玉米ZmSTP1和ZmAAP2基因启动子区域结合蛋白的检测

【目的】植物特异性转录因子NLPs(NIN-like proteins)是硝酸盐响应顺式元件(NRE)的结合蛋白,在硝酸盐调控的下游基因表达中起转录激活作用。玉米转运蛋白ZmSTP1和ZmAAP2在植物碳氮产物的运输和卸载过程中发挥作用,且基因启动子区域均含有一个硝酸盐响应顺式元件。本研究旨在证实玉米ZmNLPs家族成员ZmNLP3、ZmNLP4是否为ZmSTP1和ZmAAP2基因启动子中NRE的结合蛋白。【方法】以玉米B73为试验材料,首次利用酵母单杂交技术检测ZmNLP3、ZmNLP4转录因子分别与ZmSTP1和ZmAAP2基因启动子区域的相互作用。【结果】在线预测网站Plantcare对ZmSTP1和ZmAAP2基因转录起始位点上游2000 bp序列分析表明,位于2个基因转录起始点上游-577～-589 bp和-909～-921 bp区域均包含一个序列长12 bp的NRE元件,结构分别为5′-ATTTAATACTCA-3′和5′-ATATATAAGTCA-3′;诱饵菌株AbA^r基因表达检测显示,能抑制诱饵菌株Y1H(pAbAi-ZmSTP1)和Y1H(pAb...     

玉米Na~+/H~+逆向转运蛋白基因ZmSOS1的克隆与鉴定

[目的]克隆玉米Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因,为研究此类基因在玉米非生物胁迫抗性机制中的功能奠定基础。[方法]采用电子克隆、RT—PCR、生物信息学方法,从玉米基因组中克隆1个质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因,并鉴定该基因编码产物的跨膜结构预测以及在盐胁迫下的表达模式等信息。[结果]利用电子克隆方法,从玉米中克隆出1个质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1;Zm-SOS1基因的开放阅读框长3411bp,编码1136个氨基酸;序列分析表明,ZmSOS1蛋白与拟南芥和水稻同源物AtSOSl、OsSOS1的氨基酸序列一致性分别为61％和82％;RT—PCR分析表明,ZmSOS1基因的表达可以被盐胁迫诱导增强,表明其可能在玉米耐盐性上发挥功能。[结论]ZmSDS1是一个公认的质膜型Na^＋／A^＋逆向转运蛋白基因,并可能参与玉米的非生物胁迫反应。     

钩藤UrLAMT基因及其启动子的克隆与分析

【目的】克隆钩藤(Uncaria rhynchophylla)中马钱苷酸甲基转移酶(loganic acid methyltransferase,LAMT)基因及其启动子,对UrLAMT基因的组织表达及其对生物和非生物胁迫的响应进行分析,并对UrLAMT及其启动子的生物信息学进行分析,为进一步研究UrLAMT转录调控奠定基础。【方法】基于钩藤的转录组数据设计引物,采用PCR从钩藤cDNA中克隆UrLAMT序列,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR,分析UrLAMT在钩藤不同组织(根、茎、叶、花、果实、钩)中的表达,以及对外源茉莉酸甲酯(MeJA)、遮光/复光胁迫的响应;利用FPNI-PCR技术克隆UrLAMT上游启动子序列,并验证其活性,结合酵母单杂交试验,分析相应转录因子与UrLAMT启动子的调控关系。【结果】克隆得到钩藤UrLAMT序列,其长度为1 137 bp,共编码378个氨基酸。UrLAMT蛋白质相对分子质量为42.64 ku,理论等电点为5.76,为亲水性蛋白,无信号肽,不含跨膜结构,定位在细胞质中;UrLAMT基因在钩藤叶中表达量最高,其次为根;UrLAMT均能响应MeJA和光;其与短小蛇根草和长春花的进化关系较近。UrLAMT启动子序列长度为1 141 bp,除核心响应元件外还含有多个光响应元件,UrLAMT启动子在酵母中与光调控转录因子HY5存在相互作用。【结论】获得了UrLAMT基因及其启动子序列,其在钩藤叶中表达量最高,可能受光诱导。     

