非洲猪瘟病毒MGF 360-9L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

前期研究结果表明，非洲猪瘟病毒（ASFV） MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答，故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列，进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法，分析该基因的一级结构并预测该基因的表达蛋白二、三级结构；根据GenBank公布的Georgia 2007/1（FR682468.1）序列，合成MGF 360-9L基因并构建其重组真核表达质粒，Western blot验证该基因表达后，将重组质粒转染至PK-15细胞，经染色后观察其蛋白的亚细胞定位。结果表明，以Ⅱ型Georgia 2007/1基因组中MGF 360-9L基因为参照，其在Ⅱ型ASFV毒株中高度保守，在54株不同基因型毒株间的相似性与ASFV系统进化关系一致，保守序列为3'末端378 bp片段，高级结构以α螺旋为主，核定位序列预测其定位于细胞核内；构建真核表达质粒，成功表达目的蛋白且定位于细胞核内。本研究结果为进一步研究MGF 360-9L基因抑制免疫应答和明确MGF 360基因家族在ASFV的致病机制积累了资料。     

非洲猪瘟病毒多基因家族MGF360-13L基因功能的初步研究

旨在初步探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)多基因家族MGF360-13L基因的功能。使用生物信息学软件对MGF360-13L基因进行分析;构建真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L并转染至293T细胞进行表达;利用同源重组方法构建基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,以相同的感染复数(MOI=0.01)在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中感染基因缺失毒株和亲本毒株(ASFV CN/GS/2018)后,利用红细胞吸附试验(HAD)计算病毒滴度并绘制体外生长曲线;以MOI=1将ASFV-ΔMGF360-13L和ASFV CN/GS/2018分别感染猪骨髓巨噬细胞(BMDM),利用qPCR和ELISA测定细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。结果表明,MGF360-13L基因在ASFV基因Ⅱ型中相对保守,编码蛋白属于非分泌型、无跨膜区、亲水性好;构建的真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L被293T细胞表达;成功获得MGF360-13L单基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,与ASFV CN/GS/2018相比,其体外复制没有显著性差异;在ASFV-ΔMGF360-13L感染BMDM后,IL-1β、IL-6和TNF-α炎性细胞因子在转录和分泌水平都显著高于ASFV CN/GS/2018。本研究成功制备了ASFV的MGF360-13L基因缺失毒株,并证实了MGF360-13L基因作为ASFV复制非必需基因具有抑制炎性因子表达的功能,这为进一步注释ASFV MGF360-13L基因功能提供了线索。     

非洲猪瘟病毒pl215L蛋白单克隆抗体的制备及其反应性研究

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高致病性的传染病,研究显示,抑制宿主干扰素(IFN)产生的能力与ASFV的致病力密切相关.本实验室前期的研究结果表明,ASFVpI215L蛋白能够显著抑制病毒诱导IFN的产生.为研究pI215L抑制Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)的机制提供物质基础,本研究构建了重组原核表...     

非洲猪瘟病毒 MGF 360-9L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

前期研究结果表明,非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答,故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列,进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法,分析该基因的一级结构并预测该基因的表达蛋白二、三级结构;根据GenBank公布的Georgia 2007/1(FR682468.1)序列,合成MGF 360-9L基因并构建其重组真核表达质粒,Western blot验证该基因表达后,将重组质粒转染至PK-15细胞,经染色后观察其蛋白的亚细胞定位。结果表明,以Ⅱ型Georgia 2007/1基因组中MGF 360-9L基因为参照,其在Ⅱ型ASFV毒株中高度保守,在54株不同基因型毒株间的相似性与ASFV系统进化关系一致,保守序列为3′末端378 bp片段,高级结构以α螺旋为主,核定位序列预测其定位于细胞核内;构建真核表达质粒,成功表达目的蛋白且定位于细胞核内。本研究结果为进一步研究MGF 360-9L基因抑制免疫应答和明确MGF 360基因家族在ASFV的致病机制积累了资料。     

