3株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列进化分析

为明确3株不同源性的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Jilin/22/13(简称JL22)、A/Chicken/Jilin/24/13(简称JL24)、A/Duck/Jilin/37/13(简称JL37)基因组的遗传变异情况,本试验采用RT-PCR技术,分别扩增出3株AIV的8个基因片段,克隆后进行序列测定。结果显示,3株H9N2亚型AIV的主要致病基因均属于经典的欧亚种系。氨基酸比对发现JL22的HA氨基酸序列与A/Chicken/Hong Kong/G9/97和A/Duck/Hong Kong/Y280/97的HA氨基酸序列相比,在551位多了1个潜在糖基化位点。JL22、JL24、JL37的HA序列,在226位的氨基酸残基均为Leu,具有同哺乳动物唾液酸受体结合的特性,说明对人的感染性增强。M基因在31位上均发生了Asn取代Ser的现象,说明这些病毒对金刚烷胺产生了耐药性。由系统进化树可知3株毒株亲缘关系较远,各个基因所属分支也不具有统一性,且部分基因分别与鸡源、鸭源和猪源3种源性流感病毒株高度同源,推测这3株毒株是不同动物不同毒株经过长时间进化而发生自然重排的产物。     

2株海鸭源H3亚型禽流感病毒全基因组分子特征分析

【目的】了解广西沿海地区水禽H3亚型禽流感病毒的基因组分子特征。【方法】本研究通过RT-PCR一步法分段扩增法,对2020年从广西沿海地区分离到的2株海鸭源H3亚型禽流感病毒A/duck/Guangxi/S11359/2020(H3N1)与A/duck/Guangxi/S11374/2020(H3N8)进行全基因组测序与进化分析。【结果】2株H3亚型禽流感病毒的HA蛋白裂解位点序列均为³⁴⁰PEKQTR↓GLFG³⁴⁹,为低致病性禽流感病毒的分子特征,与受体嗜性关联的第226、228位氨基酸均为Q和T,可能仍主要结合禽类受体;BLAST分析结果显示,本研究H3N1亚型禽流感病毒的M、NP基因及H3N8亚型禽流感病毒的PA基因,与H7亚型禽流感病毒相似性最高,分别为99.5%、98.7%和98.9%,表明H3可能与H7亚型禽流感病毒发生了基因交换;2株H3亚型禽流感病毒与越南、孟加拉国、韩国等周边国家水禽源的H3、H4、H6、H7、H9等亚型相似性较高,可能拥有相同的进化来源;遗传进化分析表明,H3亚型禽流感病毒各基因进化分支均属于欧亚谱系,与...     

1株天鹅源H3N2亚型禽流感病毒的全基因序列分析

为了调查动物园动物禽流感病毒的携带情况,从扬州市动物园采集了106份野禽类新鲜粪便棉拭子样品,进行SPF鸡胚接种、HA/AI试验鉴定、空斑纯化以及HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、M、NS共8个片段扩增及测序分析。结果表明,分离到1株H3N2亚型禽流感病毒,分离率为0.94%,命名为A/Swan/Yangzhou/YZS1084/2019(H3N2)。HA基因裂解位点只有1个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感的特征;携带242Q和244G的HA受体结合位点具有优先结合唾液酸α-2,3受体的能力,具有典型禽源特征。在扬州首次分离到的该病毒的8个基因片段均属于欧亚分支,与猪源和人源的毒株差异较大;8个基因片段来源均不相同,具有明显的遗传多样性。     

25株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传进化分析

为了解山东省不同地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,本研究汇集了2012-2013年间从山东省不同地区发病家禽中分离到的25株H9N2亚型AIV,采用RT-PCR技术扩增其HA基因,并进行测序和遗传进化分析。结果显示,25株病毒HA基因的开放阅读框全长为1 683bp,共编码560个氨基酸,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.5%~100.0%和93.8%~100.0%;遗传进化分析表明25株病毒分离株均属于欧亚分支中的Y280-like亚分支;HA蛋白有7~9个潜在糖基化位点,其中218位糖基化位点缺失,145位新增糖基化位点;25株病毒分离株HA蛋白裂解位点均为RSSR↓GIF,符合低致病力AIV的特征。受体结合位点较保守,234位受体结合位点均为L(亮氨酸),仅198位受体结合位点存在变异。分离的病毒株具有与人唾液酸α-2,6受体结合的特性,此类毒株的流行在公共卫生上值得重视。     

