栽培一粒小麦α-，γ-，ω-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

为全面揭示栽培一粒小麦诱发乳糜泻（Celiac disease,CD) 的毒性和在小麦品质改良中的应用价值,根据已注册基因的保守序列分别设计2~3对特异引物,采用AS-PCR技术对栽培一粒小麦的醇溶蛋白新基因进行克隆、CD毒性肽识别和同源性分析。结果表明,从栽培一粒小麦中分别克隆得到26个具有独特编码区的α-（命名为：Gli-A-1~Gli-A-7,GenBank登陆号为JN831382-JN831385和JX828193~JX828195）、γ-（命名为：Gli-R-1~Gli-R-6,GenBank登陆号为HM120220,JX828376~JX828380）、ω-（命名为：Gli-w-1~ Gli-w-13）醇溶蛋白新基因和1个已知基因（Gli-R-7,ACJ03494）。CD毒性肽的识别分析表明,栽培一粒小麦具有较强的CD毒性,分布于醇溶蛋白的5种主要T细胞优势多肽和4种“毒性肽”除A基因组来源的α-醇溶蛋白中不含有的毒性肽Glia-α2和Glia-α外,其余多肽在克隆基因的编码蛋白中均有分布。克隆基因与已知基因的同源性分析表明,α-、γ-醇溶蛋白的推断氨基酸序列存在明显的基因组来源的差异性,而ω-醇溶蛋白基因的基因组来源差异不明显。此外,所克隆的7个α-醇溶蛋白变异相对广泛,而γ-、ω-醇溶蛋白基因的组成则相对单一,具有极高的相似度。     

济麦20 α 醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

α 醇溶蛋白不仅与小麦面粉的加工品质密切相关,也是诱发乳糜泻（celiac disease,CD）的主要活力蛋白。为了解强筋优质小麦济麦20的α 醇溶蛋白组成及其CD毒性,利用1对α 醇溶蛋白特异引物,采用基因组PCR法,从济麦20中扩增、克隆了27个具有独特编码区的核苷酸序列(命名为：JM20A 1~ JM20A 27,GenBank注册号为：JN831386~JN831392和JX828280~JX828311)。其中,18个核苷酸序列（ JM20A 1~ JM20A 18）具有完整的开放阅读框, 可编码280~313个氨基酸残基组成的α 醇溶蛋白。这18个基因的氨基酸序列除JM20A 1和JM20A 2在特征II区含有1个额外的半胱氨酸外,其他16个均具有α 醇溶蛋白的典型结构特点,含有6个保守的半胱氨酸。对CD免疫肽的分布分析发现,这18个基因的编码蛋白均符合D基因组来源的α 醇溶蛋白的特点,以不同的组合含有2~4种主要的T细胞免疫优势多肽,定位于6D染色体。与来源于栽培一粒小麦（Triticum monococcu）、拟斯脾尔脱山羊草（Aegilops speltoides）和粗山羊草（Aegilops tauschii）的92个α 醇溶蛋白的氨基酸序列的同源性分析表明,这18个基因均与来源于粗山羊的α 醇溶蛋白基因的同源性最高,进一步说明这些基因很可能来源于6D染色体。     

普通小麦品种豫麦34和郑丰5号ω-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

ω-醇溶蛋白是影响小麦加工品质和诱发乳糜泻(celiac disease,CD)的面筋蛋白之一。为给小麦加工品质的分子改良和预防乳糜泻提供参考依据,利用3对特异引物,采用基因组PCR法,从优质小麦品种豫麦34和郑丰5号中克隆获得41个ω-醇溶蛋白序列。NCBI BLAST分析表明,克隆序列与已知序列的相似度均在91%~99%之间,推断其为ω-醇溶蛋白基因家族的基因。开放阅读框识别分析表明,11个序列(Y34W-1~Y34W-7,ZFW-1~ZFW-4)具有完整的开放阅读框,可编码203~377个氨基酸残基。ZFW-4和Y34W-1在重复区的插入片段中存在1个额外的半胱氨酸残基。CD免疫肽识别分析表明,11个基因中均分布有3种ω-醇溶蛋白的T细胞免疫肽,且肽段PQQPFPQQ存在多个拷贝。聚类分析显示,ω-醇溶蛋白具有一定的基因组特异性,11个克隆的基因与尾状山羊草(Aegilops markgrafii)和粗山羊草(Aegilops tauchii)的ω-醇溶蛋白基因序列具有相对较高的同源性。     