非洲猪瘟病毒MGF300-1L蛋白的生物学特性分析

为了解非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)编码的未知功能蛋白MGF300-1L的基本生物学特性，利用生物信息学手段分析了该蛋白的保守性、理化性质，并对其翻译后修饰、结构与功能进行预测；通过实时荧光定量PCR分析在病毒感染条件下MGF300-1L的表达特性；最后，利用MGF300-1L的真核表达质粒，通过激光共聚焦试验分析其亚细胞定位，并采用间接免疫荧光试验(IFA)分析其免疫原性。结果显示，MGF300-1L蛋白在基因Ⅱ型ASFV中高度保守，为碱性疏水膜蛋白，具有糖基化和磷酸化修饰，与G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(GIT2)结构的同源性为21%;MGF300-1L为ASFV的早期基因，其编码蛋白主要定位于细胞质；IFA未检测到ASFV感染猪的阳性血清中存在针对MGF300-1L蛋白的抗体。本研究发现，MGF300-1L为ASFV高度保守的非必需早期基因，其编码蛋白具有跨膜区及糖基化、磷酸化修饰，并定位于细胞质，免疫原性较差，为进一步探究MGF300-1L蛋白在ASFV复制周期中的功能奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌对BV2细胞IFN-α生成的影响

旨在探究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称金葡菌）对小胶质细胞α干扰素（interferon α，IFN-α）生成的影响，本研究先用金葡菌感染BV2细胞，检测IFN-α的mRNA表达、分泌到细胞培养液上清的量以及TBK1/IRF3通路的激活情况，再分别用TBK1抑制剂BX-795和amlexanox、NF-κB抑制剂IMD-0354处理细胞，检测TBK1/IRF3的激活以及IFN-α水平。结果表明，BV2感染金葡菌后，IFN-α转录水平在3~12 h升高，6~12 h释放量增加，呈剂量依赖性，TBK1和IRF3的转录水平和蛋白水平未发生变化，但在1~12 h其磷酸化水平升高，表明金葡菌激活BV2细胞TBK1/IRF3通路，BX-795、amlexanox和IMD-0354处理细胞后，IRF3磷酸化水平降低，IFN-α生成减少，表明TBK1和NF-κB参与金葡菌促进BV2细胞生成IFN-α。综上所述，金葡菌感染BV2后促进IFN-α生成，且该过程依赖于TBK1和NF-κB，本结果为临床防治中枢神经系统感染金葡菌提供了可能靶点和理论基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通过阻碍STAT1/STAT2核转位抑制Ⅰ型干扰素的信号转导

Ⅰ型干扰素(IFNs),IFN-α/β诱导抗病毒应答,在天然免疫抗病毒感染中起着重要作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制Ⅰ型干扰素的合成,但其是否抑制IFN的信号转导尚未明确。本研究结果发现PRRSV干扰IFN的信号转导通路。用PRRSV VR2385株感染MARC-145细胞,经IFN-α处理的感染细胞中,干扰素刺激基因ISG15和ISG56的转录、信号转导蛋白及转录激活因子(STAT)2水平均显著低于未经过IFN-α处理过的对照感染细胞。在PRRSV感染的细胞中,IFN诱导的STAT1和STAT2磷酸化及其异源二聚体的形成都未受影响,但大部分的STAT1/STAT2/IRF9的三聚体仍存在于PRRSV感染细胞的细胞质中,表明三聚体的核易位受到了阻碍。PRRSV VR2385感染的细胞中过度表达的NSP1β抑制了ISG15和ISG56的表达,并阻止STAT1的核转位,这些都表明NSP1β可能是抑制IFN信号转导的病毒蛋白。PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)也抑制INF-α刺激的ISG基因和STAT2蛋白的表达。相反,已获批上市的的低致病性疫苗株Ingelvac PRRSV MLA感染PAMs,不需要添加外源的IFN就能活化包括趋化因子和抗病毒细胞因子等IFN诱导基因的表达,且检测不出其对IFN的信号转导产生影响。这些发现都说明PRRSV通过阻碍ISGF3的核转位阻止Ⅰ型干扰素的活化和信号转导通路。     

口蹄疫病毒前导蛋白酶抑制宿主先天性免疫应答的机制

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病.口蹄疫病毒有多种机制对抗宿主的先天性免疫应答,在这个过程中病毒的前导蛋白酶(L^pro)发挥了关键作用.L^pro可切断宿主细胞帽子依赖性的蛋白翻译,抑制干扰素蛋白的合成;L^pro通过破坏核转录因子-κB (NF-κB)的完整性或减少干扰素调节因子3/7(IRF3/7)的表达,从而抑制IFN mRNA的产生;L^pro还会参与维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、TANK结合激酶1(TBK1)、TNF受体相关因子3(TRAF3)和TRAF6的去泛素化,从而影响Ⅰ型干扰素信号通路的活化.     

PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。     

非洲猪瘟病毒pI215L蛋白单克隆抗体的制备及其反应性研究

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高致病性的传染病,研究显示,抑制宿主干扰素(IFN)产生的能力与ASFV的致病力密切相关。本实验室前期的研究结果表明,ASFV pI215L蛋白能够显著抑制病毒诱导IFN的产生。为研究pI215L抑制Ι型干扰素(IFN-Ι)的机制提供物质基础,本研究构建了重组原核表达质粒pET-21a-pI215L,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后经SDS-PAGE鉴定,结果显示表达了可溶性的pI215L蛋白。进一步纯化pI215L蛋白后免疫小鼠,并经脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选,获得能够分泌pI215L蛋白单克隆抗体(MAb)的细胞株。Western blot结果显示,该MAb能够特异性识别25 ku处的外源转染过表达不同浓度的pI215L蛋白,并且能够识别感染MOI 1、MOI 10接毒剂量的ASFV编码的内源pI215L蛋白,以及感染ASFV 2 h后不同时间点表达的内源pI215L蛋白;真核表达质粒pET-21a-pI215L转染HEK293T细胞后,以及以MOI 1的ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)后分别进行间接免疫荧光(IFA)检测,结果显示,使用兔源标签HA抗体以及Flag抗体为一抗染色的细胞可见绿色荧光,使用抗ASFV pI215L MAb为一抗染色的细胞可见红色荧光,表明本实验制备的MAb可用于IFA试验,识别内外源pI215L蛋白;免疫沉淀(IP)试验结果显示,纯化的MAb能够特异性结合HEK293T细胞中外源过表达的pI215L蛋白以及ASFV感染PAMs细胞中表达的内源pI215L蛋白。本研究为进一步探究pI215L的分子免疫机制以及ASFV疫苗的研制奠定基础。     

蓝舌病毒NS4基因真核表达对IFN-β信号通路基因mRNA表达的影响

通过构建蓝舌病毒(BTV)NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,转染HEK-293T细胞,利用Western blot及荧光显微镜分析NS4蛋白的表达与亚细胞定位特征;pcDNA3.1-NS4-eGFP转染的HEK-293T细胞添加20 HAU/mL仙台病毒(SeV)刺激后,qRT-PCR法分析NS4基因表达对SeV诱导的上游识别基因RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、干扰素基因(IFN-α、IFN-β)以及干扰素刺激基因ISG15和USP18的mRNA表达水平的影响。在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP质粒24 h后,分别添加20 HAU/mL SeV刺激24,48 h,qRT-PCR结果表明,细胞内表达NS4-EGFP后,RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15及IFN-β基因mRNA表达极显著下降,随着SeV诱导时间的延长,VISA、TBK1、IKKε、USP18基因mRNA表达差异呈不显著趋势。本研究成功构建BTV NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,NS4-EGFP融合蛋白在HEK-293T细胞中主要分布于细胞核周围及细胞核内。BTV NS4基因在HEK-293T细胞内的表达显著下调SeV诱导的IFN信号通路相关基因RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β的表达,为进一步探究NS4基因在BTV拮抗宿主细胞免疫应答中的机制奠定基础。     

Bta-miR-677靶向线粒体抗病毒信号蛋白影响Ⅰ型干扰素的生成

旨在探究bta-miR-677调控Ⅰ型干扰素(IFN)表达的分子机制。将bta-miR-677转染MDBK细胞,检测Ⅰ型IFN和干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平;随后通过TargetScan预测bta-miR-677的靶基因,双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot验证bta-miR-677的靶基因;利用siRNA敲减验证靶基因对Ⅰ型IFN转录的影响。结果显示,过表达bta-miR-677组IFN-α/β的转录水平高于对照组2～4倍(P0.001),随后检测到6种ISGs(IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2)转录量上调2～16倍(P0.01或P0.001);反之,抑制表达bta-miR-677组IFN-α/β转录量下调(P0.01或P0.05),同时IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2转录量下调(P0.05或P0.01)。经TargetScan预测和双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot检测显示,bta-miR-677可靶向结合线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)的3′-UTR,抑制MAVS蛋白的表达;MAVS基因敲减后发现,IFN-α、IFN-β和6种ISGs转录量上调。研究结果表明,bta-miR-677通过靶向MAVS上调IFN-α/β转录水平,进而提高ISGs的表达量,为基于bta-miR-677研制抗病毒药物提供了重要资料。     