H9N2亚型禽流感病毒西藏分离株的全基因组遗传进化分析

根据GenBank登陆的H9N2亚型AIV全基因组序列,设计了8对引物,运用RT-PCR的方法获取了3株H9N2亚型AIV西藏分离株A/Chiken/Tibet/S1/2009、A/Duck/Tibet/S2/2009和A/Chiken/Tibet/S4/2009的8个基因序列,并对所得序列进行同源性及遗传进化分析.结果显示,分离毒株的各基因片段均有完整的开放阅读框,HA基因裂解位点处均为RSSR/G,符合低致病性禽流感的特征;3株西藏分离毒株之间同源性为98%～99%,可能起源于同一种系;各分离毒的HA、NS和NA基因与欧亚分支A/Chiken/Beijing/1/94分支中的A/Duck/HongKong/Y280/97遗传距离最近,而M、NP、PA、PB1和PB2基因与欧亚分支中另一分支A/Quail/HongKong/G1/97群系遗传关系近.由此可见3株分离株的各基因所属分支不具有统一性,说明本研究所分离的3株H9N2亚型AIV西藏分离毒株可能是来源于不同亚系AIV的毒株在感染同一种宿主时发生基因重排的产物.     

1株野鸟源重组H3N2亚型禽流感病毒的遗传进化分析

2014年4月-6月期间,在辽宁盘锦湿地采集野鸭泄殖腔拭子98份,分离到1株H3N2亚型禽流感病毒。作者对其进行了全基因组测序及HA和NA基因遗传进化分析。HA基因遗传进化树分为4个分支,分离株属于Avian分支,与Canine分支有较近的遗传关系,共同聚到一个大分支,与Equine分支遗传距离最远。NA基因遗传演化表明,分离株属于亚洲分支。     

一株H9N2亚型禽流感病毒全基因组分析

为了研究H9N2亚型AIV A/Chicken/Guangdong/333/2008的全基因组序列变异情况,试验利用RT-PCR方法扩增出该病毒的8个基因序列,并应用DNAStar和MEGA4.0软件分析所得基因序列。结果表明:该病毒HA基因的第226位氨基酸由Q(Gln)变为了L(Leu),其NP基因与Viet Nam/1203/2004(H5N1)的NP基因同源率最高。说明该病毒已具备了感染哺乳动物的分子特征,并可能在遗传演化过程中突变为高致病性的禽流感病毒(AIV)。     

三株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

采用RT-PCR对3株H9N2亚型禽流感病毒基因组进行扩增,测序后再利用DNAStar和MEGA 4对所得到的序列和部分具有代表性的参考序列进行遗传演化及分子特点分析,旨在从分子水平探讨华南地区H9N2亚型禽流感病毒的流行特点,为该病的综合防控提供依据。结果表明,3个分离株CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05与CK/GD/A8/10分别属于B34、B47和B54基因型;3个分离株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9N2亚型AIV HA基因的遗传进化特点,但内部基因出现不同程度重组且部分基因与人源高致病性H5N1亚型AIV同源性很高;CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05两株分离株具有宿主多样性。因此,对华南地区H9N2亚型AIV进行监控及分子流行病学调查具有重要意义。     

13株H9N2亚型禽流感病毒HA基因变异分析

为了从分子水平上掌握我国H9亚型禽流感的病原变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国部分省市养殖场分离的13株H9N2亚型禽流感毒株,采用RT-PCR技术对其HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,13株病毒的HA基因在遗传进化树中均属于欧亚分支中的类Y280-like亚分支,与A/DK/HK/Y280/97的HA基因核苷酸序列同源性为92.2%～97.6%,与中国最早的分离株A/Chicken/Beijing/1/94(简称BJ94)相距较远,初步说明H9亚型禽流感病毒随着流行时间而发生了遗传分化。推测的HA糖基化位点的氨基酸序列12株病毒均与上述亚系相似,但有一株病毒由于一个核苷酸的变异,缺失了HA上218～220位的一个潜在的糖基化位点。     

