不同生长时期梅花鹿鹿茸差异蛋白质组学分析

旨在从分子水平认识鹿茸生长机制,本研究以10、40、60与130d的梅花鹿鹿茸为试验材料,运用双向凝胶电泳(2-DE)、质谱鉴定技术与生物信息学方法对梅花鹿鹿茸生长过程中差异表达蛋白质进行研究。结果显示,有46种蛋白质差异性表达,且主要参与细胞骨架、转运过程、信号转导、细胞凋亡、骨发育、蛋白质合成、核酸代谢、免疫、能量代谢、细胞增殖、抗氧化、蛋白质折叠等生物学过程。结合鹿茸的快速生长与快速骨化的独特生长过程,对差异表达蛋白质中的骨发育相关蛋白、抗氧化蛋白、细胞凋亡相关蛋白做进一步分析,发现P4HB、SPARC、过氧化物还原酶2、过氧化物还原酶4、半乳糖凝集素1、视黄酸结合蛋白1等6种蛋白质在鹿茸快速生长与快速骨化过程中起着重要的作用,为鹿茸生长与骨化机制的进一步研究奠定基础。     

快速生长期和骨化期梅花鹿茸生长中心间充质组织的差异表达基因筛选

为了研究东北梅花鹿茸不同生长时期生长中心间充质组织基因表达变化,试验采用Illumina测序技术和生物信息学方法对快速生长期和骨化期鹿茸生长中心间充质组织进行转录组测序、组装、比对和差异基因表达分析。结果表明:从快速生长期和骨化期鹿茸间充质组织中分别获得4. 45 Gb和4. 47 Gb的测序数据,测序质量值、Q20值分别为98. 39和98. 75;通过Trinity软件组装,分别获得40 963条和39 315条组装序列,平均长度分别为1 121,1 139 nt;通过与蛋白数据库进行比对和差异基因表达分析筛选出调控鹿茸快速生长和骨化的差异表达生长因子10种,差异表达转录因子13种和差异表达胶原15种。说明鹿茸快速生长和骨化受多种生长因子、转录因子和胶原分子的调控,这些生长调控因子的表达差异性与鹿茸的再生、快速生长及骨化过程存在着极大的相关性。     

基于蛋白质组学技术的鹿茸不同部位差异蛋白筛选

旨在了解梅花鹿鹿茸不同部位蛋白表达差异,本研究以腊片部位、血片部位和骨片部位的梅花鹿鹿茸组织为试验材料,运用双向电泳(2-DE)和MALDI-TOF-TOF串联质谱技术对不同部位梅花鹿鹿茸差异表达蛋白质进行鉴定,并对差异蛋白进行生物信息学分析。结果表明,成功筛选出37个差异表达蛋白,主要涉及多细胞生物体发生、解毒、细胞成分组织或生物发生、细胞聚集、定位、对刺激的反应、生物黏附、发育、单一生物体发生、免疫系统等生物学过程。其中鹿茸腊片、血片、骨片组织中分别有18、5与14个蛋白质表达上调。对差异表达蛋白作进一步分析发现,转录延伸因子(EFB1)、视黄酸结合蛋白(CRABP1)在鹿茸的快速生长中起重要调控作用,而载脂蛋白A1(APOA1)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、转甲状腺素蛋白(TTR)在鹿茸的快速骨化中起重要的调控作用,对鹿茸快速生长与骨化机制的进一步研究具有重要意义。     

不同生长时期梅花鹿鹿茸转录组分析

本研究旨在探究不同生长时期梅花鹿鹿茸的转录组差异,丰富梅花鹿鹿茸转录组信息。选取5个生长时期(10、20、28、44、66d)的梅花鹿鹿茸组织作为试验样品,利用Illumina HiSeqTM2500高通量测序,并用测序评估、基因注释等生物信息学方法进行分析。结果,经过测序、转录本拼接获得了375 657条contigs,平均长度为688bp,329 946个unigenes,平均长度为534bp。通过比对Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG、GO等7大数据库,90.07%unigenes得到了成功注释。其中39 674个(12.02%)基因成功注释到GO数据库,在level 2水平上共分为41个类别;17 732个(5.37%)基因成功注释到将KOG的26个类别中。对5个生长时期的鹿茸转录本文库进行比较分析,共发现了509个差异基因,其中407个差异表达基因成功注释到GO数据库中,主要为信号转导、氧化还原、转录调节、蛋白酶降解等生物学过程。其中转录调节基因PER1、EGR1的表达随着鹿茸的生长而增加,而GAS1则相反,随着鹿茸的生长而降低,推测PER1、EGR1、GAS1等转录因子在鹿茸生长过程中可能起着重要的调节作用。本研究利用高通量测序技术对不同生长时期的梅花鹿鹿茸组织进行了转录组测序和分析,筛选到了梅花鹿鹿茸在不同生长时期下的差异表达基因,并获得了差异表达基因的功能。     