DDX19抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制

先天免疫是宿主防御病原感染的第一道防线,在抵抗病原感染过程中起着至关重要的作用。病原分子模式被模式识别受体所识别,激活天然免疫反应。其中,RLRs(RIG-I和MDA5)是细胞质中识别RNA的模式识别受体。当病毒感染细胞后,病毒基因组RNA释放进入细胞质,与细胞质中的RLRs结合,使其与接头分子MAVS相互作用。然后MAVS招募其它的免疫分子如TRAF3、TANK等。TANK能够与激酶TBK1、IKK着相互作用,使TBK1、IKK着发生自身磷酸化而激活。活化的TBK1、IKK着能够磷酸化IRF3,使其形成同源二聚体,进入细胞核,启动Ⅰ型干扰素基因的转录。     

Bta-miR-677靶向线粒体抗病毒信号蛋白影响Ⅰ型干扰素的生成

旨在探究bta-miR-677调控Ⅰ型干扰素（IFN）表达的分子机制。将bta-miR-677转染MDBK细胞,检测Ⅰ型IFN和干扰素刺激基因（ISGs）的转录水平;随后通过TargetScan预测bta-miR-677的靶基因,双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot验证bta-miR-677的靶基因;利用siRNA敲减验证靶基因对Ⅰ型IFN转录的影响。结果显示,过表达bta-miR-677组IFN-α/β的转录水平高于对照组2~4倍（P<0.001）,随后检测到6种ISGs（IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2）转录量上调2~16倍（P<0.01或P<0.001）;反之,抑制表达bta-miR-677组IFN-α/β转录量下调（P<0.01或P<0.05）,同时IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2转录量下调（P<0.05或P<0.01）。经TargetScan预测和双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot检测显示,bta-miR-677可靶向结合线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）的3'-UTR,抑制MAVS蛋白的表达;MAVS基因敲减后发现,IFN-α、IFN-β和6种ISGs转录量上调。研究结果表明,bta-miR-677通过靶向MAVS上调IFN-α/β转录水平,进而提高ISGs的表达量,为基于bta-miR-677研制抗病毒药物提供了重要资料。     

轮状病毒感染对宿主天然免疫影响的研究进展

轮状病毒是导致许多哺乳动物严重腹泻的主要病原,它的入侵会导致宿主细胞抗病毒状态的建立,如病毒核酸与RIG-Ⅰ、MDA5、LGP2、dsRNA依赖的蛋白激酶及NLR炎症小体作用,导致IFN的分泌和细胞焦亡等;非结构蛋白NSP4会激活NF-κB信号通路。但轮状病毒也进化出多种策略来对抗宿主的天然免疫,其中以非结构蛋白1(NSP1)研究较多,NSP1可抑制STAT-Y701磷酸化,降解干扰素调节因子、MAVS和β-TrCP等,进而阻止IFN-β和NF-κB信号通路的激活;VP3降解MAVS,拮抗OAS/RNase L通路激活阻止宿主细胞对病毒RNA的应答;VP2、NSP2、NSP3也发挥了一定拮抗天然免疫的作用。论文主要对轮状病毒各蛋白调控宿主天然免疫的机制进行综述,以期为轮状病毒感染防控、新型疫苗研制等提供参考。     

RIG-Ⅰ样受体信号传导通路与调控机制研究进展

视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)为RLRs受体家族的成员,是比较关键的细胞质内病原体识别受体,可识别细胞内的单链、双链等RNA病毒成分,被激活的RIG-Ⅰ受体及其CARD在TRIM25的作用下连接泛素链使其寡聚化,通过与线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)相互作用,激活MAVS及下游转录因子IRF3和NF-κB,从而诱导Ⅰ型干扰素和炎性因子的表达,最终介导宿主的抗病毒免疫应答。鉴于RIG-Ⅰ持续激活可导致炎性因子对自身细胞的损伤,因此RIG-Ⅰ样受体信号通路受到宿主严格的调控。而某些病毒为逃避宿主细胞的免疫应答,进化出多种机制靶向调节RIG-Ⅰ及MAVS,从而阻断信号通路。论文从RIG-Ⅰ识别病毒机制、激活下游信号传导、宿主细胞对信号传导途径的调控以及病毒逃避机制等方面重点阐述RIG-Ⅰ所介导的天然免疫反应。     

