中华稻蝗Knickkopf(Knk)基因分子特性和生物学功能

基于中华稻蝗转录组数据库,采用生物信息学方法搜索获得1条OcKnk基因全长cDNA序列,采用qRT-PCR检测其组织部位表达特性和其在表皮发育过程中表达情况,明确其分子特性,采用RNAi技术结合表型观察,研究其对中华稻蝗蜕皮和生长发育的影响,以明确其生物学功能。组织部位表达结果显示其在中华稻蝗体壁、前肠和脂肪体表达最高,发育表达结果显示其在表皮不同发育日龄均有表达,且在蜕皮前期和后期表达显著高于其他日龄。生物学功能研究表明,注射dsRNA后,多数虫体难以成功蜕去旧表皮,导致死亡,少部分可蜕至下一龄期,但活动力较低,行动缓慢,最终死亡。研究结果表明OcKnk参与昆虫生长发育和蜕皮过程,可作为重要靶标基因,为下一步害虫防治提供理论基础。     

暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpCDA5基因的细胞表达及活性分析

cDNA文库免疫筛选到编码暗黑鳃金龟幼虫几丁质脱乙酰酶HpCDA5基因,序列分析表明HpCDA5含有1个几丁质脱乙酰酶结构域,属于Group V类CDA蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pFastBac-HpCDA5,转染昆虫细胞sf9,Western blot分析表明HpCDA5在昆虫细胞sf9中成功表达42 kDa的蛋白。利用qRT-PCR方法分析HpCDA5基因组织表达,结果显示HpCDA5基因在中肠中表达最高,为中肠特异表达蛋白。几丁质结合活性表明HpCDA5蛋白只能被强洗脱剂洗脱,具有很强的几丁质结合活性。本研究通过对暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpCDA5的生化特性研究,为进一步明确HpCDA5的生理功能提供理论依据,并为以HpCDA5蛋白为靶标的暗黑鳃金龟生物防治提供支撑。     

双叉犀金龟表皮蛋白Td14144表达纯化及性质研究

表皮蛋白是昆虫表皮的重要组成成份，在昆虫的生长发育过程中起着重要作用，有可能成为农业害虫的防治靶标。双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus是铁皮石斛的一种重要害虫，且对其表皮蛋白的研究较少。本文通过研究双叉犀金龟表皮蛋白Td14144的表达纯化及与几丁质结合的相关性质明确Td14144功能的重要性。根据双叉犀金龟转录组测序数据，利用RT-PCR获得表皮蛋白Td14144基因（GenBank登录号：MZ463195），并对其进行生物信息学分析。序列分析表明表皮蛋白Td14144属于CPR家族中RR-2亚族，含有R&R保守结构域；系统进化分析结果表明，Td14144与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的AgCP的亲缘关系最近。随后将基因片段与pET-28a载体同源重组构建表达载体pET28a-14144，在大肠杆菌Escherichia coli BL21中原核表达，并使用金属螯合层析进行分离纯化，SDS-PAGE及Western blot验证重组蛋白的表达纯化，成功获得95%以上纯度的Td14144蛋白。利用几丁质结合试验评估Td14144与不同类型几丁质结合的能力，发现Td14144可以与壳聚糖、α-几丁质、β-几丁质和胶体几丁质结合，其中对壳聚糖和α-几丁质的结合能力最强。     

