一氧化氮对猪腔前卵泡颗粒细胞凋亡的影响

本试验旨在研究在培养液中添加不同浓度的NO供体硝普钠(sodium nitro-prusside,SNP)(0、0.001、0.01、0.1、1.0 mmol/L)处理,研究培养4 d后的腔前卵泡颗粒细胞凋亡情况。结果表明,1.0 mmol/L SNP组凋亡率显著高于其他各组(P0.05),而0.001 mmol/L SNP组凋亡率显著低于其他各组(P0.05)。说明高浓度的SNP对猪腔前卵泡颗粒细胞凋亡起促进作用,低浓度的SNP起抑制作用。     

猪三种不同直径卵泡中颗粒细胞的比较研究

为探究不同直径有腔卵泡中猪卵巢颗粒细胞的生理机能差异,以期为后续生殖毒理学研究奠定基础。采用剖剪法获取猪卵巢内三种直径范围的有腔卵泡（小型〈2mm,中型2-5mm,大型≥5mm）并获得颗粒细胞,台盼蓝染色方法计算细胞存活率,倒置显微镜下观察细胞形态并计算细胞纯度,实时定量方法检测促卵泡刺激素受体基因（FSHR）及促黄体生成素受体基因（LHR）的表达进一步鉴定颗粒细胞,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞生长曲线。结果显示从大中小三种不同直径有腔卵泡中获得的猪卵巢颗粒细胞存活率分别为68%、75%、72%,纯度分别为97%、95%、90%;细胞生长曲线表明,从24h开始进入对数生长期,并于120h达到最大值,且中型卵泡中获得的颗粒细胞生长增殖状态最佳;实时定量结果显示FSHR在猪三种直径的有腔卵泡颗粒细胞中均表达阳性,且呈现差异。     

猪卵泡颗粒细胞总RNA提取方法改进的探讨

RNA是一类非常有用的生物大分子,在分子生物学研究领域正发挥越来越重要的作用。本文介绍一种改进过的从动物组织提取总RNA的方法,实践证明,该方法重复性好,实用性强。用此方法提取的猪卵泡颗粒细胞总RNA,无DNA污染物等问题,完全满足分子克隆、基因表达等分子生物学研究的需要。     

生物标记物在DNA氧化损伤及辐射损伤检测中的应用

生物标记物是近年来提出的一群与 细胞生长增殖有关的标记物。随着分子生物 学理论和技术的迅速发展,生物标记物的研 究作为一个崭新的领域逐渐引起了国内外环 境医学界的共同关注。关于自由基攻击 DNA所引起氧化损伤,以及电离辐射造成的 DNA辐射损伤所诱发的一些生物学后果,存 在着由于DNA结构微小,直接检测过于复杂 和困难的问题,而利用生物标记物进行DNA 损伤修复检测是最灵敏可行的方法,也是危 险性评价的重要方法。因此,文章就DNA氧 化损伤、辐射损伤以及生物标记物在DNA氧 化损伤与辐射损伤检测中的具体应用进行了 全面而系统的阐述。     

t-BHP诱导猪卵泡氧化损伤模型的建立

本研究旨在构建猪有腔卵泡体外氧化应激模型,为延缓母猪的卵巢功能衰退和提高繁殖利用年限提供参考。本研究分别采用100μmol/L（低浓度组）、200μmol/L（中浓度组）、400μmol/L（高浓度组）的叔丁基过氧化氢（Tertiary-butylhydroperoxide,t-BHP）作为诱导剂处理猪卵泡6 h,通过CCK-8检测卵泡颗粒细胞（GCs）活力。筛选出200μmol/L（中浓度组）t-BHP作为后续处理浓度,用其刺激卵泡1、2、6、12 h。用流式细胞仪检测细胞凋亡率、ELISA检测活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平以及用Western blot分析检测线粒体凋亡相关蛋白的表达。结果显示：GCs活力呈现浓度依赖性下降,半数抑制浓度（IC50）为289.7μmol/L;t-BHP诱导的氧化应激可导致GCs凋亡率明显升高（P<0.01）,卵泡内ROS在处理6 h后增加（P<0.01）,Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05）,Bax、Caspase 9蛋白水平上升（P<0.05）,细胞色素C(Cytochrome C,C...     