2株H11N3亚型禽流感病毒厦门分离株的基因特征及遗传进化分析

从厦门地区健康鸭群和环境中分离到2株H11N3亚型禽流感病毒(简称SD61和XA33),对其进行全基因组序列测定、遗传演化分析和特殊位点的氨基酸分析。结果显示:2株分离株的HA裂解位点均符合低致病性禽流感病毒特征,NA颈部均无缺失碱基;内部基因中M1基因N30D、T215A突变,PB1基因发生S622G突变,NS1均存在PL基序,为ESEV,SD61株中NS1发生P42S突变,提示当前分离株已出现致病性增强的变化。8个基因片段均属于欧亚谱系,除了HA基因外,与A/duck/Fujian/SD063/2017(H3N3)毒株其他7个基因片段有高度的同源性,同时与浙江、江西、江苏等不同亚型禽流感病毒同源性很高,说明这2株H11N3毒株发生基因重组现象。本研究结果将为本地区禽流感病毒生物学特性研究和防控提供科学依据。     

H9N2亚型禽流感流行分析及疫苗毒株的筛选

本研究旨在筛选新型免疫原性好、广谱的优秀 H9亚型禽流感病毒疫苗株。通过 H9N2分子流行病学调查对分离得到的37株禽流感 H9N2亚型病毒进行 HA 基因分子遗传进化及其关键位点分析,利用交叉 HI 效价及鸡胚中和试验分析毒株间毒力及其相关性,制备疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,从37株病毒中选出12株病毒作为代表,分为3个分支,同分支之间交叉 HI 效价及中和效价最高。HI 试验及鸡胚中和试验均显示同分支毒株间的相关系数高。免疫攻毒保护试验显示同分支疫苗株安全性高。表明我国禽流感 H9N2亚型情况复杂,且疫苗保护效果与疫苗株的抗原匹配性密切相关,生产多种分支 H9疫苗株联合更有利于控制 H9型禽流感,     

63株H9N2亚型禽流感病毒NA基因序列分析

为了从分子水平上掌握我国H9N2亚型禽流感病毒NA基因变异情况和流行规律,作者汇集了我国部分省市的63株H9N2亚型禽流感毒株,采用RT-PCR技术对其NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得序列进行同源性和进化分析。结果显示分离株核苷酸同源性在87.4%~99.5%;52株NA蛋白颈部63—65位点缺失了T、E、I 3个氨基酸,属于Y280-like分支,11株没有发生缺失,属于G9-like分支,没有发现G1-like分支和Y439-like分支的NA基因毒株;唾液酸结合位点(HB)和抗原决定簇的氨基酸发生了明显的变异;酶活性位点处的氨基酸非常保守,没有发生与抗神经氨酸酶抑制剂奥塞米韦和扎那米韦相关的氨基酸突变;36/63毒株失去了402位点处的潜在N-糖基化位点;而28/63毒株新出现了264位点处的潜在N-糖基化位点。本研究提示目前中国大陆地区商业鸡群流行的H9N2亚型禽流感病毒NA基因分为2个差异较大分支——Y280-like分支和G9-like分支,而Y280-like分支仍是我国H9N2亚型禽流感病毒流行的主要类型。     

H9N2亚型禽流感病毒不同流行株抗原性和免疫原性的比较研究

为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,采用交叉HI试验、细胞中和试验和攻毒保护试验对1998-2008年间分离到的25株H9N2 AIV的抗原性和免疫原性进行了研究.结果显示,依据不同毒株与Hp株免疫产生HI抗体的结果可将25个毒株分为3类,第1类HI效价4.0log2～5.0log2的为12#、17#、18#;第2类毒株HI效价6.0log2～7.0log2的为2#、21#、5#、22#、11#、25#、15#、16#;其余毒株的HI效价为7.0log2～8.0log2.这证实不同H9N2 AIV流行毒株间的抗原性有差异.选取代表性的8株H9N2 AIV毒株进行中和试验,结果显示其抗原相关性在0.42～0.84.除了3#与14#、11#与17#的抗原性有明显差异外(相关性R值分别为0.46、0.42),其余毒株间的抗原性无明显差异或仅有较小的差异.抗原性不同的H9N2 AIV株对Hp株免疫鸡的攻毒保护试验显示Hp株能够对抗原性有差异的攻毒株(10#、12#、17#)产生有效保护(9/10),联合攻毒试验结果显示Hp毒株免疫鸡可抗其他毒株(9#+15#和16#+17#)的联合攻击,保护率9/10以上.以上结果显示,H9N2 AIV Hp株与多数流行毒株间在免疫原性上无明显差异,H9N2 AIV多数流行毒株间的免疫原性没有发生根本改变.     