玉米Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1的克隆与鉴定（摘要）

[目的]研究玉米Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1的克隆与鉴定,为研究该基因在玉米逆境信号转导与生长发育中的作用提供参考。[方法]采用电子克隆、RT-PCR、生物信息学方法,从玉米基因组中克隆1个质膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因,并鉴定该基因编码产物的跨膜结构预测以及在盐胁迫下的表达模式等信息。电子克隆具体步骤：将水稻质膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白OsSOS1的氨基酸序列作为种子序列输入GenBank,对玉米基因组数据库和EST数据库进行tBLASTN分析,结果检索到含有候选基因的基因组序列AC186524和1批高度相似的玉米EST。为确定候选基因的编码区,将上述EST序列进行拼接,并将拼接所得的contig通过BLASTN分析定位到基因组序列AC186524中。为获得完整的编码区序列,利用与contig间隔区相对应的水稻OsSOS1蛋白的氨基酸序列,进一步对玉米基因组序列进行tBLASTN分析;同时,结合GENSCAN软件的基因预测结果,最终确定了候选基因的编码区序列。最后,通过比较编码区序列和基因组序列,确定ZmSOS1基因的外显子和内含子结构。[结果]利用电子克隆方法,从玉米中克隆出1个质膜型Na~＋/H~＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1（编码序列反向互补于AC186524中的78 964～96 731 bp处）;ZmSOS1基因的开放阅读框长3 411 bp,编码1 136个氨基酸的蛋白。ZmSOS1蛋白的理论等电点pI=6.46,分子质量为126.2kDa,理论半衰期大于10 h,不稳定参数为41.74,属于不稳定蛋白。通过在线软件TMHMM2.0和TMPRED分析,发现ZmSOS1蛋白含有12个跨膜结构区,且有一个长的高度亲水性的羧基端尾巴,暗示质膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白在进化上是较为保守的。ZmSOS1基因至少含有21个内含子,如果将ZmSOS1基因的结构分别与水稻、拟南芥和苔藓植物（Phycomitrella patens）的同源基因OsSOS1、AtSOS1、PpSOS1相比较,可以发现质膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因编码区的结构是比较保守的且研究发现质膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因在进化过程中很可能发生过内含子丢失事件;序列分析表明,ZmSOS1蛋白与拟南芥和水稻同源物AtSOS1、OsSOS1的氨基酸序列一致性分别为61%和82%,鉴于ZmSOS1的氨基酸序列与同源序列的多重比对,猜想质膜型Na~＋/H~＋逆向转运蛋白在进化过程中,N-端序列可能承受着较为严谨的净化选择压作用,而C-端序列所受净化选择压则相对松弛;RT-PCR分析表明,ZmSOS1基因的表达可以被盐胁迫诱导增强,表明其可能在玉米耐盐性上发挥功能。[结论]ZmSOS1基因可能参与玉米的渗透胁迫反应。     

茄子SmCOL5基因在花青素生物合成中的功能分析

通过同源克隆的方法从茄子中分离出SmCOL5基因,并对其蛋白功能进行分析。结果表明:SmCOL5蛋白定位于细胞核中;SmCOL5蛋白可与组成型光形态建成SmCOP1蛋白互作,说明SmCOL5蛋白的功能受到光的调控;且SmCOL5蛋白能与花青素生物合成途径中重要的结构基因SmF3H、SmCHS的启动子结合。推测SmCOL5基因在接收到光受体信号后参与茄子花青素生物合成的调控途径。     

惠农单1号玉米的选育

惠农单1号是贵州省毕节市惠农玉米育种科学研究所用自交系惠921作母本,自交系惠941作父本组配而成的白粒型单杂交玉米新品种.该品种生育期151 d,区域试验单产为613.57kg/667m2,比对照毕玉6号增产9.8％;生产试验产量505.94 kg/667m2,比对照增产17.17％;品质优,中抗大斑病和茎腐病,感丝...     