猪干扰素调节因子1在细胞抗病毒天然免疫应答中的作用

从猪肺泡巨噬细胞中克隆了猪干扰素调节因子1(interferon regulatory factors 1,IRF1)基因,并构建了真核表达载体pCAGGS-HA-IRF1。将该质粒转染PK-15后通过Western-blot确定IRF1蛋白在细胞内能够高效表达。通过体外抗病毒试验发现,过表达IRF-1能够显著抑制H1N1流感病毒和猪水泡性口炎病毒的复制。进一步通过双荧光报告系统发现,IRF1显著促进polyI:C诱导的猪IFN-β、ISRE和NF-κB启动子的活性,说明IRF1可能通过增强细胞的天然免疫应答进而发挥抗病毒功能。     

MDA5在先天性免疫抗病毒作用中的研究进展

黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene-5,MDA5)是胞浆内核酸受体,与病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)相结合,特异性地识别较长的双链RNA,功能与视黄酸诱导表达基因Ⅰ(retinoic acid-inducude gene Ⅰ,RIG-Ⅰ)相似,通过自身级联激活和招募结构域(CARD)与接头蛋白CARD同源相互作用之后,与接头蛋白线粒体连接蛋白(MAVS)(也叫VISA、Cardif或IPS-1)结合,相互作用后会导致RIG-Ⅰ样受体(RLR)在内膜上重新定位,一边招募来TRAF2/TRAF6活化IKK激酶复合物,从而激活转录因子NF-κB;另一边招募来TRAF3和TBK1,从而促进IRF3的磷酸化激活,活化后的转录因子NF-κB及IRF会进入细胞核,共同协作促进Ⅰ型干扰素基因的表达.     

牛IRF7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究旨在通过原核表达系统表达牛干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7,IRF7）蛋白,并对其进行纯化,进而制备高纯度的牛IRF7兔多克隆抗体。使用生物信息学软件预测并分析牛IRF7潜在的生物学功能,参考GenBank已公布的牛IRF7基因序列（登录号：NM_001105040.1）设计引物,利用PCR技术从牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染的MDBK细胞中扩增牛IRF7基因,连接至pMD19-T克隆载体,提取质粒连接至原核表达载体pET-28a （+）,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-28a-IRF7。将重组质粒pET-28a-IRF7转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE进行表达产物的分析与鉴定。通过Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA测定兔抗牛IRF7多克隆抗体效价,经BVDV感染细胞后,实时荧光定量PCR检测抗病毒因子IRF7的表达。生物信息学分析发现,IRF7蛋白不存在跨膜结构域,无信号肽,存在较多磷酸化位点,二级结构主要以无规则卷曲为主,与三级结构的三维模型一致,说明该蛋白可能存在很好的抗原潜力。PCR成功扩增出大小为1 497 bp的IRF7基因片段,成功表达牛IRF7蛋白,分子质量约为60 ku,间接ELISA测得兔抗牛IRF7多克隆抗体效价为1∶128 000,并可与牛IRF7蛋白发生免疫反应,感染BVDV毒株的MDBK细胞中IRF7表达量下降;BVDV感染过表达IRF7后的细胞发现,IRF7能显著促进干扰素-β（IFN-β）的表达（P<0.05）。综上,本研究成功表达纯化了牛IRF7蛋白,并制备兔抗牛IRF7多克隆抗体,为阐明牛IRF7在先天免疫抗病毒应答的分子机制提供了材料。     

哈兽研在宿主天然免疫系统抗流感病毒作用机制研究取得进展

正近日,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室在TRIM家族蛋白抗流感病毒天然免疫机制研究方面取得重要进展,该研究发现TRIM35是维甲酸诱导基因I(RIG-I)信号通路介导Ⅰ型干扰素(IFN)产生的正调控分子,阐明了TRIM35抑制流感病毒复制和致病的分子机制。TRIM家族蛋白具有的抗病毒作用和天然免疫调节功能是近年来天然免疫领域的研究热点。该研究得到了国家重点研