茄青枯拉尔氏菌Rs-T02在3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯作用下的转录组分析

 本文利用Illumina HiSeq测序技术,对在3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯(methyl gallate,MG)作用下和对照条件下的茄青枯拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)Rs-T02菌株的转录组进行测序分析,并用GO和KEGG Pathway富集化分析的方法分析差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的功能和代谢通路,以初步了解MG对R. solanacearum作用的分子机制。结果表明,MG处理组和对照组的差异表达的基因有2 172个,其中1 037个基因上调,1 135个基因下调。随意挑选10个DEGs进行qRT-PCR验证,其基因表达趋势与转录组测序结果一致。通过对差异表达基因的功能和代谢通路分析发现,与细胞结构相关的肽聚糖水解酶、3-磷酸甘油酰基转移酶和UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸连接酶等蛋白的编码基因上调表达,蛋白YeaQ、外膜蛋白W和外膜蛋白BamE等蛋白的编码基因下调表达;与能量代谢相关的ATP合成酶结构蛋白、辅酶Q亚基和细胞色素等蛋白的编码基因上调表达,甘油醛-3-磷酸脱氢酶、甘油醛脱氢酶和异柠檬酸裂解酶等蛋白的编码基因下调表达;与致病性相关的gspD、gspE和gspF等基因上调表达,hrpY、hrpB和gspG等基因下调表达;与细菌抗药性相关的氨基酸的氨酰-tRNA连接酶、核糖体RNA小亚单位甲基转移酶G基因和多重药物外排泵亚基AcrA等蛋白的编码基因上调表达;与细菌运动性相关的flgB、flgC和flgD等基因上调表达。推测MG对Rs-T02菌株的抑菌机制可能与MG影响病菌的细胞结构和能量代谢相关基因的差异表达有关;同时,MG影响病菌T3SS和T2SS相关基因的差异表达,从而影响细菌的致病力。此外,3-磷酸甘油酰基转移酶基因、核糖体RNA小亚单位甲基转移酶G和多重药物外排泵亚基AcrA基因等上调表达,可能与病菌抵抗MG的机制有关。     

棉铃虫表皮蛋白基因的克隆、序列及表达分析

昆虫表皮蛋白能帮助昆虫抵御外界不良环境,在昆虫的生长发育中起重要作用。基于棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）转录组数据信息克隆获得表皮蛋白基因的cDNA序列,通过Real-time PCR探讨棉铃虫各龄期和组织表皮蛋白的相对表达量。在棉铃虫体内得到HACPFL67 cDNA开放阅读框（KP072002）612 bp,命名为HACPFL67,编码204个氨基酸,分子量约为20.892 kDa,等电点7.275,序列包含有表皮蛋白的保守序列,与鳞翅目夜蛾科昆虫烟芽夜蛾Heliothis virescens和斜纹夜蛾Spodoptera litura等亲缘关系较近,与烟芽夜蛾氨基酸序列相似性高达83%。棉铃虫HACPFL67在不同发育阶段和组织中表达存在很大差异,其中4龄幼虫在各个发育阶段表达最高。综上所述,棉铃虫HACPFL67相对表达量在不同组织和发育时期存在一定差异。     

本氏烟NbWRKY40亚家族转录因子抗病相关功能研究

 植物WRKY类转录因子的IIa亚类广泛参与调控植物的生物胁迫和非生物胁迫过程。本研究根据拟南芥和普通烟中具有抗病和抗胁迫功能的IIa亚类WRKY40转录因子的序列,利用基因同源克隆法,获得本氏烟中NbWRKY40基因。序列分析表明在本氏烟中有5个属于IIa亚类的基因,其序列之间具有高度相似性。qRT-PCR检测发现NbWRKY40基因是受寄生疫霉侵染诱导上调表达的基因,通过VIGS技术研究该类基因在本氏烟中的抗病相关功能,用半活体营养型寄生疫霉进行抗病性试验,结果表明NbWRKY40基因的沉默降低了本氏烟对寄生疫霉的抗性,且在侵染点的细胞坏死程度增强,过氧化氢积累和胼胝质沉积都明显减少。NbWRKY40基因沉默同样降低了本氏烟对死体营养型灰霉菌的抗性。检测NbWRKY40基因沉默后4个不同抗病信号通路下游基因的表达,发现基因沉默导致参与抗病和SA途径的PR1b、PR2b基因受疫霉侵染诱导表达的水平明显下降。综上,推测NbWRKY40基因可能依靠SA介导的信号通路参与调控本氏烟抗病性。     

