ2和PmB的攻毒保护率为50%和30%,对PmF则没有保护性;r-PmCQ2_4g0132免疫后对PmCQ2、PmB和PmF株的攻毒保护率分别为80%,20%和10%;r-PmCQ2_1g0311免疫后的小鼠对PmCQ2的攻毒保护率为30%,对PmB和PmF株均无保护性。本试验筛选出2个交叉保护性抗原,可以不同程度保护同源或异源菌株的攻击,为多杀性巴氏杆菌新型疫苗候选蛋白的筛选奠定了基础。     

牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清型及毒力基因检测

为了确定12株牛源多杀性巴氏杆菌的血清型及毒力基因的携带情况,本研究采用PCR技术对12株牛源多杀性巴氏杆菌(pasteurella maltocida,Pm)进行荚膜血清型鉴定和6种毒力基因(tbp A、hgb A、hgb B、ptf A、pfh A、tox A)的检测,并对其序列进行比对分析。结果显示:12株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型;100%的荚膜血清A型Pm携带hgb A毒力基因和pfh A毒力基因;41.67%的荚膜血清A型Pm携带nan H毒力基因;58.33%的荚膜血清A型Pm携带ptf A毒力基因;而对于tbp A与tox A两种毒力基因在12株牛源荚膜血清A型Pm中均未检测到。     

禽多杀巴氏杆菌的交叉保护性研究

经差速和蔗糖密度梯度离心,从Ｐ１０５９感染鸡的血液中提取巴氏杆菌。每羽鸡可提取较纯的菌液约１０ｍｌ,含菌量在１００亿／ｍｌ以上。该菌液灭活后免疫鸡,用异型菌Ｃ４８１交叉攻毒,结果与肝组织苗免疫的一样,均具有５０％的保护率,而Ｐ１０５９攻毒耐过鸡则全保护。结果证明,体内繁殖的巴氏杆菌具有交叉保护性,而体外培养菌则没有。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-3株hexABC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为研究荚膜在禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)致病过程中的作用,本研究利用同源重组基因敲除技术构建禽P.multocida C48-3株荚膜多糖输出蛋白基因hexABC的缺失突变株,并以小鼠为动物模型检测荚膜缺陷对细菌毒力的影响。PCR、RT-PCR和DNA测序结果均表明253 bp的hexC基因下游序列、798 bp的hexB基因全序列和290 bp的hexA基因上游序列完全被四环素抗性基因替代,表明构建了基因敲除突变株C48-3ΔhexABC。电镜观察结果表明突变株荚膜合成能力缺失,对小鼠的致病性试验结果显示突变株毒力基本丧失。本研究获得的无荚膜突变株为进一步研究禽P.multocida的致病机理奠定基础。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌rpoE基因缺失株的构建及生物学特性分析

为研究牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)rpoE基因在Tibet-Pm1菌株中的部分生物学特性,试验利用同源重组技术筛选出rpoE基因缺失株Tibet-Pm1-ΔrpoE,分析缺失株和原菌株Tibet-Pm1在外界环境生长、环境胁迫存活率、生物被膜形成、细胞黏附性和致病性上的差异。结果表明：利用同源重组技术成功构建出rpoE基因缺失株Tibet-Pm1-ΔrpoE。缺失株的平均OD₅₉₅值为0.135,显著低于Tibet-Pm1菌株的平均OD₅₉₅值0.337(P<0.05)。在20℃条件下,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株生长较缓慢,两种菌株的生长存在明显差异;不同温度下3 h内两种菌株生长的差异性较小。在紫外线照射条件下,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株的存活率由21.3%降到16.7%;在50℃高温条件下,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株的存活率由0.75%降到0.59%。在细胞黏附试验中,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株在MDBK中的黏附性由6.67×10⁵ ...     

牛源A型多杀性巴氏杆菌pm0979和pm0442基因编码蛋白对小鼠的免疫保护性研究

为评价牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pm) pm0979和pm0442基因编码蛋白的免疫保护效果,本研究以牛源PmCQ2株基因组DNA为模板,经PCR扩增得到pm0979、pm0442全长基因,将其分别克隆到pET-30a、pET-32a载体并转化BL21 (DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达,分别获得大小约41.8 ku (rPM0979)和21.6 ku (rPM0442)的重组蛋白;将其亲合层析纯化后分别免疫小鼠,以PmCQ2株进行攻毒试验,测定其抗体产生情况和保护效果.结果表明,两种重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高水平的抗体;其中rPM0979对小鼠的免疫保护高于rPM0442,保护率可达60％.结果表明,重组蛋白PM0979可作为Pm的一种疫苗候选蛋白,为进一步的疫苗研制奠定了基础.     

