奶山羊D型产气荚膜梭菌的分离鉴定

为鉴定2018年夏季昆明市某奶山羊场持续发生羊急性死亡原因,从该场采集病料进行细菌分离鉴定、小鼠毒力试验、毒素基因检测及序列分析、16S rDNA序列分析比较和药敏试验。结果显示:引起羊发病的病原菌鉴定为D型产气荚膜梭菌;对其2个毒素基因α、ε及16S rDNA序列分析结果表明,毒素基因及16S rDNA高度保守,不同毒素型的菌株16S rDNA序列100%同源,经BLAST比对的2个毒素基因与参考序列之间核苷酸完全同源;分离株在接种小鼠后48 h死亡,表明其毒力较强;药敏试验结果表明,分离菌对恩诺沙星、青霉素、氟苯尼考、呋喃唑酮、氯霉素等抗生素均高度敏感,而对卡那霉素、庆大霉素和链霉素等耐药。试验结果可为羊产气荚膜梭菌感染的临床用药提供参考。     

D型产气荚膜梭菌引起青鹿猝死

对上海动物园 1头猝死的青鹿进行了详细的病原学研究。在死亡动物的肠组织中分离到粗大正直的杆菌 ,有荚膜和芽孢 ,并能使牛乳培养基海绵状发酵 ,可致死小白鼠 ,LD5 0 为 5× 1 0 4CFU。结合肠内容物的毒素中和试验、青鹿的临床症状和病理解剖特征 ,确诊该青鹿的猝死是由于感染了毒力较强的D型产气荚膜梭菌。     

D型产气荚膜梭菌ε毒素研究进展

D型产气荚膜梭菌常引起新生羔羊痢疾和山羊、牛等家畜的肠毒血症,致死性强,对畜牧业造成很大的危害.ε毒素是D型产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原,从分子生物学的角度对该毒素的研究具有重要实际意义.论文主要对国内外关于D型产气荚膜梭菌ε毒素分子生物学结构与性质,ε毒素引起的家畜肠毒血症以及对其作用靶器官肾脏和脑组织破坏的致病机理进行了介绍,对国内外D型产气荚膜梭菌ε毒素预防措施进行了综述,为研究D型产气荚膜梭菌ε毒素结构与功能的关系以及预防治疗动物肠毒血症提供参考.     

黄牛源产气荚膜梭菌分离株基因组的生物信息学分析

本研究自猝死海南黄牛的组织器官中分离到2株A型产气荚膜梭菌,命名为ZWCP209和ZWCP210。基因组拼接结果显示其基因组大小处于3.4～3.5 Mb之间,tRNA和CDS数量稳定。多位点序列分析(MLST)显示,测序菌株属于同种新ST型。从NCBI数据库中获取27株牛源产气荚膜梭菌的基因组,与测序分离株共同进行生物信息学分析：共检测到13种耐药基因,其中四环素类耐药基因tetA(P)和tetB(P)的携带率最高(79.4%),值得关注的是,本研究中2株海南黄牛分离株均携带了7种以上的耐药基因,其中包括非兽用抗生素■唑烷酮的耐药基因optrA。泛基因组分析结果显示以上菌株的基因组中共含有7 345个基因,核心基因数量占比22.94%;在核心基因组和plc基因的系统进化分析中,两海南黄牛分离株处于同一分支,并具有相同的毒力因子,具有极高的同源性。本研究为国内首次对海南黄牛产气荚膜梭菌进行全基因组序列测定与生物信息学分析,对牛产气荚膜梭菌病的防治与基因组研究具有参考价值。     

C型产气荚膜梭菌肠毒素基因的克隆与序列分析

研究参照国外发表的产气荚膜梭菌肠毒素全基因序列设计合成1对特异性引物,采用PCR技术对C型产气荚膜梭菌贵州分离株（CP2株）肠毒素基因进行扩增,将扩增产物连接到pMD18-T载体,并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序。结果：获得的基因序列全长960bp,编码319个氨基酸。同源性分析结果表明贵州分离株CP2株与产气荚膜梭菌参考株肠毒素基因序列的核苷酸同源性为99．4％99．8％,推导氨基酸同源性为99．1％～99．7％。     