浅谈梅花鹿带血茸加工工艺

鹿茸是梅花鹿的嫩角,每年周期性地生长、骨化与脱落,在其尚未骨化时收获,鲜鹿茸含丰富的蛋白质与水分,营养与药用价值颇高。鹿茸的收获期时期正值盛夏,如不及时加工处理就会腐败变质,由珍品变成废物。下面笔者浅谈一下梅花鹿带血茸加工工艺。     

梅花鹿初生茸生长过程中活性差异蛋白表达分析

为了研究不同生长阶段梅花鹿初生茸活性蛋白表达变化,为鹿茸的质量评价和临床应用提供理论基础,采用蛋白质绝对和相对定量(i TRAQ)技术及超高液相色谱-质谱联用分析技术,结合生物信息学分析手段,对不同生长阶段梅花鹿初生茸活性蛋白进行定性和定量分析,研究不同生长阶段初生茸活性差异表达蛋白的功能分类及表达量变化。结果显示:不同生长阶段的梅花鹿初生茸活性差异表达蛋白(差异倍数≥1.5或≤0.67,且P值≤0.05)主要为软骨低聚基质蛋白、胶原、抗菌肽、S100蛋白和钙调蛋白等蛋白成分;生长初期表达量显著上调的差异表达蛋白主要为软骨低聚基质蛋白、IX/XI型胶原和二聚糖蛋白等细胞外基质蛋白成分,显著下调的差异表达蛋白主要为抗菌肽-2、S100蛋白A2/8/9、骨膜蛋白和血红蛋白亚基α/β等功能蛋白;梅花鹿初生茸生长初期主要为细胞外基质类成分,生长末期主要为功能性蛋白,因此生长末期的初生茸临床应用价值相对较高。研究结果对梅花鹿茸质量评价和临床应用具有一定指导意义。     

山羊慢性酒糟中毒血液代谢物分析及乙醇中毒通路关键基因mRNA转录水平变化

本试验旨在揭示慢性酒糟中毒对山羊血液代谢物及其显著性代谢通路——乙醇中毒代谢通路的影响，筛选潜在性诊断生物标志物，为该病神经系统紊乱发生机制及早期诊断提供参考资料。试验选取4月龄健康大足黑山羊与波尔山羊的杂交后代15只，随机分为3组，65%白酒糟组、75%白酒糟组、基础日粮对照组。每隔15 d,进行肝肾、钙磷及蛋白质代谢指标检测，结合临床症状判断山羊慢性酒糟中毒建模成功。采集血样，利用超高效液相色谱—四极杆飞行时间质谱联用技术进行差异代谢物分析并筛选差异代谢物代谢富集通路，研究差异代谢通路中关键基因的表达变化。代谢组学结果表明，慢性酒糟中毒引起山羊体内多巴胺(DA)和2-呋喃酰甘氨酸(2-FG)上调，前列腺素I₂(PGI₂)下调；突触小泡周期、多巴胺能突触、乙醇中毒、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、组氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、三羧酸循环、鞘脂信号通路、cAMP信号通路等代谢通路均差异显著(P<0.05)。其中，乙醇中毒代谢途径变化显著，且影响因子>0.2;乙醇中毒代谢通路中，75%白酒糟组TH、DAT表达量显著降低(P&l...     

基于label-free技术的梅花鹿(Cervus nippon)茸角蛋白组分比较

旨在探究不同生长时期梅花鹿鹿茸的蛋白质组分信息,为鹿茸有效活性物质的挖掘提供理论依据。本研究利用label-free蛋白质组学技术及生物信息学方法对不同生长时期(10、20、40、60、130与360天)梅花鹿茸角蛋白质组分进行比较研究。结果显示,梅花鹿茸角含有丰富的蛋白质,10、20、40、60、130与360天蛋白质含量依次为65.35、70.90、74.00、82.25、56.00、28.02 mg·g~(-1)。应用label-free蛋白质组学技术共鉴定出636种梅花鹿茸角蛋白质,其中218种蛋白质为显著差异表达,主要参与了蛋白质合成、发育、细胞骨架、转运等生物学过程。不同生长阶段茸角的蛋白质表达有各自的特点,为梅花鹿茸角药理活性成分的筛选及茸角相关产品的开发奠定理论基础。     