miR-15a对猪卵泡颗粒细胞BDNF基因表达的影响

为探索miR-15a对猪卵泡发育的影响,选取健康大卵泡、中等卵泡和闭锁卵泡,研究不同卵泡中miR-15a的相对表达量以及其是否对卵巢颗粒细胞中有BDNF表达具有调节作用。分别抽取直径3-5 mm、大于5 mm健康卵泡和3-5 mm闭锁猪卵泡,采用q PCR检测发现闭锁卵泡中miR-15a表达显著升高。免疫组化结果显示中等健康卵泡颗粒细胞上BDNF、Tr KB均有表达,而在靠近卵泡腔的凋亡颗粒细胞BDNF免疫阳性反应较弱。分离培养猪卵巢颗粒细胞,过表达miR-15a能显著上调BDNF基因表达水平,Bcl-2基因表达有下降趋势但差异不显著;抑制miR-15a表达能显著抑制BDNF、bcl-2基因表达水平。Western-Blot结果发现,过表达miR-15a显著下调BDNF蛋白水平,而抑制miR-15a表达则能显著上调BDNF蛋白水平。实验结果显示miR-15a可能经由其靶基因BDNF参与猪卵泡的发育和闭锁。     

CRABP1过表达载体的构建及其对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响

本实验通过构建猪视黄酸结合蛋白1(Cellular Retinoic Acid-Binding Protein1,CRABP1)过表达载体并揭示其对猪卵泡颗粒细胞凋亡的效应.从猪卵巢组织中提取RNA,反转录获得cDNA样本,利用PCR克隆CRABP1基因,并使用T4连接酶将其连入pcDNA3.1载体,进一步转化到感受态...     

丁羟基甲苯抗猪精子氧化损伤作用

分别在稀释、离心猪精液中添加0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L丁羟基甲苯(Butylated hydroxytoluene,BHT),15℃保存,检验保存35、d后精子TMS、PMI和NAR(%)、测定MDA浓度;确定并选择最佳BHT浓度用于猪精液冷冻保存,检验解冻后TMS、PMI、NAR和Mt-MP(%)、测定MDA浓度。结果显示:BHT显著提高稀释精液、离心精液各项指标百分率(P0.05),且MDA浓度显著降低(P0.05),BHT最佳浓度分别为0.8、1.6 mmol/L;0.8 mmol/L BHT显著提高冷冻-解冻精液各项指标百分率(P0.05),且MDA浓度显著降低(P0.05)。结果表明,BHT能通过抑制精子质膜氧化损伤,提高猪精液保存效果。     

鹅卵泡膜层与颗粒层内激素调控规律的研究

鹅卵巢中含有众多的卵泡,产蛋期卵巢中总存在陆续成熟、大小不等的卵泡。卵泡壁由颗粒层和膜层组成,中以基膜相隔。颗粒层成于颗粒细胞。卵泡膜有成纤维细胞和分泌细胞,两种细胞混杂在一起,以至于卵泡膜的内外层分界不清,且在卵泡膜外层含有典型的平滑肌细胞。禽类产蛋性能主要由发育至等级发育阶段的卵泡数决定,而促进卵泡发育的等级与阶段主要取决于体外激素的分泌。     

猪卵泡液抑制素的分离及其生物活性和免疫活性研究

利用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００二次层析分馏,以标准猪抑制素蛋白和抑制素α－亚单位作参照,结合紫外扫描,分离猪卵泡液抑制素,并测定各组分对ＨＣＧ诱导的小白鼠生殖器官发育及输卵管水肿抑制的影响和对补体溶血活性的抑制效果,证明可以分离得到生物活性和免疫活性较高的抑制素蛋白组分,其方法较简便,可用于猪卵泡液抑制素的一般制备。     