D型产气荚膜梭菌主要毒素基因的PCR检测

为了研究产气荚膜梭菌主要毒素基因,试验采用生物软件以NCBI上登录的产气荚膜梭菌α毒素、ε毒素作为参考,设计扩增D型产气荚膜梭菌α毒素与ε毒素的特异性引物,预期基因片段大小分别为1 110 bp、888 bp,进行PCR扩增。结果表明:设计的引物可以良好地扩增α毒素基因与ε毒素基因,基因片段大小与预期一致。     

健康与腹泻仔猪源A型产气荚膜梭菌的多位点序列分型

A型产气荚膜梭菌(CpA)存在于健康仔猪肠道,同时也是仔猪肠毒血症的关键病原.为研究两者的差异,本试验在江西省4个地区采集健康和腹泻仔猪粪便样本分离得到CpA,通过16S rRNA鉴定所有CpA分离株,并通过多重PCR确定分离株的毒素分型.采用MLST多位点序列分型技术对选取的24株CpA(腹泻或健康来源CpA各12株...     

D型产气荚膜梭菌最佳产毒时间及毒素大小的确定

本实验测定了D型产气荚膜梭茵在肝片肉汤培养基的生长曲线、培养液的pH值变化曲线以及不同培养时间提取的毒素液的蛋白质含量,并用SDS--PAGE电泳方法检测了所提毒素为α、ε毒索。结果表明,D型产气荚膜梭茵在肝片肉汤培养基培养18h是其α、ε毒素的最佳产毒时间,毒素大小分别是43kD、35kD。     

产气荚膜梭菌ε毒素原核表达及其单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的D型产气荚膜梭菌点突变的ε毒素蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经过ELISA方法筛选,获得2株稳定分泌抗ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C3-D7和5H6-B8,单抗均为IgG1型。Western blot鉴定结果显示:2株单抗均能与重组ε毒素蛋白及D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白发生特异性结合。本试验为进一步研究产气荚膜梭菌ε毒素的生物学特性及建立产气荚膜梭菌的快速检测方法提供了基础。     

Antibody Response in Goats Vaccinated with Liposome-adjuvanted Clostridium perfringens Type D Epsilon Toxoid

A trial was performed using 20 goats to evaluate the antibody responses to a liposome-adjuvanted Clostridium perfringens epsilon toxoid vaccine (LIPV). The antibody response was compared with those produced by epsilon toxoid vaccines prepared using aluminium hydroxide (ALV) and incomplete Freud's adjuvant (FAV). The animals were allocated to four groups at the beginning of the trial. The animals in group 1 were vaccinated with ALV, while the animals in group 2 received FAV and those in groups 3 and 4 were vaccinated with LIPV. The animals in groups 1 to 3 received three doses of the corresponding vaccine at intervals of three weeks, while those in group 4 received only 1 dose of vaccine at the beginning of the trial. A blood sample was obtained from all the goats at the beginning of the trial and then weekly for 8 weeks. The samples were analysed for epsilon toxoid antibodies by an indirect ELISA technique. No major clinical abnormalities were observed in the animals after vaccination, with the exception of those that received the FAV, which experienced transient lameness. The highest antibody response was observed in the animals vaccinated with FAV, but they presented moderate to severe inflammatory tissue reactions at the injection site. Moderately high antibody responses were obtained with the ALV, with which only minor local reactions were observed. No significant antibody responses were obtained with the LIPV, nor were local reactions observed.     

C、D型二价产气荚膜梭菌抗毒素血清的制备及保护效果评价

为治疗产气荚膜梭菌感染引起的疾病,研究制备了产气荚膜梭菌多价高效抗毒素血清。试验采用C、D型产气荚膜梭菌标准菌株,制备了高浓度外毒素和灭活疫苗,作为免疫原多次免疫绵羊,通过间接ELISA法监测绵羊抗体水平变化,采用小鼠中和试验检验绵羊抗毒素血清保护效果。结果表明:制备的高效价抗C、D型产气荚膜梭菌毒素血清每0.1 m L血清能中和400个C型毒素对小鼠的MLD和600个D型毒素MLD,有良好的应用前景。     

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906 bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54 ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。     