基于转录组分析的哈茨木霉thga3基因功能研究

哈茨木霉Trichoderma harzianum Th-33的Ⅲ型Gα亚基Thga3可能参与调控木霉菌的生长、产孢、几丁质酶活性、疏水性等生物学过程。为进一步明确其功能,本研究采用Hiseq2500（Illumina）测序平台,对野生菌Th-33和thga3基因敲除突变株△thga3进行转录组测序,分析其G蛋白信号系统、细胞壁降解酶类和产孢相关基因的差异表达。与野生菌相比,△thga3有3个G蛋白偶联受体基因发生下调表达,3个几丁质酶基因以及产孢调控基因brlA下调表达,1个G蛋白信号调控蛋白RGS1上调表达。推测thga3可能通过调控brlA的表达正调控产孢;通过调控疏水蛋白基因Tha_09745的表达调控菌丝疏水性。此外,通过调控几丁质酶基因的表达、G蛋白信号网络中其他蛋白的表达,影响菌株的拮抗和重寄生能力以及其他生物学特性。本研究为进一步探索G蛋白信号途径调控木霉菌生防特性及其机制奠定了基础。     

心叶烟NPR1基因全长cDNA序列的克隆及表达分析

 NPR1(non-expressor of pathogenesis-related gene 1)基因在拟南芥系统获得抗性中起着关键作用,可调控拟南芥植株广谱抗性的发生。本文报道了从心叶烟中克隆NPR1同源基因(NgNPR1)及其表达特性的研究结果。NgNPR1 cDNA全长2253 bp,编码588个氨基酸。将NgNPR1基因组全长与cDNA序列进行比对发现,NgNPR1基因组DNA含有4个外显子和3个内含子。Southern杂交分析表明,在心叶烟基因组中NgNPR1为单拷贝基因。采用绿色荧光蛋白在洋葱表皮瞬时表达的试验,证明了NgNPR1蛋白在水杨酸诱导时会从细胞质转运到细胞核中。Northern杂交分析发现,NgNPR1基因可以被与植物抗病相关的信号分子如水杨酸、茉莉酸甲酯、过氧化氢和乙烯所诱导。进一步研究发现,植物病原物如赤星病菌、青枯病菌和烟草花叶病毒对心叶烟植株的侵染也会使NgNPR1表达量增加。这些结果表明,NgNPR1基因在心叶烟植株抵御病原物侵染过程中可能起着重要作用。     

水稻白叶枯病菌群体感应系统对T3SS基因表达的调控作用分析

 为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)利用DSF信号群体感应(QS)系统对毒性表达进行调控的机理,本研究对编码QS的rpf基因进行了分子鉴定, 分析了Δrpf基因突变体在水稻叶组织中的种群量变化, 利用RT-qPCR方法定量测定了编码T3SS的hrp基因转录本以及rpf基因自身表达。结果表明,rpfF、rpfC和rpfG基因与几种主要植物病原黄单胞菌同源序列高度保守;RpfF是烯脂酰辅酶A水合酶家族成员之一,RpfC含有组氨酸磷酸激酶结构域(HisKA)和磷酸受体结构域(REC),RpfG含有REC和HD-GYP结构域;Δrpf突变体在水稻叶组织中的种群量及其扩展能力均明显下降; hrp基因转录显著地受到QS调控;rpf基因表达与Xoo种群密度密切相关。因此,Xoo QS系统显著地调控了hrp基因的表达,在QS与T3SS表达之间存在一个信号通路。     

表达aiiA基因多黏芽胞杆菌工程菌构建与功能分析

AiiA蛋白能够专一性地水解革兰氏阴性菌分泌的信号分子,从而抑制其致病基因的表达,减弱致病性。根据NCBI上公布的蜡状芽胞杆菌ATCC14579的aiiA序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis NBIN-861中扩增得到aiiA基因（GenBank登录号：MG704113）,全长基因约750 bp。将aiiA基因插入大肠杆菌表达载体pET-28a和芽胞杆菌表达载体pBMB1A中,构建重组表达载体pETaiiA和pBMaiiA,pETaiiA转化大肠杆菌BL21（DE3）,pBMaiiA转化多黏类芽胞杆菌NR1,获得重组工程菌BLaiiA和BPaiiA。SDS-PAGE和蛋白质谱鉴定表明AiiA蛋白均成功表达,利用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有水解N-酰基高丝氨酸内酯活性。其中纯化的AiiA蛋白（1.13 mg/mL）和重组菌BPaiiA浓缩的发酵上清液中的AiiA蛋白活性较高（透明圈直径分别为16和18 mm）,马铃薯致病性试验和抑菌试验结果表明该蛋白对胡萝卜欧文氏菌具有一定的抗病活性,但不具有抑菌活性。多黏芽胞杆菌NR1和重组菌BPaiiA发酵产生的抑菌物质含量均为1.2%～1.3%,具有良好的抑菌效果。本研究为构建更有效的生物防治菌株奠定了理论基础。     