小麦属物种ω-醇溶蛋白序列的克隆与分析

为了挖掘ω-醇溶蛋白在小麦品质育种中的潜力,利用2对引物采用基因组PCR方法分别从阿拉拉特小麦(Triticum timopheevi Zhuk.var.araraticum)、栽培二粒小麦(Triticum turgidum ssp.dicoccon)、提莫菲维小麦(Triticum timopheevi)、栽培一粒小麦(Triticum monococcumssp.monococcum)和野生一粒小麦(Triticum monococcum var.boeoticum)5个小麦属物种中克隆出ω-醇溶蛋白序列,并对其进行序列分析。结果表明,本研究共克隆到6条新的ω-醇溶蛋白序列,归属于ARH、ATN和TRQ三种类型。这些新的ω-醇溶蛋白序列的长度为927~1 095bp。在这6个序列中,除KR082150拥有两个甲硫氨酸(Met)外,其余的均缺少含硫氨基酸。进化分析表明,本研究获得的6条ω-醇溶蛋白序列聚在了2个主要的分支,其中N端第一个氨基酸为丙氨酸(Ala)的ω-醇溶蛋白聚在了一个大的分支中,而TRQ类型的则聚在了另一个分支中。     

转基因小麦插入突变蛋白的鉴定

为研究转基因小麦中插入突变蛋白的编码基因,以转基因小麦B73-6-1和受体小麦L88-6为材料,利用改良方法分离、纯化、回收目的蛋白后进行鉴定.N端测序结果显示,该蛋白N端前五个氨基酸序列(EGEAS)以及部分氨基酸序列与几乎所有高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)具有100％的同源性;同时,质谱鉴定结果显示,该蛋白的两个得分最高(96和58)的肽段(GGSFYPGETTPPQQLQQR和IFWGIPALLKR)与1Dx5亚基的同源性达到100％,初步证明该突变蛋白为新的HMW-GS.这对外源1Dx5基因整合位点的确定和外源基因整合规律的研究提供了更多依据.     

玉米品质基因聚合对子粒氨基酸组分及醇溶蛋白的影响

以玉米o2、sh2、su1、wx这4个品质基因聚合的单基因、双基因、三基因近等基因系为研究对象,对子粒氨基酸组分与醇溶蛋白SDS-PAGE带谱进行检测分析。结果表明,与郑58相比较,su1、wx、su1wx氨基酸组分变化较小,o2、sh2单基因以及含有o2、sh2的双基因、三基因近等基因系中氨基酸组分变化较大,o2sh2、o2su1、o2sh2su1赖氨酸含量较高。SDS-PAGE显示,o2与sh2、su1聚合导致19 kD和22 kDα-醇溶蛋白合成受到显著抑制。     

簇毛麦新型低分子量谷蛋白亚基的分子克隆与序列分析

为发掘低分子量谷蛋白亚基（LMWGS）新的变异类型,通过设计引物和特异PCR扩增,从簇毛麦TA2127基因组DNA中得到14个LMWGS基因,GenBank登录号分别为HQ615147～HQ615160。序列分析表明,所有基因具有完整编码区,长度为831 bp和846 bp,可编码277和282个氨基酸残基,推导的氨基酸序列分析显示,14个基因编码的蛋白序列都缺少一段N端保守区,且N端序列是一种新的类型;在14个LMWGS基因中检测到19个SNPs和1个16 bp 的缺失。系统进化分析表明,簇毛麦LMWGS与ω醇溶蛋白和HMWGS亲缘关系相对较远,与普通小麦 Glu3的低分子谷蛋白基因进化关系相对较近。     

麝香百合液泡膜水孔蛋白基因LlTIP2的克隆及生物信息学分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白,属于膜主要内在蛋白(major intrinsic proteins,MIP)超家族.采用RT-PCR和RACE法从麝香百合(Lilium longiflorum)叶片克隆得到1个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)基因的全长cDNA序列,命名为LTIP2(GenBank登录号:JN085950).该基因cDNA全长986 bp,包括208bp的3’-非翻译区,744 bp开放阅读框以及34 bp的5’-非翻译区,共编码247个氨基酸.由L1TI P2推导的氨基酸序列具有2个高度保守的水孔蛋白NPA (Asn-Pro-Ala)基序以及MIP的特征序列SGGHVNPAVTFG.同源性分析表明,LITIP2氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hirsutum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦草(Lolium perenne)和小麦(Triticum aestivum)等植物TIP2的同源性分别达77％、74％、73％和72％.系统进化树分析表明LlTIP2属于液泡膜水孔蛋白TIP2亚类新成员.     

