绵羊主效基因FecB的检测与肉用多羔核心群的建立

基于前期本实验室建立的绵羊多羔性状主效基因FecB高通量检测技术(TaqMan探针法),对10个绵羊群体的16 460只绵羊进行了多羔性状主效基因FecB的检测,结果发现小尾寒羊、湖羊以及滩羊的B等位基因频率与前人实验结果一致,有些群体经过长期选择已处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05);本课题组与多个企业经过长期努力已建立了多个肉用多羔绵羊核心群,通过比较发现BB型绵羊产羔数极显著高于B+型,B+型极显著高于++型,且高繁殖力核心群3种FecB基因型小尾寒羊产羔数高于普通小尾寒羊群体。绵羊多羔性状主效基因FecB的检测和肉用多羔绵羊核心群的建立为绵羊群体改良提供了支撑。     

不同绵羊群体多羔主效基因FecB的检测

为分析FecB基因在不同绵羊群体中的分布情况以及对产羔数的影响,利用TaqMan探针分型技术检测了27 774只不同绵羊群体的FecB基因,结合12 304只个体的前3胎产羔数据,探索多羔主效基因FecB在提高绵羊繁殖力方面的重要作用。分型结果显示,湖羊群体含有最高的B等位基因频率,达0.90以上,且随着群体中湖羊血统含量的增加B等位基因频率也增加。湖羊、皮山红羊、杜湖杂交羊、杜湖（♂）×湖羊（♀）杂交羊以及利用湖羊培育的鲁中肉羊FecB基因的不同基因型产羔数间均存在极显著差异（P <0.01）。这不仅展示了FecB基因对于绵羊产羔数的重要影响,也显示出通过引入本土绵羊FecB基因改良肉用品种繁殖力的可行性和潜力。     

应用Cas9 RNPs进行绵羊FecB基因型检测的可行性研究

为了研究Cas9 RNPs用于绵羊FecB基因分型的可行性，试验以FecB基因BB、B+、++型的绵羊个体为试验动物提取基因组DNA。基于Cas9 RNPs的体外DNA定点内切酶活性，用FecB基因靶位点的特异性引物扩增产物作为底物，利用大肠杆菌共表达纯化获得Cas9 RNPs,对不同FecB基因型目标样本进行酶切检测。结果表明：SDS-PAGE电泳结果显示，在130～180 kD之间有一条与预期大小相符的特异蛋白条带；3种基因型的靶DNA均被切割为185 bp和368 bp两个片段；绵羊FecB++型成纤维细胞Cas9 RNPs电转染的突变检测结果显示，纯化的两个Cas9 RNPs都具有基因组编辑活性。说明本研究获得的Cas9 RNPs在体外和细胞内都具有良好的酶活性，但未能区分绵羊FecB基因型。     

宁夏滩羊体重模型的建立及相关分析

本研究测定了宁夏滩羊的3个体尺性状,并通过SAS软件分析了它们与体重间的相关关系、对体重的直接和间接影响以及对体重的决策程度,并建立了体重与体尺的最优回归模型.结果表明,胸围和体长是影响滩羊体重主要的体尺指标.根据各项分析建立最优回归模型为:Y=0.29214X1+0.64096 X2-34.98122,X1表示体长,X2表示胸围.该研究为品种选育和种质资源鉴定提供理论依据.     

绵羊多羔主效基因FecB高通量检测方法的建立及应用

基于前期分型基础,为了更进一步提高分型的效率和准确性,本试验建立了Taqman探针和SNaPshot两种高通量FecB突变分型方法。结果显示,与传统的PCR-RFLP和PCR-SSCP分型方法相比,这两种高通量分型方法在节省检测成本的同时,大大缩短了检测周期,并在检测效率上也有了大幅度的提高,对利用FecB进行分子育种具有潜在的应用价值。自2003年至今,本实验室应用这两种方法对10个中国本地绵羊品种、3个培育品种以及一些杂交群体的23 264只绵羊的FecB频率进行了检测,结果显示,湖羊和小尾寒羊携带FecB基因的频率最高,小尾寒羊FecB基因的B等位基因频率为0.432~0.833。跟踪以小尾寒羊作为母本和杜泊羊级进杂交后代群体发现,随着杂交的进行FecB基因在培育的鲁西黑头肉羊中的B等位基因频率提升到了0.432,但在横交固定阶段有所下降。本研究所得结果可为今后在肉用绵羊品种多羔改良和多羔肉用新品种培育过程中通过引入FecB基因提高繁殖性能提供参考数据。     