玉米氨基酸转运蛋白ZmAAP基因的克隆及序列分析

克隆得到玉米中AAP基因的核酸序列,通过对其编码蛋白理化性质、跨膜区、高级结构等方面进行生物信息学分析,为进一步深入研究玉米AAP基因的功能提供理论依据。采用同源克隆技术得到含有完整编码阅读框的一段玉米未知功能基因,使用ProtParam、ProtScale、TargetP v1.01 server、SignalP4.1 server、TMHMM services v.2.0、SOPMA、Phyre2、DNAman等软件对该基因进行生物信息学分析。结果表明:克隆的玉米未知功能基因全长cDNA序列为1 396 bp,包括1 212 bp的开放阅读框,编码的氨基酸数403个,分子质量42.88 kD,理论等电点9.24,正、负电荷残基总数分别是18和30,在组成蛋白编码的20种氨基酸中丝氨酸所占比例最高,为13.4%,而组氨酸比例最低,为1.0%。AAP蛋白包含信号肽,剪切位点位于38、39残基处;编码区核苷酸序列与其他作物对比后发现,与大麦AAP1基因的相似性最高,相似度为87%。通过生物信息学分析初步证明从玉米中克隆的基因为AAP的核酸序列,命名为ZmAAP。     

优质蛋白玉米黔单11号引种高产栽培技术

通过对优质蛋白杂交玉米良种黔单11号引种高产栽培试验，筛选出适宜我区生态条件下的优化栽培技术方案．提出了高产栽培技术，为该品种在我区的应用提供指导。     

杂交玉米新品种惠农单2号的选育

为选育适宜贵州生态区种植的高产、稳产、优质杂交玉米新品种,毕节市七星关区惠农玉米育种科学研究所以外引系 B047作母本,自育系惠0901作父本组配育成惠农单2号（惠农试11）杂交玉米新品种。惠农单2号在2012－2013年贵州省玉米区域试验中,2年平均单产682．9 kg／667m2,比对照（贵单8号）增产12．5％,生育期129 d,株高261 cm,穗位高116 cm,穗长19．6 cm,穗行数15．9行,千粒重385 g,容重784 g／L,粗蛋白质9．14％,粗脂肪5．06％,粗淀粉72．91％,赖氨酸0．28％。该品种品质优良,具有高抗茎腐病等优点,于2014年6月通过贵州省农作物品种审定委员会审定（黔审玉2014006）。     

玉米病程相关蛋白1基因的克隆与表达分析

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从耐玉米穗粒腐病自交系R15中分离得到病程相关蛋白1(pathogenesis-related protein 1,PR1)基因的开放阅读框,命名为ZmPR1,测序结果显示该序列长为528bp,编码175个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.7ku.利用NCBI/Blastp和Genedoc软件进行同源性比对显示,ZmPR1基因编码蛋白与水稻、小麦、拟南芥等高等植物中的PR1蛋白相似性较高,且具有相同的富含半胱氨酸蛋白(cysteine-rich secretory protein,CAP)的保守结构域.将构建的重组载体pET32a(+)-ZmPR1在宿主菌Escherichia coli BL21中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,在不同的诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度下对诱导条件进行优化.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,ZmPR1基因的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.6mmol爛L-1,诱导温度28℃,且诱导时间对表达量影响不大.免疫印迹(Western blot)检测证实有39ku的融合蛋白表达,表明ZmPR1基因在大肠杆菌中已成功表达,这为蛋白纯化及单克隆抗体的制备提供了一定的基础.     

