Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF6多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白。以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体,并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性。【结果】CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp,与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%,其中与CyHV-3的相似性高达39.36%;其抗原表位最可能存在于第1~300位氨基酸序列中。将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6,转化BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达,其分子量为17.13 kD,经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL。以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞（GiCF）;利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析,结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光,而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光,进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2。【结论】制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应,即可用于鉴定CyHV-2感染,为探究ORF6蛋白功能是否与CyHV-2潜伏感染相关打下了基础。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72基因克隆、蛋白原核表达和抗体制备

异育银鲫作为我国重要的淡水经济鱼类,其鳃出血病为主要病害,并造成重大经济损失,该病病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2)。目前,研究主要在该病的检测和病理方面,对于免疫学检测方面研究较少。本研究根据CyHV-2 ORF72基因序列设计了1对特异性引物,利用患病异育银鲫肾脏DNA作为模板,通过PCR扩增得到CyHV-2 ORF72基因全长,该基因序列全长为1 113 bp,可编码370个氨基酸的蛋白。该基因与pET-28a表达载体连接构建重组原核表达载体pET-ORF72转入大肠杆菌中,经IPTG诱导表达得到了分子量约为45 ku的重组蛋白,与预测的蛋白大小基本一致。将纯化的重组蛋白皮下多点注射免疫新西兰大耳兔制备了ORF72的多克隆抗体,经Western Blotting检测抗体能与病毒粗提液有良好反应,特异性较好,本结果可为下一步建立疫苗和免疫检测方法奠定基础。     

鲤疱疹病毒2型 ORF144原核表达和多克隆抗体制备

鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)引起的鲫造血器官坏死病是近年来对鲫(Carassius carassius)养殖业危害最大的疾病之一。通过PCR扩增得到ORF144基因全长,将其与pET-32a原核表达载体连接构建重组载体pET-ORF144,转化到大肠杆菌中,经IPTG诱导表达得到大小约 46 kDa的重组蛋白,该蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在。将重组融合蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,间接ELISA检测显示抗体效价大于1∶51 200。经Western Blot验证该抗体可特异性识别感染CyHV-2的细胞中的蛋白质和纯化的融合蛋白。间接免疫荧光结果显示该蛋白定位于细胞质,呈点状分布。结果表明构建的ORF144多克隆抗体可为病毒的基因功能和致病机制研究提供基础。     

羊口疮病毒ORF080基因的原核表达、纯化及鉴定

本试验旨在原核表达、纯化羊口疮病毒ORF080蛋白并鉴定其反应性.根据GenBank已发表的羊口疮病毒OV-GO株ORF080基因序列(登录号:KP010354),将密码子优化后合成该序列并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,构建pET-32a(+)-ORF080重组质粒.经双酶切和测序鉴定后转化至大肠杆菌Rossetta感受态细胞中,用IPTG诱导,诱导产物经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式获得表达.采用镍柱对可溶性重组蛋白进行纯化,再经SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹双重鉴定.SDS-PAGE检测结果显示,在57 ku处出现单一重组蛋白条带;蛋白质免疫印迹鉴定证实该纯化的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体和羊口疮阳性血清发生特异性反应,证明成功表达并纯化出具有良好反应性的ORF080蛋白.试验结果为进一步对ORF080蛋白结构、功能及基因工程疫苗的研究提供参考.     

鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2) ORF25蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

利用PCR方法扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)ORF25基因的部分基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子质量大小为42ku,且主要以包涵体形式存在;用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通过细胞融合,筛选出1株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,这株单抗可以识别CyHV-2ORF25蛋白。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析

为进一步研究鲤疱疹病毒Ⅱ型 ( Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2) ORF4蛋白的功能, 通过PCR扩增CyHV-2 ORF4基因, 并构建重组穿梭质粒pFastBac HTA-ORF4, 将其转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞后获得重组杆粒Bacmid-ORF4; 采用脂质体法转染S...     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。     

绵羊肺炎支原体多表位融合基因MO-meAg1的构建、表达及重组蛋白免疫原性分析

为获得具有良好免疫原性的绵羊肺炎支原体(MO)重组蛋白,利用ABCpred等软件预测分析MO EF-P、PDHA、P97相似蛋白和EF-Ts蛋白的优势线性抗原表位,构建多表位融合基因MO-meAg1,合成后将其亚克隆至表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-32a(+)-MO-meAg1。将pET-32a(+)-MOmeAg1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDSPAGE结果显示,MO-meAg1重组蛋白分子质量约34.5ku;Western blot分析结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。小鼠免疫试验结果表明,重组蛋白MO-meAg1具有较强的免疫原性,诱导机体产生的抗血清其间接血凝效价可达1∶128以上。获得的多表位融合蛋白MO-meAg1为绵羊支原体肺炎的免疫学诊断及新型疫苗研究奠定基础。     

PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达及与PCV2灭活抗原免疫效果的比较

利用基因克隆方法,将PCV2的ORF2基因PCR扩增并酶切后连入pET-32a载体,构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定后,与PCV2灭活抗原分别与弗氏不完全佐剂乳化,并分别免疫仔猪以比较免疫效力。结果为PCV2的Cap蛋白得到正确表达,免疫保护性试验结果显示,相对于灭活抗原制备的疫苗,表达的Cap蛋白制备的疫苗具有更好的免疫原性和保护效力。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的克隆表达及免疫保护性研究