原花青素对玉米赤霉烯酮诱导牦牛颗粒细胞氧化损伤的保护作用研究

旨在探究原花青素（procyanidins,PC）在玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）诱导牦牛颗粒细胞产生氧化损伤后,对颗粒细胞生长增殖、抗氧化性以及激素分泌的影响。本试验选取3～5岁的健康牦牛（n=3）,完成卵巢颗粒细胞的分离培养,并通过免疫荧光染色鉴定颗粒细胞纯度。通过CCK-8法分别比较不同浓度ZEA （0（对照组）、5、10、20、40、60、80和100 μmol·mL^-1）、不同浓度PC （0（对照组）、0.05、0.5、2.5、5、10、50和100 μg·mL^-1）以及50 μmol·mL^-1 ZEA+5 μg·mL^-1 PC联合处理对牦牛颗粒细胞活性的影响。通过ELISA法检测对照组（未添加ZEA及PC）、50 μmol·mL^-1 ZEA组和50 μmol·mL^-1ZEA+5 μg·mL^-1PC联合处理组牦牛颗粒细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）以及雌二醇（E₂）水平。采用实时荧光定量PCR法检测不同组颗粒细胞中部分增殖生长、凋亡、抗氧化及E₂合成相关基因的表达水平。结果显示,本研究所分离培养得到的细胞表达颗粒细胞标志蛋白FSHR,具有较高的纯度,可以满足后续试验要求。添加不同浓度ZEA后,颗粒细胞活力随着ZEA浓度的升高而显著降低（P<0.05）。在一定浓度范围内（0~5 μg·mL^-1）,随着浓度的上升,PC对颗粒细胞的活力有显著提高作用（P<0.05）,且在浓度为5 μg·mL^-1时对细胞活力的提高作用最明显。与ZEA处理组相比,ZEA与PC联合处理后颗粒细胞的数量增加且细胞活力极显著提高（P<0.05）,颗粒细胞增殖生长相关基因PCNA和IGF-Ⅱ 以及抗凋亡相关基因XIAP和BCL-2的表达显著上调（P<0.05）。相反,促凋亡相关基因BAX和CASP3的表达显著下调（P<0.05）。同时,ZEA+PC联合处理后能显著降低牦牛颗粒细胞活性氧水平并促进颗粒细胞分泌E₂（P<0.05）,颗粒细胞中的抗氧化相关基因SOD2、GPX1及CAT和E₂合成相关基因STAR、CYP11A1及HSD3B的表达量显著上调（P<0.05）。上述结果表明,PC可提高经ZEA处理后颗粒细胞的生长增殖能力,上调颗粒细胞的活力,提高抗氧化能力,降低ROS水平以及提高E₂的分泌水平。综上所述,PC对ZEA诱导的牦牛颗粒细胞氧化损伤有一定保护作用。本研究为ZEA毒性的防治和畜牧业生产中PC的应用提供了一定的研究数据和理论支持。     

不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期和增殖的影响

为了研究不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期、增殖及相关基因表达的影响.本研究分别用不同浓度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng ? mL-1)处理体外培养的鸭颗粒细胞24 h(n=3),观察细胞的生长状态,通过流式细胞术和EdU方法检测细胞周期和细胞增殖,并用qRT-PCR方法检测增殖相关基因CDK6、Cycli...     

SMAD7对山羊卵泡颗粒细胞增殖、凋亡的影响

旨在探究SMAD7对山羊卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的影响。本试验收集3~4月龄大足黑山羊母羊的卵泡颗粒细胞,通过过表达或siRNA干扰、ELISA、qRT-PCR、Western blot及流式细胞术等技术与方法探究SMAD7对颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素分泌的影响。结果发现,SMAD7过表达显著下调颗粒细胞增殖活力并促进细胞凋亡,抑制PCNA表达（P<0.05）,下调BCL2/BAX的比值（P<0.01）;同时,SMAD7干扰显著上调颗粒细胞增殖活力,显著上调PCNA表达（P<0.05）与BCL2/BAX表达量比值（P<0.05）。SMAD7过表达极显著上调颗粒细胞的孕酮分泌,下调雌二醇表达水平（P<0.01）;同时SMAD7干扰极显著下调孕酮分泌,上调雌二醇分泌（P<0.01）。进一步研究发现,SMAD7过表达显著抑制SMAD2、SMAD3的mRNA和蛋白表达（P<0.05）;SMAD7干扰则显著促进SMAD2、SMAD3的mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结果表明,SMAD7抑制山羊卵泡颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌,促进凋亡和孕酮的合成,并且抑制SMAD2、SMAD3的表达,进而调节卵泡的发育与闭锁。     