梅花鹿鹿茸生长速度、骨化程度与睾酮、雌二醇、碱性磷酸酶关系的研究

为了进一步阐明鹿茸生长发育机制,以5头雄性梅花鹿为材料,测定了从脱盘到生长停止期间的鹿茸生长速度、相对骨质密度(RBM),血清睾酮,雌二醇含量及碱性磷酸酶(AKP)活力。并对这些因素之间的关系作了分析。 测定结果表明,鹿茸从脱盘到停止生长约为120天。在此期间,所测各值变化均显著(P<0.01)。在前75天,鹿茸生长速度、 AKP活力迅速上升,并达到高峰。 RBM缓慢上升,虽与最低值比较差异显著(P<0.01),但上升幅度与75天以后相比则小得多。睾酮含量处于平稳期( P>0.05),雌二醇含量在脱盘后15天出现高峰,到75天降到最低,该期应属于鹿茸生长期。 75天以后,鹿茸生长速度、 AKP活力迅速下降, RBM、睾酮和雌二醇含量快速上升,该期应属于鹿茸骨化期。在生长期和骨化期,生长速度与AKP活力呈正相关(r=0.8);在骨化期,生长速度与RBM呈负相关(r=-0.9),与睾酮、雌二醇含量呈负相关(r=-0.9), RBM与睾酮、雌二醇含量呈正相关( r=0.9)。     

基于气相色谱-质谱技术的骡鸭肝脏代谢组学研究

为研究不同日龄骡鸭肝脏生长代谢物的变化差异情况,试验通过代谢组学分析70和90日龄公骡鸭肝脏差异代谢物。结果显示：70和90日龄骡鸭肝脏显著差异代谢物共44种,除包括氨基酸类（9种）、脂肪酸类（7种）、有机酸类（4种）、碳水化合物（9种）、维生素（4种）和核苷酸类（6种）等物质外,还有尿囊素、肾上腺素和D-鞘氨醇等显著差异代谢物。与70日龄骡鸭相比,90日龄骡鸭的肝脏差异代谢物表达上调的有6种,表达下调的差异代谢物有38种。代谢通路分析表明嘌呤代谢、癌症中的中枢碳代谢、环腺苷酸信号途径、脂肪细胞脂解的调控、蛋白质的消化与吸收等代谢通路在70和90日龄骡鸭的肝脏代谢中起主要调节作用。研究表明,这些代谢物的变化差异和参与的代谢通路大部分对骡鸭的肝脏生长均起到一定的保护作用,维持肝脏的生长。     

鹿茸组织中内参基因的筛选和验证

为筛选在不同生长时期鹿茸组织中稳定表达的内参基因,试验以不同生长时期(分别为脱盘后10、20、40和60 d)的鹿茸组织为材料,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β2-微球蛋白(B2M)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、60S 核糖体蛋白L40(RPL40)、谷胱甘肽还原酶7(GPx)和β肌动蛋白(ACTB)6个看家基因的表达情况,并运用 geNorm和NormFinder 两个程序综合分析6个看家基因的表达稳定性.结果显示,GAPDH、ACTB、RPL40表达稳定性较好,可用作鹿茸基因表达研究的内参基因,而NADH和GPx的稳定性最差,不适合作内参基因.通过对鹿茸生长相关基因(ANXA5、HSP27、PRD2、CRABP1、LGALS1)表达分析,进一步验证了上述结果,并且发现这5种基因均在脱盘后10 d的鹿茸组织中高表达.该研究结果为鹿茸快速生长及骨化相关基因的研究奠定了一定基础.     

Histological examination of the antlerogenic region of red deer (Cervus elaphus) hummels

Hummels are antlerless red deer stags. This abnormality has been attributed to poor feeding conditions which result in failure by the deer to grow complete pedicles. Incomplete pedicles lack the potential to develop normal antlers. The histological examinations in this study showed that the rudimentary pedicles (5 mm and 15 mm in height) grown by the two hummels respectively were developed by intramembranous ossification. This is the way that the frontal lateral crests of normal deer are formed, while, in contrast, antlers grow by endochondral ossification. The transition between the ossification types is most important, and occurs during pedicle growth. Therefore, we suggest that the antlerless condition of hummels is due to their failure to initiate true pedicle growth (which has the potential to develop into an antler) because the change from one ossification type to another does not occur. In view of the fact that both hummels were very small in terms of weight (33.7 kg and 51.8 kg, respectively) for their age, it is possible that nutritional cues are necessary for complete pedicle formation. Presumably these cues act synergistically with androgens for the development of the pedicle/antler as a secondary sexual character. It is possible that nutrition controls pedicle initiation through the IGF1 pathway.     