黑粒小麦醇溶蛋白指纹图谱及其遗传分析

黑粒小麦因其具有特殊的营养价值而倍受人们青睐。我国近年来已育成和引入了一批黑粒小麦品种 (系 )和资源 ,它们的黑粒基因来源和色素分布部位不同。本研究利用 ISTA颁布的 A- PAGE标准程序分析了来源不同的 9份黑粒小麦亲本及其 1 3份后代材料的醇溶蛋白指纹图谱。结果表明 ,9份黑粒小麦亲本材料分离出 40条相对迁移率不同的谱带 ,其中 8条为共同带 ,每个亲本均有各自独特的谱带组合。采用“0～ 1”系统记录谱带 ,计算亲本间遗传距离 ,平均值为 0 .34,范围为 0 .1 0～ 0 .48。来自加拿大的京 1 1 70 5和 MY2 4 33的遗传距离为 0 .1 0 ,具有最大的遗传相似性。我国育成的漯珍 1号、乌麦 5 2 6和黑小麦 76号三者间的遗传距离在 0 .33以上。利用非加全成对算术平均法 ( UPGMA)作聚类分析 ,在 0 .34水平上可聚为 3类 ,其中漯珍 1号自成一类。黑粒小麦和白粒小麦杂种后代个体的醇溶蛋白呈共显性遗传 ,但白粒亲本北农 6号的一条带在 F1没有出现。醇溶蛋白指纹图谱的相似程度能反映出品种间的亲缘关系 ,不失为黑粒小麦育种亲本选配的一个重要依据。     

玉米opaque2突变体子粒表型及营养成分分析

通过回交转育构建o2突变型的近等基因系CAL58/o2,对其子粒进行扫描电镜和透射电镜观察,发现与CAL58相比,CAL58/o2中淀粉颗粒排列松散,形状更加规则,CAL58/o2子粒中蛋白体体积变小。分析子粒的营养成分,CAL58/o2赖氨酸含量极显著提高了55.88%,氨基酸总量显著减少9.79%,粗蛋白显著减少8.86%,粗脂肪显著增加30.96%,粗淀粉显著增加5.87%。同时,提取成熟子粒醇溶蛋白进行比较,CAL58/o2子粒的α、β-醇溶蛋白含量明显降低,γ-醇溶蛋白含量增加。     

硬粒小麦麦谷蛋白和醇溶蛋白基因的分子学分析

品种Lira具有两种生物型,分别称为生物型Υ-42和生物型Υ-45。这两种生物型的分子学分析可用作研究硬粒小麦品种品质高低差异之分子学基础的典型体系,本文即对该体系进行了仔细考查。用来自α-、β-、Υ-醇溶蛋白和高、低分子量麦谷蛋白编码的侧翼核苷酸引物进行生物型Υ-42和生物型Υ-45的聚合酶链反应分析,观测到该两种生物型之间Υ-醇溶蛋白序列的不同扩增谱带。对相同生物型进行的Southern印迹分析表明Υ-醇溶蛋白和低分子量(LMW)麦谷蛋白基因的杂交模式不同,LMW麦谷蛋白序列的杂交模式揭示在生物型Υ-45中存在附加谱带.从而表明生物型Υ-45与生物型Υ-42间决定品质差异的低分子量麦谷蛋白在数量上的差别很可能是由于生物型Υ-45中LMW基因数量高所致。这一结论似乎也得到了属于Υ-42和Υ-45型的其它硬粒小麦品种中所得结果的支持.     