禽多杀性巴氏杆菌交叉保护因子的研究进展

禽霍乱是危害养禽业的重要传染病之一。疫苗免疫接种是防制该病的重要措施,传统疫苗因禽多杀性巴氏杆菌血清型众多且无交叉保护能力而不能有效控制该病。禽多杀性巴氏杆菌交叉保护因子的发现为研制适合各种血清型禽多杀性巴氏杆菌引起感染的广谱疫苗展现了诱人的前景。本文就禽多杀性巴氏杆菌交叉保护因子研究进展进行了综述。     

花边鸭源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及主要毒力基因检测

为鉴定一起花边鸭突然发病死亡的病原,从发病鸭中分离到一株致病菌GZZY2019,分离菌在鲜血培养基中呈现圆形、表面光滑、边缘规则、半透明的露滴状小菌落;革兰氏染色镜检显示,分离菌为革兰氏阴性短杆菌;生化鉴定结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、甘露醇等,鸟氨酸、尿素、吲哚等试验阳性;细菌种特异性鉴定结果与多杀性巴氏杆菌相符;荚...     

体内繁殖禽巴氏杆菌的提取及其交叉保护特性

通过不同攻毒途径、不同攻毒剂量、不同采血时间及不同采血途径的试验表明，以翅静脉途径攻击多杀巴氏杆菌，剂量10亿／只，在鸡濒死挣扎时的即刻颈静脉无菌放血，可以自鸡体采集到最大量的含菌血，每只鸡37～39mL，再将血液进行差速和蔗糖密度梯度离心，可最大限度地提取到血液中的巴氏杆菌，每只鸡300～400亿的总菌量。该结果与报道的提取方法相比，效率提高了1000倍以上。提取的细菌灭活后免疫鸡，经异型菌交叉攻毒试验表明，体内繁殖的巴氏杆菌具有交叉保护特性，而体外培养菌则没有。用该方法提取的巴氏杆菌，其总蛋白和总糖含量均高于培养基培养菌，提示二者之间的差异可能与交叉保护特性存在着一定的相关性。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）灭活疫苗菌株,本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价,并进行了攻毒保护试验。结果显示,分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多,均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因;免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应,在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128,强毒攻毒后全部存活,而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明,Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株,其中Pm3作为首选株。     

多杀性巴氏杆菌毒力因子、免疫原及重要基因研究进展

多杀性巴氏杆菌可引起禽霍乱、猪萎缩性鼻炎等多种动物疫病,是重要的动物病原微生物之一。其基因组编码的多种产物在该菌的致病性及诱导免疫应答方面具有重要作用,已成为研究的热点。作者就国内外多杀性巴氏杆菌荚膜、外膜蛋白、脂多糖等毒力因子和免疫原及其相关基因的研究进展进行了简要概述。     

A:L1 ST128型鸭源多杀性巴氏杆菌的耐药性及毒力分析

旨在阐明贵州某规模化鸭场临床疑似鸭霍乱的病原菌耐药性及毒力特征,通过细菌的分离鉴定、多位点序列分型（MLST）、ERIC-PCR同源性分析、药敏试验、动物回归试验、细菌全基因组测序以及基因组局部比较分析对分离株进行系统研究。结果显示,分离得到5株鸭源多杀性巴氏杆菌（PmCW1~5）,均为A：L1 ST128型且同源性较高;分离株均对氨苄西林、阿莫西林、左氧氟沙星和林可霉素4种药物耐药,其中PmCW1还对环丙沙星低水平耐药;对强毒株PmCW1的全基因组数据分析显示,PmCW1中存在β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类和多肽类等耐药基因,同时存在多药外排泵及多药耐药蛋白基因,耐药表型与耐药基因检测结果基本相符;PmCW1中存在的毒力基因总数为201个,主要是脂寡糖/脂多糖（LOS/LPS）、荚膜、黏附因子等编码基因;此外,还检测到IV型菌毛基因（ptfA、comE、hofB、hofC、vfr）、铁摄取相关蛋白基因（ccmABCEF、hgbBC、fur、hscB等）以及部分外膜蛋白基因（ompP5等）等;PmCW1具有典型的A：L1型多杀性巴氏杆菌的特征。综上表明,本研究分离得到的ST128型鸭源多杀性巴氏杆菌目前鲜有报道,对其耐药性及毒力的研究可为鸭霍乱的临床用药及疫苗研发提供理论依据。     