玉米脱水素基因家族的鉴定与分析

脱水素(dehydrin,DHN)属于LEA蛋白第二家族成员,是一种植物中广泛存在的亲水性蛋白,在干旱、低温和高盐等非生物胁迫的环境中起到重要作用。通过生物信息学方法对玉米全基因组DHN家族成员进行了鉴定,并进一步对其系统发育、基因结构、染色体定位和基因复制以及表达模式进行了系统分析。结果显示,在玉米DHN基因家族中共有5个家族成员,多物种系统发育进化树分析、基因结构以及基序分析都表明DHN家族成员在进化上具有高度的保守性。基因复制和物种间微共线性分析表明,在5个玉米DHN基因中存在着1对片段复制基因(ZmDHN1-ZmDHN2),玉米、高粱和水稻3个物种间存在2对直系同源基因(ZmDHN2-Sb04g032250.1,ZmDHN2-Os02g44870.1)。通过转录组表达数据分析表明,玉米DHN家族基因在不同发育时期具有不同的组织表达模式;同时,诱导表达模式分析表明ZmDHN基因的表达受到盐和干旱胁迫的显著诱导。该研究结果将为进一步鉴定玉米DHN家族重要的基因成员并对其开展功能分析奠定基础。     

玉米转Bt基因后代的抗虫性鉴定及其遗传分析

采用田间接虫鉴定与室内PCR扩增，对玉米4个遗传背景，2个不同回交世代转基因材料进行了抗虫性鉴定．结果表明：回交3代、4代转基因材料平均抗虫性与其阴性对照相比达到了显著或极显著水平，外源Bt基因在回交后代中符合孟德尔定律1:1的分离比例．在4个遗传背景共98株含Bt基因的单株中，田间抗虫性表现高抗73株，抗5株，中抗7株，感2株，高感11株，抗虫株率占86．7％．     

基于OsGS5的玉米同源基因ZmGS5的克隆

高产是玉米育种的重要目标,籽粒大小是决定籽粒产量的重要因子。OsGS5是水稻中已克隆的控制籽粒长度和千粒重的主效基因,编码丝氨酸羧肽酶。本研究利用OsGS5基因编码序列比对玉米同源EST序列,并对EST序列进行拼接,根据拼接后的EST序列设计3′-RACE基因特异引物,利用同源克隆的方法克隆出玉米同源基因的3′端基因片段,经测序发现该基因片段长度为981bp,功能注释后发现该基因编码丝氨酸羧肽酶,与水稻OsGS5基因编码蛋白具有高度同源性,将该基因暂时命名为ZmGS5。     

红苞凤梨AbF3′5′H基因上游调控因子筛选

颜色是观赏植物最重要的性状之一,也是当前观赏园艺育种的一个重要方向。为研究红苞凤梨红蓝色彩的呈现机制,初步分析金边红苞凤梨(Ananas comosus var.bracteatus)不同组织中花青素种类与含量,用AbF3′5′H基因启动子构建诱饵载体,利用酵母单杂交(Y1H)文库筛选其上游调控转录因子;并采用酵母单杂交验证技术,验证筛选出的转录因子与AbF3′5′H启动子的互作关系。结果表明：花青素的种类组成和相对比例决定了组织的颜色性状,AbF3′5′H是花青素合成途径种类分支的关键基因,在花青素种类组成与相对比例调控中具有重要作用;AbBTB/POZ、AbHSP81-1和AbGLOX能够与AbF3′5′H的启动子结合而调控其转录,可能在红苞凤梨花青素合成代谢调控中发挥重要作用。研究结果对于进一步揭示红苞凤梨花青素合成代谢调控机理,研究红苞凤梨呈色机理,培育叶色新品种有着重要的理论和实践意义。     