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV) HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定.结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长.单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞.研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现.S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用.这提示该病的防控面临着新的挑战.     

Isolation,Identification and Immunogenicity Evaluation of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus HF Strain

In 2015,an H9N2 subtype avian influenza virus (AIV) strain was isolated from a chicken farm in Hefei,Anhui,and named HF strain.The results of the chicken embryo proliferation characteristics study showed that the half infection rate of chicken embryo (EID₅₀) was 10^9.17/0.1 mL,and the mean time to death for minimum lethal dose(MDT) was 87 h.The analysis result of HA gene showed that its amino acid cleavage site was located in RSSR↓GLF,which accorded with the characteristics of low pathogenic avian influenza.The genetic evolution analysis of HA gene revealed that the isolate belonged to the h9.4.2.5 lineage,which accorded with the current virus strain epidemic characteristics.The HF strain was prepared with 10 H9N2 subtype AIV isolates which isolated from all over the country from 2006 to 2018 to prepare inactivated vaccines,immunize SPF chickens,prepare positive sera,and analyze the virus antigenicity by cross hemagglutination inhibition test.The results showed that the correlation between the HF strain and the virus antigens before 2014 and was between 0.50-0.56,and the virus antigen correlation after 2014 was 0.89-1.00.This showed that the isolate had good antigenic correlation with epidemic strains in recent years.Inactivate HF strain virus solution with 0.2% formaldehydel,and its HA titer did not change before and after inactivation.After the inactivated virus solution was prepared into an oil emulsion inactivated vaccine to immunize SPF chickens,21 days after immunization,the average value of the HI antibody titer reached 9.0log2.It could make immune chicken completely resistant to H9 subtype AIV infection and provide 100% protection from challenge.The above research results showed that the HF strain had good immunogenicity and could be used as a vaccine candidate strain for the prevention of H9N2 subtype AIV.     

H9亚型禽流感病毒HF株的分离鉴定和免疫原性评价

2015年,从安徽合肥某养鸡场分离出一株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）,命名为HF株。该毒株鸡胚半数感染量（EID₅₀）为10^9.17/0.1 mL,最小致死量的平均死亡时间（MDT）为87 h。对其HA基因分析发现,其氨基酸裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV特征;HA基因的遗传进化分析结果表明,该分离株属于h9.4.2.5谱系,符合当前毒株流行趋势。将HF株与2006-2018年分离自全国各地的10株H9N2亚型AIV分离株同时制备灭活疫苗,免疫SPF鸡,制备阳性血清,通过交叉血凝抑制试验分析病毒抗原性,结果显示HF株与2014年之前毒株抗原相关性介于0.50~0.56之间,与2014年及之后毒株抗原相关性介于0.89~1.00之间,表明该分离株与2014年之后的流行毒株具有良好的抗原相关性。用0.2%甲醛灭活HF株病毒液,其HA效价在灭活前后未发生变化;用灭活抗原制备油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21 d HI抗体效价几何平均值达到9.0log2以上,可使免疫鸡完全抵抗H9亚型AIV的感染,提供100%的攻毒保护。研究结果表明,HF株具有良好的免疫原性,可作为疫苗候选株用于H9N2亚型禽流感疫苗的研制。     

2株鸭源 H11N9亚型禽流感病毒的基因遗传进化及致病性分析

为了解从湖南省洞庭湖区鸭群中分离的2株 H11N9亚型禽流感病毒变异特点、进化规律及生物学特性,本研究对2株H11N9亚型禽流感病毒的HA、NA序列进行同源性和遗传进化分析,并用2株毒株对SPF鸡进行致病性试验。结果显示,本试验分离到2株 H11N9亚型禽流感毒株的 HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性毒株;HA基因的受体结合位点均非常保守,具有典型的禽源性特征;NA基因序列与在周边国家野鸟中分离的H11N9亚型毒株的氨基酸同源性较高;鼻腔接种SPF鸡后,均能使鸡感染并通过喉头或泄殖腔排毒,但感染的鸡均不表现明显的临床症状,并且不能使同居鸡感染排毒。