过氧化氢诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的建立

本试验旨在利用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)作为刺激源,以细胞存活率及抗氧化指标为判断指标,建立奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)的氧化损伤模型。试验一采用单因子完全随机试验设计,将第3代贴壁生长的BMEC随机分为42组,每组10个重复。细胞培养液中分别添加0、100、200、400、600、800和1 000μmol/L H2O2,使之分别作用2、4、6、8、12、24 h,测定细胞数量,计算存活率。试验二是在试验一得出的适宜H2O2作用时间(本试验的结果为6 h)的基础上,采用单因子完全随机试验设计,将第3代贴壁生长的BMEC随机分为7组,每组6个重复,BMEC中添加不同浓度的H2O2(0、100、200、400、600、800和1 000μmol/L)作用细胞6 h,收集细胞和培养液测定抗氧化指标,筛选使细胞发生氧化损伤的适宜H2O2作用浓度。试验一结果表明,600μmol/L H2O2作用细胞6 h,BMEC的存活率降低至79.79%。试验二结果表明,600~1 000μmol/L组与其他各组相比均显著降低了谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,提高了丙二醛含量(P<0.05),但600、800和1 000μmol/L组之间差异不显著(P>0.10)。结果 提示,H2O2作用浓度为600μmol/L、作用时间为6 h,使BMEC产生了明显的氧化应激,可作为建立细胞氧化损伤模型时的适宜条件。     

茶多酚对活性氧引起的鸡胚睾丸细胞氧化损伤的保护作用

利用精原细胞-体细胞共培养模型研究茶多酚对鸡胚睾丸细胞氧化损伤的缓解作用。结果表明:由次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生的活性氧可引起脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的生成量增加、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性降低,而添加0.1μg/mL的茶多酚能降低MDA的生成量、使SOD和GSH-Px的活性恢复到对照组水平。这些结果说明,茶多酚通过抗氧化作用对活性氧引起的鸡胚睾丸细胞的氧化损伤具有保护作用。     

谷氨酰胺对过氧化氢诱导氧化应激人结肠癌HT-29细胞损伤和凋亡的影响

本试验旨在通过研究谷氨酰胺对过氧化氢(H_2O_2)诱导氧化应激人结肠癌HT-29细胞损伤和凋亡的影响,阐明谷氨酰胺的抗氧化效果和作用机理。HT-29细胞经不同浓度[0(对照组)、0.5、2.0、10.0 mmol/L]谷氨酰胺和0.35 mmol/L H_2O_2分别处理12、24、32 h后,测定细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,并采用荧光定量PCR方法分析谷氨酰胺对H_2O_2诱导的细胞凋亡相关基因的mRNA相对表达量,以及采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法对HT-29细胞染色,并用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果表明:1)处理24 h后,0.5、2.0 mmol/L Gln组SOD活性显著高于对照组(P0.05);处理32 h后,0.5、2.0 mmol/L Gln组SOD活性显著高于对照组(P0.05),MDA含量显著低于对照组(P0.05)。2)处理12 h后,各组天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)mRNA相对表达量无显著差异(P0.05)。与对照组比较,0.5 mmol/L Gln组核转录因子κB(NF-κB)mRNA相对表达量显著降低(P0.05),0.5与2.0 mmol/L Gln组B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)mRNA相对表达量显著提高(P0.05)。处理24 h后,与对照组比较,0.5、2.0和10.0 mmol/L Gln组Caspase-3、NF-κB和Bax mRNA相对表达量均显著降低(P0.05),Bcl-2mRNA相对表达量显著升高(P0.05)。处理32 h后,与对照组比较,2.0 mmol/L Gln组细胞表面诱导凋亡分子(FAS)、Caspase-3、NF-κB、Bax mRNA相对表达量均显著降低(P0.05),Bcl-2mRNA相对表达量显著升高(P0.05);10.0 mmol/L Gln组FAS、Caspase-3、NF-κB、Bax mRNA相对表达量均显著升高(P0.05)。3)处理24 h后,与对照组比较,Gln处理使活细胞数量提高了5.32%~11.97%,坏死细胞数量降低了6.75%~12.66%。处理32 h后,与对照组比较,Gln处理使活细胞数量提高了1.39%~7.63%,坏死细胞数量降低了3.40%~4.57%。由此可见,谷氨酰胺可抑制氧化应激反应,降低H_2O_2诱导的HT-29细胞凋亡。     