梅花鹿茸、马鹿茸不同部位氨基酸、总磷脂、钙、磷含量的研究

本文对梅花鹿茸、马鹿茸不同部位氨基酸、总磷脂、钙、磷含量进行了分析，结果表明：梅花鹿茸、马鹿茸不同部位都含有丰富的氨基酸，其中含有７种以上的人体必需氨基酸。各个部位氨基酸的总量，必需氨基酸的含量及总磷脂的含量由基部到顶端逐渐增加，钙、磷的含量则由基部到顶端逐渐减少。     

不同生长阶段吉林梅花鹿血液生理生化指标分析

本试验通过研究吉林梅花鹿不同生长阶段血液生理生化指标的差异情况,旨在为梅花鹿的健康检测、疾病防治、育种等提供依据和参考。选取吉林省左家、双阳、东丰地区哺乳仔鹿93头（公37头,母56头）、育成鹿135头（公40头,母95头）、成年鹿130头（公42头,母88头）,共358头,进行13项血液生理指标、19项生化指标检测。结果显示：哺乳公鹿与哺乳母鹿各项指标总体上差异不大,仅红细胞系统指标、血糖、肌酸激酶具有显著性差异（P<0.05）;红细胞压积、红细胞平均体积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶在不同性别的育成鹿与成年鹿中差异极显著（P<0.01）。不同生长阶段公鹿天门冬氨酸氨基转移酶、前白蛋白、总胆汁酸、血糖等差异显著（P<0.05）,红细胞系统、肌酸激酶、钙、无机磷、肌酐等差异极显著（P<0.01）,白蛋白、淀粉酶差异不显著（P>0.05）;不同生长阶段的母鹿淋巴细胞总数、红细胞总数、中性粒细胞总数差异显著（P<0.05）,白细胞总数、红细胞系统指标、天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、肌酸激酶、钙、无机磷等差异极显著（P<0.01）,谷氨酰转肽酶、总胆汁酸、白蛋白差异不显著（P>0.05）。以上结果说明,不同生长阶段、不同性别的梅花鹿血液生理生化指标存在较大变异,部分指标的差异可能与梅花鹿生茸、性别等生物学特性有关。对上述生理生化指标的测定,获得了不同性别的梅花鹿在不同生长阶段生理生化指标的参考范围,可为梅花鹿选种育种、疾病诊断、资源开发利用提供一定的参考,也可为野生东北梅花鹿资源保护和健康评估提供依据。     

鹿产茸性能的调控因素

在阐述鹿茸的药理作用和营养特性的基础上,分析了鹿品种、年龄、营养及激素、骨化、光照、温度、中草药添加剂、适时收茸、体重等因素对茸鹿产茸性能的影响,为提高鹿茸产量和质量提供了理论基础。     

半乳糖凝集素1的生物学功能及其在鹿茸再生过程中的作用研究进展

半乳糖凝集素1(galectin-1,GAL-1)是一种分子质量约为14 ku的β-半乳糖苷结合蛋白,分布于许多不同类型的细胞和组织中,在细胞内外均具有广泛的生物学活性,参与调节多种生理病理过程。GAL-1以剂量依赖性和细胞特异性双向调控细胞增殖,通过血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)途径促进血管的生成,参与机体的免疫调节,诱导T细胞凋亡、抑制T细胞增殖和抗原递呈细胞活化等。此外,GAL-1被认为是多种类型肿瘤的标志物,肿瘤细胞通过分泌GAL-1促进肿瘤内的血管生成和自身免疫逃逸。鹿茸是指鹿科动物头部衍生的未骨化密生茸毛的幼角,也是在自然界哺乳动物中迄今为止发现的唯一可实现周期性完全再生的骨质附属器官。鹿茸的再生是基于鹿茸干细胞增殖的过程,GAL-1在鹿茸干细胞中表达,并且鹿茸的再生过程与GAL-1生物学功能息息相关。然而,GAL-1在鹿茸再生过程中所扮演的角色仍待深入研究。作者综述了GAL-1的结构、生物学功能及其在鹿茸再生过程中的作用,以期为GAL-1和鹿茸再生机制的研究带来新的启示。     