GLUT基因表达对异色瓢虫幼虫能量代谢的影响

异色瓢虫Harmoniaaxyridis是一种重要的捕食性瓢虫,可捕食多种蚜虫及其他害虫。目前,已被世界各地广泛用于农业害虫的生物防治。为实现短时间低成本快速扩繁异色瓢虫,人们对异色瓢虫人工饲料的配方进行了大量研究,使其更好地完成瓢虫的生长发育。实验室前期筛选出添加海藻糖和葡萄糖的人工饲料,能增加幼虫体质量、缩短瓢虫产卵前期、提升产卵量和卵孵化率等,有助于瓢虫的生长发育和繁殖。本文以饲喂蚜虫组为对照组,对2个葡萄糖转运蛋白基因（GLUT1和GLUT4）在异色瓢虫发育各阶段的表达情况进行了研究,并通过RNA干扰技术,进一步探究了注射ds GLUT1或ds GLUT4后异色瓢虫体内能量代谢相关基因的表达情况和酶活性变化,从而证明该基因与异色瓢虫幼虫能量代谢的调节功能密切相关。结果表明：注射ds GLUT1和ds GLUT4显著影响了TPS、TRE2、TRE2-like等基因的表达,同时发现在干扰GLUT1和GLUT4在幼虫体内的表达后,糖原、葡萄糖、海藻糖等糖类物质含量均有所下降。表明GLUT1和GLUT4在异色瓢虫幼虫的繁殖中起到一定的调控作用。研究结果有助于为未来进一步研究关键基因表达...     

蝗虫生物防治发展现状及趋势

自20世纪60年代以来,作为有害生物综合治理主要手段的生物防治取得了很多突破性成果,生物防治的比例逐年提高,其支配地位越来越明显。蝗虫是世界性的重大害虫,给发生地区的农牧业生产带来巨大威胁和损失。在蝗虫生物防治中,人们早期主要开展寄生性天敌和植物源药剂等在防治蝗虫中的应用,当前防治蝗虫的病原微物的研发和应用占据了越来越重要的地位,如真菌、蝗虫微孢子、杀蝗金线虫、蝗虫痘病毒、苏云金杆菌、类产碱假单胞菌、蜡状芽胞杆菌等可有效控制蝗虫的生物防治因子,这些杀蝗生物制剂在蝗虫防治中发挥了重要作用。但是与速效的化学农药相比,生物防治制剂快速致死作用较低,对种群的密度调节较慢,特别是可以完全替代化学农药的应急治蝗生物制剂品种相对较少、剂型相对较为单一、成本较高加之防治效果受环境影响较大等问题,在一定程度上制约了蝗虫生物防治技术的发展和应用。但生物防治制剂的环境友好、生态安全和对靶标不易产生抗性等优点越来越被重视,决定了生物防治制剂必然成为全球农药产业发展新趋势,推动了蝗虫生物防治朝低耗、多元化品种和绿色剂型方向发展,如可以垂直传播的蝗虫微孢子生物制剂、蝗虫信息化合物制剂、防蝗真菌制剂与经典的蝗虫天敌生物制剂和生态调控技术等协同应用,速效与长效结合,确保蝗虫的可持续控制。     