影响小麦面团强度的贮藏蛋白基因表达研究

小麦品质主要由籽粒贮藏蛋白的含量和类型决定,高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GSs)组合是决定加工品质的主要因素。为了解HMW-GSs组合完全一致、蛋白含量相似的两个品种面团稳定时间相差近一倍的原因(郑麦158:高面团强度;郑麦369:低面团强度),通过转录组测序比较了籽粒发育中期3个时间点(花后14、21和28 d)的贮藏蛋白基因表达差异,分析了差异表达基因编码蛋白对面粉质量的贡献以及面粉的巯基含量差异等。结果表明,在3个时间点,两个品种间的HMW-GSs基因表达均无显著差异;郑麦158较郑麦369共有24个贮藏蛋白编码基因有显著表达差异,其中上调表达基因12个(23次),下调表达基因12个(23次)。12个显著上调表达基因中,包括9个燕麦类似蛋白基因(18次)、2个γ-醇溶蛋白基因(4次)和1个α-醇溶蛋白基因;在12个下调表达基因中,包括11个α-或α/β-醇溶蛋白基因(21次)和1个燕麦类似蛋白基因(2次)。两品种比较,郑麦158面粉的硫元素含量较低,但自由巯基和二硫键含量较高。基于蛋白二硫键预测和面粉蛋白质量评价模型分析结果,差异表达基因编码的燕麦类似蛋白和γ-醇溶蛋白对面团强...     

波兰小麦对普通小麦醇溶蛋白的改良作用

为研究波兰小麦对普通小麦醇溶蛋白的改良作用,利用酸性聚丙烯酰胺凝胶(A-PAGE)电泳技术对60个波兰小麦×普通小麦中13后代株系的醇溶蛋白位点进行了检测.结果表明,波兰小麦与普通小麦杂交后代醇溶蛋白存在丰富的变异类型,共产生了34条迁移率不同的醇溶蛋白谱带,其中,α区2条,β区24条,γ区4条,ω区4条.每个株系具有7～21条带,多数株系为12～19条,平均15.68条.醇溶蛋白遗传多样性指数(H')及多态性信息含量(PIC)分析结果显示,β区醇溶蛋白组成最为丰富,而α区最低.供试材料间存在较大的遗传变异,在GD值0.38水平上可聚为4类.波兰小麦醇溶蛋白谱带在BC<,1F<,2中出现的频率比BC<,2中更高,变异更为丰富.杂交后代中出现了4条双亲不具有的新谱带.分析表明,波兰小麦对普通小麦醇溶蛋白的改良有十分明显的作用.     

野生二粒小麦醇溶蛋白遗传多样性分析

为了进一步开发野生二粒小麦遗传资源，丰富我国小麦改良的遗传基础，对来自以色列16个地区的133份野生二拉小麦醇溶蛋白位点的遗传多样性进行了分析，并对其与务锈病抗性和播种～抽穗天数的关系进行了分析。结果发现，供试的133份野生二粒小麦共有122种谱带类型，电泳共分离出77务不同的带纹；谱带在α、β、γ、ω四个区差异较大，分别为38、83、72和87种，表明野生二粒小麦的醇溶蛋白具有较丰富的遗传多样性。比较分析发现，野生二粒小麦醇溶蛋白的遗传多样性与材料的来源地有关；来源于同地区的材料间务锈病抗性及播种～抽穗天数均较为接近，而且条锈病抗性和播种～抽穗天数与醇溶蛋白的遗传距离均有一定关系。     

小麦品种"中国春"主要过敏原CM16基因的克隆及序列分析

为了给小麦主要过敏原CM16蛋白的重组表达和免疫活性鉴定等研究奠定基础,通过生物信息学方法设计并合成简并性引物,利用RT-PCR技术对小麦主要过敏原CM16基因进行克隆,并进行序列分析. 结果表明,克隆获得了小麦主要过敏原CM16基因.基因开放阅读框为432个碱基(包括终止密码子), 编码143个氨基酸.该序列编码的蛋白相对分子质量约为15 782,等电点为5.17.序列同源性分析发现其与国外报道的已知小麦CM16基因具有很高的同源性(同源性为99%),因此认为其系小麦过敏原基因,在GenBank数据库中的登录号为EU883599.     