二乙烯三胺/一氧化氮聚合物诱导的奶牛乳腺上皮细胞损伤模型的建立

泌乳期间的奶牛由于代谢旺盛,往往会产生大量一氧化氮(NO),诱导发生氧化应激,进而对细胞产生毒害作用。本试验旨在探讨二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)诱导奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)氧化应激的损伤条件,并建立氧化应激模型。本试验利用不同浓度(0、10、30、100、500、1 000μmol/L)的DETA/NO作为刺激源,作用BM EC 2、4、6、8、12、24 h,通过测定细胞存活率、抗氧化指标、炎症因子和NO含量及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)活性,筛选适宜的DETA/NO作用时间及作用浓度,建立BMEC氧化损伤模型。结果表明:1 000μmol/L的DETA/NO作用细胞6 h,细胞存活率降低为74.27%,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性也均显著降低(P0.05),然而,i NOS活性,NO、白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、丙二醛含量则呈现相反的变化规律,显著升高(P0.05)。综上所述,1 000μmol/L的DETA/NO处理细胞6h,可构建理想的BM EC氧化应激模型。     

甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激的影响

【目的】 探究甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞引发的氧化应激的影响, 为开发治疗副猪嗜血杆菌感染的新型药物提供参考。【方法】 利用支气管肺泡灌洗法分离猪肺泡巨噬细胞, 分为6组: 阴性对照组, 未感染副猪嗜血杆菌的猪肺泡巨噬细胞; 阳性对照组, 感染副猪嗜血杆菌的猪肺泡巨噬细胞; DMSO组, 猪肺泡巨噬细胞感染副猪嗜血杆菌后给予0.1% DMSO; 5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组, 猪肺泡巨噬细胞感染副猪嗜血杆菌后给予相应浓度的甘草查尔酮A。各组细胞培养24 h后, 用CCK-8法检测细胞活力, 用酶标仪或可见光分光光度计检测各组细胞上清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)、一氧化氮(nitric oxide, NO)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)水平, 用活性氧(reactive oxygen species, ROS)荧光探针(DCFH-DA)检测ROS水平。【结果】 与阴性对照组相比, 副猪嗜血杆菌感染组猪肺泡巨噬细胞活力均显著降低(P<0.05), 上清液中LDH活性均显著提高(P<0.05), MDA、NO、ROS水平及SOD活性均显著增加(P<0.05);与阳性对照组相比, 5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞活力均显著提高(P<0.05), 上清液LDH活性均显著降低(P<0.05), 10和20 μg/mL甘草查尔酮A组MDA、NO和ROS水平均显著降低(P<0.05);5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A处理组GSH-Px、SOD和T-AOC活性均呈剂量依赖性显著升高(P<0.05)。【结论】 副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞导致氧化和抗氧化平衡失调, 5~20 μg/mL甘草查尔酮A可以降低细胞氧化应激反应。     

犬氧化损伤诱发白内障模型及其评价标准的研究

犬白内障是常见的眼科疾病,发病率高,严重影响犬的视力。有研究表明氧化损伤是重要的发病机制之一,目前对其疾病模型与发病机理研究较少。本研究旨在建立犬老年性白内障动物模型,为其后续机理研究奠定基础。本试验选取健康成年犬10只,随机选取6只为模型组,4只为对照组,用Fenton液造模。裂隙灯观察晶状体的混浊情况,光镜和透射电镜观察形态结构的变化,测定晶状体生化指标的改变,判定造模结果。与对照组相比,模型组晶状体混浊度变化明显,光镜和电镜下能观察到凋亡现象,T-SOD、GSH-Px和MDA值差异显著(P<0.05)。本试验证明用Fenton液囊袋内注射即可成功建立犬老年性白内障疾病模型。