亚洲玉米螟表皮蛋白CPR9的表达纯化及与几丁质的相互作用

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是我国玉米最重要的害虫，了解亚洲玉米螟表皮形成的机制将有助于对其开展生物防治。表皮蛋白和几丁质是构成昆虫表皮的两种主要成分，因此研究两者的相互作用对于阐明昆虫表皮形成机制具有关键意义。CPR9是亚洲玉米螟体壁表皮转录组中相对丰度最高的表皮蛋白基因。序列分析发现CPR9属于CPR家族中RR-1亚家族的表皮蛋白，含有R&R结构域，可能是通过结合几丁质来发挥功能。为了研究CPR9与几丁质的相互作用，本研究利用pET-SUMO载体实现了SUMO-CPR9融合蛋白的可溶表达，并通过SUMO蛋白酶处理及两次金属螯合亲和层析纯化了CPR9，平均收率为5 mg/L。几丁质结合试验发现，CPR9对不同类型的几丁质的结合具有选择性。CPR9对α-几丁质结合能力很强，对胶体几丁质结合能力较强，但不与β-几丁质结合。脱乙酰几丁质（壳聚糖）结合试验发现，CPR9能与脱乙酰几丁质结合并使其发生团聚。圆二色光谱分析表明，CPR9在结合脱乙酰几丁质后，其二级结构中平行β折叠和β转角比例上升，反平行β折叠及无规卷曲比例下降。本研究发现了CPR家族表皮蛋白与不同类型几丁质的结合存在特异性，而且在结合过程中会发生结构变化，有助于进一步了解昆虫表皮的形成机制。     

两株杀虫真菌对陕西榆林草原蝗虫的防治效果

本研究对两株杀虫真菌金龟子绿僵菌QL-107和球孢白僵菌GYS-13对东亚飞蝗的毒力进行了测定,并利用其对榆林草原蝗虫进行了田间防治试验.通过室内生测发现球孢白僵菌GYS-13和金龟子绿僵菌QL-107对东亚飞蝗均具有较强的毒力,田间防治试验证明,两株杀虫真菌在山地草原对蝗虫综合防治效果达到75％以上,特别是球孢白僵菌...     

黏虫几丁质酶MsCHT7基因的克隆、表达及蜕皮激素的调控

几丁质酶是几丁质水解的关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用。本试验通过高通量转录组测序获得黏虫几丁质酶基因cDNA序列MsCHT7（GenBank登录号MG551526）。cDNA全长3360 bp,包含一个长度为2970 bp的开放阅读框,编码989个氨基酸,具有1个糖苷水解酶18家族高度保守序列,2个Glyco_18催化结构域和1个几丁质结合结构域ChtBD2。通过基因表达水平研究发现,黏虫MsCHT7基因在不同发育阶段和不同组织中均有表达,且具有差异性。预蛹期和表皮MsCHT7基因表达量最大,蛹期最后1 d和成虫表达量较高,且幼虫各龄期最后1 d表达量均高于第1 d表达量。20E（20-羟基蜕皮酮）处理幼虫后,不同时间点MsCHT7基因表达量存在显著差异,在1～24 h基因表达量随时间逐渐升高,24 h时最高,之后表达量迅速降低。4种不同浓度20E处理后,MsCHT7基因表达量存在一定差异,当浓度为10 μg/μL时,MsCHT7基因表达量最大。通过生物学观察发现,不同浓度20E处理后5龄幼虫蜕皮时间均提前。由于MsCHT7基因表达量受蜕皮激素调控,MsCHT7可能在黏虫蜕皮过程中发挥一定作用。     

核转运蛋白SsKapM涉及调控甘蔗鞭孢堆黑粉菌的菌丝生长

 核转运蛋白是真核生物中负责大分子物质进出核孔的重要载体,承担着维持正常生命活动的任务。本研究通过序列同源比对鉴定了甘蔗鞭孢堆黑粉菌核转运蛋白编码基因,根据注释命名为SsKapM。使用同源重组方法对SsKapM进行敲除后,发现ΔSsKapM突变体担孢子的生长速率、适宜的生长温度、有性配合/菌丝生长等方面均发生改变。研究中还发现SsKapM缺失会导致双核菌丝体对高浓度磷酸盐敏感性下降。同时,通过转录组数据分析探究SsKapM的功能机制。结果表明SsKapM调控热激反应、磷酸盐信号与转运通路等基因的表达。这一发现将为甘蔗鞭孢堆黑粉菌的防治提供新的思路。