普通小麦及其近缘种醇溶蛋白遗传多样性分析

为了解小麦近缘种的醇溶蛋白多样性分布规律,应用A-PAGE方法对63份普通小麦及其近缘种材料进行醇溶蛋白遗传多样性分析.结果表明,电泳出现99条迁移率不同的谱带,构成63种组合,总体多态性信息指数达到0.984,以ω区最高,γ和β次之,α区最低.不同基因组构成材料多态性信息指数的分区比较发现,近缘种材料与普通小麦在α区相差最大,其中AA、AABB、AAGG基因组在α区的多态性信息指数均比地方小麦和斯卑尔脱小麦高0.164,而与广泛杂交改良的高代品系类似.谱带分布频率分析发现,高频带和中频带主要出现在ω、γ和β三个区,频率低于0.05的低频带主要出现在α区.聚类分析反映的亲缘关系基本和进化一致,但近缘种与普通小麦高代品系有交叉.此外,本文亦对小麦近缘种的醇溶蛋白分布规律及其在品质育种中的应用潜力进行了讨论.     

小麦逆境胁迫基因TaSKIP的克隆、定位及初步表达分析

非生物逆境是小麦生长、发育及产量形成的主要限制因子之一。为揭示小麦抗逆胁迫响应机制,并为培育转基因抗逆种质奠定基础,本研究利用同源克隆的方法从普通六倍体小麦中国春中克隆出TaSKIP基因并进行序列分析及基因定位,同时对TaSKIP基因在PEG6000胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,共克隆得到3个TaSKIP基因,其中2个基因被定位于6A和6D染色体上。序列分析表明,TaSKIP-6A编码区长为1 827bp,编码608个氨基酸,TaSKIP-B和TaSKIP-6D编码区长均为1 824bp,编码607个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,小麦TaSKIP蛋白与水稻、玉米和大麦等禾本科植物SKIP蛋白的同源性均大于88%,而且含有相同的SKIP/SNW结构域。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRTPCR)检测结果表明,TaSKIP在模拟干旱胁迫条件下表达量上调,暗示该基因在小麦非生物逆境胁迫响应中起重要作用。     

小麦ramosa2基因的克隆与序列分析

为了研究ramosa2基因在小麦中的功能,以普通小麦(Triticum aestivum L)中国春基因组为模板,玉米、高梁、水稻和大麦中ramosa2基因保守序列为参考设计引物,扩增到1条全长为771 bp的目的片段.序列分析表明,该核酸序列与高梁、玉米、水稻和大麦中ramosa2基因的同源性高达82.9%～95.2%;其预测编码的氨基酸序列与高粱、玉米、水稻和大麦ramosa2基因的氨基酸序列同源性达79.2%～95%.     

花生(Arachis hypogaea L.) CaM基因克隆与序列分析

提取花生(Arachis hypogaea L.)幼嫩叶片基因组DNA,合成5'端和3'端引物,进行PCR并克隆测序,得到CaM基因组的2个异型基因PGCaM-1和PGCaM-3,登录Genebank并注册为AY517933、AY572856。序列分析表明,PGCaM-1序列全长1425 bp,在第25个氨基酸之后有一个长度为973 bp的内含子,PGCaM-3序列全长447 bp。两个异型基因的开放读码框均由447个核苷酸组成,共编码148个氨基酸,同属于EF手型CaM超家族成员,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为96%和98%,与已知花生CaM cDNA序列及氨基酸均有极高的同源性,序列之间的差异可能引起表达和功能上的差异。     

小麦和黑麦品种醇溶蛋白的比较分析

为了分析普通小麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白的异同,运用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳法和反相高效液相色谱法对4个普通小麦品种和4个黑麦品种的醇溶蛋白进行了比较分析.在酸性电泳分析方法中,4个普通小麦品种共分离出16条迁移率不同的谱带,而4个黑麦品种共分离出10条谱带,每个品种在α、β、γ、ω四个区的分布频率也不相同.从谱带出现的频率和染色的深浅可明显看出普通小麦的醇溶蛋白含量远远大于黑麦品种.在反相高效液相色谱分析方法中,普通小麦分离出12～18个组分,黑麦品种分离出6～12个组分;普通小麦不同类型的醇溶蛋白出峰时间比较紧凑,而黑麦的出峰时间差异较大.反相高效液相色谱分析方法能很好地分离醇溶蛋白,且其更快速、简便、所需样品量少.