玉米钙依赖蛋白激酶全基因组鉴定及抗旱表达分析

【目的】分析研究玉米钙依赖蛋白激酶全基因组鉴定及抗旱表达。【方法】使用NCBI Blast、DNAMAN和MotifScan等程序分析玉米钙依赖蛋白激酶CDPK的蛋白结构域和系统发育。采用Real-time RT-PCR方法分析CDPK基因在干旱胁迫处理玉米幼苗中的表达,评价CDPK基因对玉米干旱胁迫反应能力。【结果】鉴定出了在玉米中含有39个CDPK基因。将CDPK基因分为4个组。每个群体中的成员有共同的蛋白质基序和外显子及内含子结构,共同的进化起源。39个玉米CDPK基因根据它们的系统发育关系分组,并锚定在特定的玉米染色体上。多数CDPK基因在玉米干旱胁迫中的表达水平发生改变,CDPK基因参与对干旱胁迫的响应。【结论】从玉米基因组数据库中鉴定出了39个CDPK基因,大多数玉米CDPK基因在不同组织和不同发育阶段表现出不同的表达水平,CDPK基因在玉米发育中发挥不同的作用。多数CDPK基因在干旱胁迫下的表达量均发生变化。     

玉米Bt转基因植株抗虫性量化分析

对87-1，8085，综3，N808等4个回交一代Bt转基因材料进行田间抗虫性接卵鉴定的结果表明，成株期转基因材料群体茎秆的平抗虫性对照提高45%以上，差异达或极显著水平，叶片的抗虫性提高30%以上，不同遗传背景的转基因材料，抗性表现不一，回交一代群体内，不同单株的抗虫性差异悬殊，均存在高抗到抗感不等的分离。     

大豆干旱和低温cDNA文库的构建与检测

以栽培大豆（Glycine max）吉林35为材料,在幼苗期进行干旱、低温处理,分离mRNA经逆转录合成cDNA后,插入到融合表达载体中,分别构建了干旱和低温两个融合表达文库。检测表明,两个初始文库的滴度分别为2．75×10^6pfu·mL^-1和5．52×10^5pfu·mL^-1插入的cDNA片断长度在0．5～2．0kb。此文库的构建为今后分离与干旱、低温相关基因奠定了基础。     

玉米XYLPs基因家族表达模式及其蛋白结构分析

通过生物信息学的方法对玉米木质形成素类阿拉伯半乳糖蛋白(xylogen-like arabinogalactan proteins,XYLPs)基因家族的表达模式和蛋白结构进行了分析。ZmXYLPs基因家族成员在染色体上的分布具有一定的偏好性。基因复制事件不仅在基因家族成员数量的扩张和进化中发挥重要作用,同时还可能引起基因表达部位的扩张。根据ZmXYLPs蛋白结构特点,可将其分为两大类。其中仅ZmXYLP10/13/14蛋白存在N连接的糖修饰位点,其余ZmXYLPs蛋白均为O连接糖修饰位点。结果显示,玉米ZmXYLPs的生物学功能可能与其糖基侧链有关,并且其作用并不局限于维管组织发生过程,可能也参与生殖发育过程。     

玉米C型胞质雄性不育与可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸含量的关系

为揭示玉米胞质雄性不育的生化机制,以玉米C型雄性不育系C478及其保持系478、恢复系H01为材料,对叶片及雄穗小花的可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸含量进行比较研究.结果表明:玉米不育系苗期、抽雄期、开花期叶片中可溶性糖含量均显著高于保持系、恢复系;三系间可溶性蛋白含量相差小;不育系除抽雄期外叶片中的游离脯氨酸含量显著高于其保持系、恢复系.玉米雄穗发育过程中,保持系雄穗小花中的可溶性糖含量在雄穗孕育完全但没抽出期(时期Ⅱ)、散粉期(时期Ⅲ)显著高于不育系;不育系小花中各个时期的可溶性蛋白含量均低于其保持系和恢复系,特别在时期Ⅱ、时期Ⅲ显著低于保持系和恢复系;不育系每个时期小花中的游离脯氨酸含量都显著低于保持系和恢复系.