鹿流行性出血病病毒实时荧光PCR检测方法的初步建立

利用鹿流行性出血病（EHD）病毒核酸的保守靶序列（VP7）,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了EHDV荧光定量RT-PCR技术,并进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价。结果显示,该技术可有效检出EHD-1、EHD-2、EHD-4、EHD-7型病毒,与蓝舌病病毒（BTV）等病毒无交叉反应;对阳性模板（重组质粒）的检测灵敏度为1个copies;重复检测CV〈5%。因此,所建立的EHDV TaqMan/荧光定量RT-PCR方法可为鹿流行性出血病病毒检测提供一种快速、可靠的病原检测手段。     

牛白血病病毒LUX^TM实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立

采用LUXTM新型荧光PCR技术原理,设计并合成1对单标记LUXTM荧光引物.建立了LUXTM荧光PCR和RT-PCR方法,可快速检测牛白血病病毒(BLV)前病毒DNA和病毒RNA.结果显示所建立的LUXTM荧光PCR/RT-PCR体系可特异检测牛白血病病毒核酸,而对蓝舌病、牛病毒性腹泻-粘膜病、水泡性口炎、口蹄疫、牛流行热、牛传染性鼻气管炎等病毒核酸以及牛结核分支杆菌、大肠杆菌、健康动物组织核酸扩增均呈阴性反应.敏感性实验表明LUXTM荧光RT-PCR对RNA前病毒的检测敏感性达0.49 ng/μL,荧光PCR对pTblv-gp51重组质粒的检测敏感性可达0.138拷贝,比OIE规程的巢式PCR方法高104倍以上.采用该方法从血清学阳性临床牛血清中检出BLV阳性样品.     

羊源性成分LAMP检测方法的建立

根据羊cyt B基因设计3对特异性引物,运用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统,以LAMP荧光检测方法为基础,建立了检测羊源性成分的LAMP方法,并对该方法进行了反应体系和条件的优化。试验结果表明:该方法操作简单、特异性好;灵敏度比普通PCR方法高100倍,比q PCR方法低10倍,达到5.928×10-3μg/μL;反应时间短,最快10 min即可完成反应。     

鲁中肉羊育种中FecB突变应用效果分析

为评价FecB突变在鲁中肉羊培育中的应用效果,本研究首先利用TaqMan探针高通量分型技术对2295只鲁中肉羊FecB基因进行分型,统计FecB基因在鲁中肉羊群体中的分布情况,然后结合253只母羊的产羔数据和865只初生羔羊、83只3月龄母羔羊的体尺体重数据分析FecB基因对鲁中肉羊产羔数和早期生长发育的影响。群体遗传学分析表明:鲁中肉羊群体存在AA(++)、AG(B+)和GG(BB)3种FecB基因型,在新品种培育过程中突变纯合子频率逐年增加,且表现为中度多态性(0.25<多态信息含量<0.5);卡方适合性检验发现,FecB突变位点向Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)转变;BB型母羊平均产羔数高于++型(P<0.01);BB型初生羔羊的体重低于++型(P<0.01),BB型初生公羔的体高、胸围、胸宽、胸深和初生母羔的胸深和管围低于++型(P<0.05),B+型3月龄母羔的管围低于++型(P<0.05)。结果显示,FecB突变显著提高了鲁中肉羊的产羔数,但对初生羔羊的生长发育存在一定的逆增长效应。     

绵羊FecB基因遗传多样性及其产羔数的关联分析

FecB是19世纪80年代在布鲁拉美利奴（Booroola Merino）绵羊中发现的能增加排卵数和产羔数的一个常染色体突变基因,是在绵羊中识别出的第一个高繁殖力主效基因。本研究利用PCR-SSCP以及PCR-RFLP方法对湖羊、小尾寒羊、阿勒泰羊、洼地绵羊共470只的FecB基因进行单核苷酸多态性分析,验证FecB基因为绵羊的高繁殖力的主效基因,并以洼地绵羊为研究对象,检验FecB基因是否为洼地绵羊高繁殖力的主效基因。实验结果表明上述两种方法均能准确判型,稳定可靠性良好,并且判断的结果一致。研究结果显示：上述4个绵羊品种均携带FecB突变,且能证明FecB基因为洼地绵羊高繁殖力的主效基因。     