关中奶山羊睾丸不同发育阶段代谢物的差异分析

【目的】 试验旨在从代谢组学角度探究关中奶山羊睾丸发育代谢机制。【方法】 选择1月龄断奶雄性关中奶山羊和24月龄体成熟的雄性关中奶山羊各6只,采集睾丸组织,使用液相色谱-质谱（LC-MS）技术对睾丸组织进行化学检测,通过多维和单维分析相结合的方式对两组不同代谢物进行化学检测、对比与鉴别,通过富集差异代谢物分析筛选关中奶山羊发育代谢中的潜在关键通路。【结果】 在1和24月龄关中奶山羊睾丸组织中共筛选出334个差异代谢物,其中显著上调137个,显著下调197个。对前36个差异代谢物进行比较鉴定发现,分别为脂质和类脂质分子、有机酸及其衍生物、未分类化合物和苯丙烷和聚酮化合物四大类。经相关性分析发现,在1和24月龄关中奶山羊睾丸发育过程中,脂质和类脂质分子与甘油磷脂呈最大正相关,羧基及其衍生物与甘油磷脂呈最大负相关。对不同的代谢物进行富集分析,筛选出7条潜在的重要代谢通路,分别为肿瘤中的胆碱代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、肿瘤中的中心碳代谢、铁死亡、谷胱甘肽代谢、氨酰-tRNA生物组成以及牛磺酸和亚牛磺酸代谢。【结论】 本试验从代谢组学角度揭示了1和24月龄关中奶山羊睾丸的差异代谢物及代谢机制,为今后哺乳动物睾丸的发育研究奠定了基础。     

关中奶山羊FGF2基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】对关中奶山羊成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2,FGF2）基因进行克隆及生物信息学分析,并检测其在山羊各组织中的表达差异,为后续探究该基因的功能奠定基础。【方法】以关中奶山羊乳腺cDNA为模板,采用RT-PCR技术扩增并克隆关中奶山羊FGF2基因完整CDS区序列,进行相似性比对、系统发育树构建及生物信息学分析;运用实时荧光定量PCR方法检测FGF2基因在关中奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢组织中的表达情况。【结果】关中奶山羊FGF2基因编码区长468 bp,可编码155个氨基酸,分子质量为17.26 ku,理论等电点为9.58,其中含量最高的是甘氨酸,占10.3%。相似性比对结果表明,关中奶山羊FGF2氨基酸序列与人、牛、马、兔、绵羊、虎鲸和野猪的相似性分别为98.7%、99.4%、100.0%、98.7%、99.4%、99.4%和62.6%。系统进化树显示,FGF2基因在不同物种间具有高度保守性,与马的亲缘关系最近。关中奶山羊FGF2蛋白不稳定指数为38.39,属于稳定亲水性蛋白质,不含跨膜结构和信号肽;FGF2蛋白二级结构含有α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲,分别占比10.32%、14.19%、30.97%、44.52%。蛋白质互作预测分析显示,FGF2蛋白与FGFR、KDR、FGF1、FGFR4、MET和FGFR1等与乳腺生长发育相关的蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR检测到关中奶山羊FGF2基因在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢中均有表达,在乳腺中表达水平最高,其次为卵巢,在背最长肌中的表达水平最低。【结论】关中奶山羊FGF2基因CDS区序列长468 bp,编码155个氨基酸,为亲水蛋白,二级结构以延伸链和无规则卷曲为主。FGF2基因在关中奶山羊泌乳高峰期的不同组织中均有表达。本试验结果为进一步探究FGF2基因在关中奶山羊乳腺发育中的作用及其具体功能提供了参考。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体1A8的基因克隆及序列测定

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从分泌具有中和活性的抗Ａ型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体（ＭcＡb）的杂交瘤细胞１Ａ８中,扩增出抗体ＶＨ和ＶＬ基因,用linker（Ｇ１y４Ｓir３） ３基因,将ＶＨ和ＶＬ基因连接成ＳeＦＶ基因,并将其克隆至pＧＥＭ－Ｔ载体中。经核甘酸序列分析证实,ＶＨ和ＶＬ基因及linker基因拼接正确,基因全长７２９bp,经计算机分析,ＶＨ和ＶＬ基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。     