Clone and Expression of VEGF Gene in Different Tissue of Tarim Red Deer Antler

This study was aimed to clone the coding sequence of vascular endothelial growth factor (VEGF) from the antler tissue at the top of the Tarim Red deer, and analyze the molecular properties and expression in antler tissue. This study extracted total RNA in antler tip by improved Trizol method and got the VEGF gene by RT-PCR method, then purified and connected it to pMD18-T vector, and conversed it into Escherichia coli DH5α, the expression of the VEGF protein at the top of antler tissue, between the cortex and chopped level of mesenchymal and cartilage layer in Red deer were determined using immunohistochemical method. The results showed that the open reading frame (ORF) length of VEGF gene was 648 bp, and encoding 216 amino acids, sequence homology of the nucleotide were 98.75%, 96.55%, 97.58% and 97.56% comparing with human, cattle, sheep and pig, respectively. The VEGF of Tarim Red deer antler was high similarity with that of human through its sequence analysis and comparison. The VEGF protein were expressed in the top of antler tissue, including skin mesenchymal and cartilage layer from immunohistochemical experiment, but there was no obvious difference. It was predicted that the Tarim Red deer antler might be ideal model of the blood vessel related of regenerative medicine diseases for human research.     

塔里木马鹿鹿茸VEGF基因克隆及其在不同鹿茸组织中的表达研究

试验旨在从塔里木马鹿鹿茸顶端组织中克隆血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的编码序列,分析其分子特性及其在鹿茸组织中的表达情况。本研究采用改良的Trizol法提取鹿茸顶端组织总RNA,以RT-PCR方法获得VEGF基因,回收纯化后连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并鉴定,利用免疫组化法确定VEGF蛋白在塔里木马鹿鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层中的表达水平。结果显示,VEGF基因开放读码框（ORF）全长为648 bp,编码216个氨基酸。通过其序列比对和进化分析发现,塔里木马鹿茸中VEGF与人、牛、羊、猪的VEGF核苷酸序列同源性分别为98.75%、96.55%、97.58%和97.56%,其中与人VEGF同源性较高。免疫组化试验表明,塔里木马鹿VEGF蛋白在间充质、茸皮层和软骨中均有表达,但无明显表达差异。说明塔里木马鹿鹿茸可能会是人类研究再生医学和血管相关疾病的理想模型,同时,本研究为不同发育期塔里木马鹿鹿茸再生干细胞比较蛋白质组学研究提供了基础试验数据。     

Copper supplementation, velvet antler production and growth of rising 2-year-old red deer stags

AIMS: To investigate whether copper supplementation to rising 2-year-old red deer stags (Cervus elaphus) in winter and/or spring improved velvet antler weight, grade and financial value, and liveweight gain. METHODS: Rising 2-year-old red deer stags (n=142) on a commercial deer farm in Hawke's Bay were allocated to two groups on May 14, 1996. One group received 20 g boluses of copper-oxide wire particles. On August 15 each group was reallocated in a crossover design, each sub-group receiving either the same copper-oxide treatment or no treatment, to produce control, winter-only, winter-plus-spring, and spring-only copper treatment groups. Blood samples were collected for serum ferroxidase measurements from seven deer per group and all deer were weighed at 4-6-week intervals. Dates of antler casting and velvet removal, and velvet antler weight and grade were recorded, and the financial value of velvet calculated. Livers from a sample of deer slaughtered at the end of the trial mid-December were analysed to determine copper content. RESULTS: Supplementation with copper did not significantly alter velvet antler weight, daily velvet antler growth rate, days from casting to removal, grade or value, or stag liveweight gain. Serum ferroxidase concentrations averaged 10.0-23.7 IU/l in control deer. Copper supplementation increased mean serum ferroxidase concentrations by approximately 10 IU/l. Mean liver copper concentration in control deer was 99 micromol/kg and ranged from 194 to 386 micromol/kg in the three treated groups. CONCLUSION: Group mean serum ferroxidase concentrations of 10 IU/l and above are adequate for optimum velvet production and liveweight gain in rising 2-year-old stags.     

塔里木马鹿茸间充质干细胞体外培养及细胞特性的研究

鹿茸间充质干细胞是一类新发现的干细胞。为获得鹿茸间充质干细胞的生物学特征,建立鹿茸间充质干细胞体外培养模式,通过采用改良组织块细胞培养法对生长30 d的塔里木马鹿茸间充质层细胞体外分离培养,观察细胞形态特征,MTT比色法检测细胞生长特点。结果表明:间充质层样品组织块于1 d完全贴壁,贴壁后培养2 d即可观察到组织块边缘迁出少量细胞,贴壁后培养3 d,大量的间充质干细胞从组织块中迁出,并不断增殖,在组织块贴壁后5 d细胞生长融合。传代培养的2~6代细胞在培养到96 h细胞增殖达到高峰。原代培养细胞呈梭形,细胞核呈椭圆形,细胞呈菊花状排列生长;传代细胞形态呈梭形、不规则形,且排列无规则。本研究结果将为鹿茸间充质干细胞的后续研究奠定基础。