FecB基因在5个中国地方绵羊品种中的多态性及其与产羔数的关联分析

为解析中国地方绵羊品种产羔数差异形成的遗传学机制,以5个不同繁殖力的中国地方绵羊品种(湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊和多浪羊)为研究对象,利用PCR-RFLP技术检测FecB基因的多态性,比较不同繁殖力群体间FecB的分布情况,并与其产羔数进行关联分析。结果显示:湖羊群体中存在BB、B+、++三种基因型,藏羊、蒙古羊及阿勒泰羊群体中仅存在B+和++两种基因型,多浪羊群体中仅存在++基因型。湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊及多浪羊群体中BB、B+及++基因型频率依次是0.69、0.28、0.03,0.00、0.13、0.88,0.00、0.08、0.92,0.00、0.08、0.92和0.00、0.00、1.00;B等位基因频率由高到低依次为湖羊>藏羊>蒙古羊=阿勒泰羊>多浪羊。湖羊、藏羊、蒙古羊和阿勒泰羊中该位点He和PIC分别为0.29、0.25,0.12、0.11,0.08、0.07和0.08、0.07,且在以上4个品种中BB和B+基因型个体产羔数比++基因型个体高(P<0.01),BB基因型个体和B+基因型个体之间无差异(P>0.05)。由此可推断,FecB或许是决定绵羊产羔数的主效基因,亦或是与其存在密切相关的标记基因,可助力绵羊产羔数性状MAS技术和为多胎绵羊新品种(系)培育提供素材。     

滩羊成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究

试验以滩羊耳缘组织为材料,采用组织块贴壁培养法和细胞冷冻保存技术构建了35个滩羊成纤维细胞系,并对其进行了形态学、生长动力学、细胞活力测定、核型分析、微生物检测和荧光蛋白报告质粒(PEGFP-N3)基因转染等生物学特性的研究。结果表明,细胞群体倍增时间(PDT)约为36h,细胞冻存后活力为95.8%,细胞染色体中二倍体(2n=54)占主体,镜检细胞的百分比约为97.5%。细菌、真菌、病毒和支原体检测结果为阴性,该细胞库的各项指标均达到ATCC细胞系鉴定标准。     

滩羊公羊特异性RAPD标记的研究

利用混合样本分析方法对滩羊进行了RAPD分析 ,筛选了 6 0种随机引物 ,结果发现OPB17 32 0这一扩增片段只出现在公羊的混合样中 ,进一步对 5 0只滩羊进行逐个检测 ,发现 2 1只公羊均出现了OPB17 32 0这一DNA片段 ,而 2 9只母羊无一出现此条片段 ,据此推断OPB17 32 0为滩羊公羊的特异性RAPD标记。这一发现为滩羊胚胎性别鉴定和Y染色体上基因的研究提供了新的方法和标记参考座位。     

FecB基因对绵羊生产性能影响的研究进展

FecB基因是发现最早的具有促进排卵的多胎基因,自从在澳大利亚布鲁拉美利奴羊(Booroola Merino)上发现该基因以来,人们利用Booroola Merino开展了大量杂交试验,并在各国绵羊品种中相继开展了寻找FecB基因的工作,在基因多态性与母羊繁殖性状关联分析方面做了大量研究。文章从FecB基因的品种分布及对繁殖性能(排卵数、产羔数、繁殖规律)、肉用性能(生长发育、肉品质)和产毛、产奶等生产性能方面的影响进行了系统总结,并对该基因的利用提出了建议和展望。     

滩羊多羔性能的RAPD标记研究

用RAPD技术和混合分离分析 (BSA)方法对双羔家系的 2 6只滩羊和对照系的 2 5只单羔滩羊进行了RAPD检测。发现 :OPB1 7-530、OPB1 9-92 6和OPB2 0 -1 4 2 6三条DNA片段仅出现在多羔家系的母本及多羔母本与单羔父本杂交产生的部分后代中 ,而在对单羔羊的逐个检测中未出现这三条片段。据此可以推断三个DNA分子标记与多羔性能主基因可能相关。作者系统优化组合出了能使滩羊基因组DNA稳定扩增的RAPD体系     

放牧与舍饲对滩羊生产性能的影响

对舍饲和放牧条件下,滩羊母羊和羔羊生产性能进行了研究。结果显示:舍饲条件下滩羊母羊的繁殖率和繁殖成活率比放牧条件下有一定程度提高。羔羊的初生重、二毛期体重、平均日增重及肩部毛股弯曲数则有明显地提高,经t检验舍饲与放牧之间均呈极显著差异(P<0.01)。而羔羊成活率、肩部毛股长度和花穗评分等指标二者之间无明显区别,经t检验差异均不显著(P>0.05)。说明舍饲在提高滩羊生产性能方面具有一定作用,同时对其品种特征无不良影响。     

宁夏滩羊遗传资源保护利用情况调研

滩羊被列入国家畜禽遗传资源品种名录,是国家级畜禽遗传资源保护品种。 滩羊产业列入宁夏“六特”产业之一,对宁夏中南部地区促农增收、乡村产业振兴发挥了重要作用。笔者通过调查宁夏滩羊遗传资源保护利用现状,总结出宁夏探索滩羊种质资源保护和开发利用的有效途径,为资源优势向产业优势转变提供参考依据。