【目的】对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌株RB1-a基因进行克隆与表达,检测表达产物的免疫保护性,为鸡球虫基因工程疫苗的研制奠定基础。【方法】以纯化的E.tenella杨凌株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出其RB1-a基因,测序后进行序列分析。然后将RB1-a基因N端不含信号肽序列克隆到表达载体pET-32a(+)中,构建pET-32a-RB1-a重组质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,对其免疫效果进行评价。【结果】柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的开放阅读框(ORF)包含618个碱基,编码205个氨基酸,与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫PAPa46株ORF序列相似性为99.84%,两者推导的氨基酸序列相同。SDS-PAGE分析表明,重组质粒表达分子质量为42ku的融合蛋白。免疫效果测定结果显示,RB1-a免疫组和RB1-a+佐剂免疫组的相对增重率分别为64.2%和69.4%,卵囊减少率分别达37.22%和30.56%,抗球虫指数分别为146.2和150.4。【结论】RB1-a基因具有很强的保守性,种间差异不大;RB1-a重组蛋白具有一定的免疫保护效果。     

3型鲤疱疹病毒白介素10单克隆抗体制备与应用

白介素（Interleukin，IL）10是 脊椎动物Th2细胞（T helper 2 cell）和先天淋巴细胞（Innate lymphoid cell）分泌的一种多效应细胞因子。3型鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesvirus 3, CyHV3）ORF134编码IL10样蛋白，本研究构建了ORF134原核表达质粒，在大肠杆菌DE3感受态细胞中表达CyHV3-IL10重组蛋白。SDS-PAGE分析结果表明，重组CyHV3-IL10蛋白约为18 ku，主要以包涵体形式表达。将CyHV3-IL10包涵体进行变性和复性，经分子筛凝胶柱层析纯化获得了纯度较高的重组CyHV3-IL10蛋白，利用CyHV3-IL10重组蛋白免疫小鼠制备了单克隆抗体，通过酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）筛选，获得了2株亲和力强的抗体，并利用激光共聚焦技术和Western blotting对抗体进行了鉴定。结果表明，FITC标记的单克隆抗体能够特异性识别HEK293细胞中表达的CyHV3-IL10重组蛋白和感染CyHV3的镜鲤脾和鳃组织中表达的CyHV3-IL10蛋白。CyHV3-IL10单克隆抗体的制备为后续研究CyHV3-IL10蛋白功能和建立CyHV3诊断方法奠定了基础，为CyHV3病毒检测试剂盒的研发提供了新思路。     

鹅多杀性巴氏杆菌OmpH的扩增与生物信息学分析

为扩增鹅多杀性巴氏杆菌OmpH基因,预测OmpH蛋白二级结构和B细胞抗原表位,通过PCR扩增测序及生物信息学分析技术对该基因序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导及蛋白质二级结构的初步预测等,探讨了鹅多杀性巴氏杆菌OmpH基因在免疫保护中的作用。结果表明:鹅多杀性巴氏杆菌OmpH基因全长1537bp,ORF包含1056bp编码351个氨基酸;二级结构以无规则卷曲为主,有少量的α-螺旋和延伸带;推测OmpH蛋白有1个细胞黏附位点、3个糖基化位点。该研究为分析鹅多杀性巴氏杆菌外膜蛋白理化特性、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定了理论基础。     

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。     

鳗鲡疱疹病毒FJ株ORF51基因的克隆及生物信息学分析

为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株（AngHV-FJ） ORF51的结构特征,扩繁了 AngHV-FJ ,提取其基因组DNA ,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720 bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株（AngHV-1） ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26107.1 Da ,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。     

布鲁氏菌外膜脂蛋白OMP10基因的克隆表达、蛋白纯化及免疫原性研究

根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌OMP10序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增OMP10基因,将目的基因克隆入pEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a/OMP10,转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白pET-32a/OMP10,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白,并免疫小鼠。结果表明,成功构建了含OMP10的表达载体,经多次对表达条件的优化,获得了纯度较高的目的蛋白,为进一步动物免疫试验及研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。     

利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗

【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因,利用重组Cap蛋白制备PCV2 VLP疫苗的可行性。【方法】 根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体pQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析;利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装;利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量,利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比,得出目的蛋白量,将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg·mL^-1。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化,免疫2-3周龄抗原抗体双阴性的仔猪,同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组,免疫后14 d与21 d所有试验猪采血,分离血清,利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒检测试验猪血清中PCV2抗体水平;免疫后28 d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程序,利用PCV2 NJ株F₆代进行强毒攻击试验,肌肉注射与口服PCV2 NJ株各10^5.0TCID₅₀,同时利用乳化的钥匙孔血蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激,攻毒后25 d,对所有试验猪进行解剖检测,通过攻毒过程中试验猪体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方面评价大肠杆菌表达制备的PCV2 VLP的免疫效力。【结果】SDS-PAGE结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中;Western blotting分析结果显示表达的重组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反应;电镜下观察可见大量直径在17 nm左右的PCV2病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中;500 μg/头重组VLP疫苗免疫猪产生较高的抗体水平,单次免疫后21 d抗体100%达到合格,对PCV2强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达,重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒,且具有良好的免疫原性,可用于制备PCV2亚单位疫苗。     

鸡痘病毒ORF073基因克隆及原核表达

根据已经发表的鸡痘病毒(FPV)美国致病株的ORF073基因序列,设计1对引物,分别以282E4FPV、LP株FPV、102E6FPV为模板,扩增出目的片段,将其克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定证实,并进行序列测定。目的片段包含了大小为522 bp的ORF073基因,与GenBank上的AF198100(FPVUS)和AJ581527(FP9)序列进行序列比较分析表明:3种病毒株的ORF073基因与鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)和英国弱毒株(FP9)完全一致。克隆的ORF073基因与原核表达载体pET-28a构建重组表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)细菌中表达了分子质量约32 ku的蛋白。