奶牛产气荚膜梭菌的分离鉴定与药物敏感性分析

本研究旨在对从奶牛内脏、组织病料样品中分离得到产气荚膜梭菌并进行鉴定分型,为后续疫苗研究提供材料,并通过药敏试验筛选出较为敏感的药物以针对性的指导牧场对牛群进行治疗并提出有效的防治隔离建议。2019年山东21家牧场部分奶牛出现腹泻、便血及短期内死亡等现象,对部分死亡奶牛进行剖检,并送检64份内脏、组织病料样品进行CP培养初筛,对初筛阳性菌株用生化鉴定及PCR分型鉴定;以16S rDNA技术对CP菌株进行同源性分析;采用E-test法测定分离菌对7种抗菌药物（红霉素、左氟沙星、利奈唑胺、万古霉素、克林霉素、四环素、利福平）的最低抑菌浓度（micro inhibition concentration,MIC）,筛选出敏感药物。8份样品血琼脂培养基细菌培养出现灰白色菌落,梭菌显色培养基培养为橘红色梭菌典型特征菌落;生化鉴定结果符合产气荚膜梭菌特征;PCR分型结果显示5株为A型、2株C型和1株E型;16S rDNA分析得出8株分离菌与产气荚膜梭菌同源性最高可达100%;8株CP菌株对7种药物敏感,其中2株对克林霉素、利福平更为敏感,3株对红霉素及利奈唑胺敏感,1株对左氟沙星更敏感。对有病牛的2家牧场推荐使用林可酰胺类、利福霉素类及大环内酯类药物进行防治,对牧场防治效果及时追踪,对于没有治疗价值的牛立即扑杀,无害化处理,改善饲养条件,减小饲养密度。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体的基因克隆及核苷酸序列分析

应用 RT-PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 ( Mc Ab)的杂交瘤细胞 2 E3中 ,扩增出抗体 VH 和 VL 基因 ,用 linker( Gly4Ser) 3基因 ,将 VH 和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆至 p GEM-T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 72 6bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH 和VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 ( B)和轻链κ 家族     

关中奶山羊CSN1S1基因克隆、生物信息学及组织表达谱分析

【目的】通过分析关中奶山羊αs1-酪蛋白(alpha-s1 casein, CSN1S1)基因组织表达谱及其生物信息学功能,初步探究CSN1S1基因在奶山羊乳成分合成中发挥的作用。【方法】以关中奶山羊为研究对象,利用PCR扩增并克隆CSNIS1-1和CSN1S1-2 2个突变形态,并利用ProtParam、NetPhos、SingalP 4.1 Server、NPS和Phyre2等多种生物信息软件和在线工具对CSN1S1基因及其突变形态的蛋白质结构、理化性质、磷酸化位点等进行分析,通过实时荧光定量PCR检测CSNIS1-1和CSN1S1-2在关中奶山羊肝脏、脾脏、乳腺、肾脏、子宫、输卵管6个组织中的相对表达量。【结果】关中奶山羊乳腺上皮细胞中存在CSN1S1-1和CSN1S1-2 2种突变形态。对测序结果比对显示,CSN1S1-1存在3个碱基的突变,CSN1S1-2不仅存在3个碱基的突变,还存在6个碱基的缺失。CSN1S1-1与CSN1S1蛋白相似性为99.07%,CSN1S1-2与CSN1S1蛋白相似性为97.20%。蛋白理化性质分析显示,CSN1S1-1中碱基的突变导致第31位亮氨...     

全基因组测序在畜禽中应用的研究进展

在基因组研究方面,目前全基因组测序已由第一代测序技术发展到第三代测序技术,全基因组测序与传统方法相比具有更加全面、精准、高效等优势。随着测序技术的发展和费用的降低,全基因组测序（whole genome sequencing,WGS）技术逐渐成为基因组研究应用最广泛的技术。全基因组测序已经在畜禽起源进化、重要经济性状基因挖掘、分子育种等方面取得了诸多成果。通过全基因组重测序,能够发现拷贝数变异（copy number variation,CNV）及单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）变异,丰富现有的CNV和SNP数据库,为抗病、生长、食欲、代谢调节、表型、环境适应机制及重要经济性状基因的分析提供重要数据。作者针对全基因组测序技术在主要畜禽上的研究进展,综述了全基因组测序在畜禽的品种遗传多样性、群体演变机制、功能基因挖掘等研究中的应用,并探讨了全基因组测序存在的问题,旨在为畜禽种质资源保护和分子育种实践提供参考。