我国猪群中多杀性巴氏杆菌的基因型分析

本研究旨在了解我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌(Pm)的主要基因型。利用荚膜基因分型、脂多糖(LPS)基因分型、多位点序列分型(MLST)对2013年12月—2017年12月4年间来源于我国各地区规模化猪场患有疑似呼吸系统疾病的病死猪肺、鼻拭子、气管、肝等样品中分离鉴定的Pm进行基因型分析,并对23种主要毒力基因进行检测。结果表明,当前在我国猪群中流行的Pm的荚膜基因型为A(48.85%)、D(42.75%)、F(2.67%),优势基因型为A和D;LPS基因型为L3(25.00%)和L6(75.00%)型,优势基因型为L6;MLST基因型为ST3(21.25%)、ST10(27.50%)、ST11(42.50%)、ST12(2.50%)、ST16(2.50%)、ST74(1.25%)及ST75(2.50%),优势基因型为ST3、ST10和ST11。如果将荚膜基因型、LPS基因型和MLST基因型组合起来看,当前在我国猪群中流行的Pm的主要基因型为荚膜:脂多糖:MLST基因型A:L3:ST3(20.00%)、A:L6:ST10(26.25%)及D:L6:ST11(42.50%)。毒力基因检测的结果发现部分毒力基因的分布表现出一定的"基因型偏好性"。结果提示,D:L6:ST11是我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌的主要基因型,可能与我国猪群中由多杀性巴氏杆菌导致的呼吸道疾病密切相关。     

野生草食动物源8株多杀性巴氏杆菌的PCR鉴定和分型

从表现出血性败血症临床症状的斑马、白唇鹿、黑鹿和长颈鹿中分离出8株多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamuhtocida,Pm）,采用Pm种特异性的KMT1/KMT2引物分别与荚膜血清群特异性的Cap A1/Cap A2、Cap B1/CapB2、Cap D1/Cap D2引物组合来鉴定分离到的菌株,并与间接血凝试验及金黄色葡萄球菌抑制试验的结果相比较,证实PCR鉴定方法与传统的生化反应鉴定结果完全一致。荚膜PCR分型结果与间接血凝试验金黄色葡萄球菌抑制试验结果完全一致,这说明多重PCR方法可用于多杀性巴氏杆菌菌种及荚膜血清型的鉴定,我国野生草食动物多杀性巴氏杆菌病中存在多个荚膜血清型。     

鹿源多杀巴氏杆菌荚膜分型及免疫原性

采用Carter荚膜群鉴定法净分离于我国鹿的38株多杀巴氏杆菌进行鉴定，结果显示：B型占68.4%（26/38）。A型占18.4%(7/38)，D型占5.3%(2/38)，3株未能确定型占7.9%(3/38)。并从26株荚膜B型巴氏杆菌中选出荧光典型的8株菌制备免疫原给健康兔注射，30d后用间接血凝法测定各株菌抗体效价，选出效价最高的2株菌D1PM和D2PM用小鼠增毒，当毒力稳定后用兔测得D1PM MLD为8个菌，D2PM MLD为17个菌，为疫苗的制造筛选出了优良的菌株。     

Adherence of Pasteurella multocida to fibronectin

For many pathogens, adherence and/or invasion involve association with host extracellular matrix molecules, such as fibronectin (Fn). Pasteurella multocida was found to bind significantly to Fn and collagen type IX but not to laminin and collagen types IV and X. The binding of P. multocida to Fn was dose-dependent and was inhibited by heparin (Hep). Removal of polysaccharide capsule enhanced the binding capacity of the bacterium to Fn and inhibition by Hep. Protease treatment of bacteria decreased binding, implicating surface protein(s) as adhesive components. Investigation of the binding domain(s) of P. multocida on the Fn molecule revealed preferential binding to the N-terminal Hep-binding domain of Fn but not to the carboxyl-terminal Hep-binding domain. Furthermore, Fn, and anti-Fn antibodies inhibited P. multocida adherence to Madin-Darby bovine kidney cells, suggesting the involvement of Fn in the bacterium adherence to host cells. Ligand blotting, batch affinity purification and MALDI-TOF mass spectrometry implicated several proteins as putative adhesins of P. multocida in the Fn-mediated adherence. Taken together, the data suggest that P. multocida-Fn interaction may play a role in the bacterium adherence to host cells, and this may be mediated by bacterial surface proteins with preferential affinity for the Hep-1 binding domain of Fn.     

大灰袋鼠多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2010年5月,北京动物园饲养的1只大灰袋鼠急性死亡。解剖发现其胰腺、心肌、大网膜、肾上腺等大面积出血。无菌采集肝、脾、大网膜接种于血琼脂培养基,分离到一株细菌。对细菌纯培养物进行形态学观察,并分别做氧化酶、触酶、糖发酵等生化特性试验,初步判定为多杀性巴氏杆菌。同时,API鉴定系统显示,该菌为氧化酶阳性、触酶阳性。API20E鉴定试纸鉴定为多杀性巴氏杆菌,鉴定百分率为90%。用该菌的培养物对6只小白鼠做致病性试验。6只小鼠均于6 h内死亡,经剖检均从心血中分离到较纯的多杀性巴氏杆菌。进一步说明分离到的菌株为多杀性巴氏杆菌。     

多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及生物信息学分析

本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a （+）-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1 044 bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a （+）-OmpA重组菌最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,表达的重组蛋白大小约为40 ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40 ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C₁₆₈₄H₂₆₁₉N₄₅₇O₅₀₅S₃,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。