4株凡纳滨对虾肠道益生菌分离、鉴定及应用研究

为将凡纳滨对虾肠道分离的益生菌用于对虾的养殖,利用乳酸菌培养基分离对虾肠道中的益生菌并对菌株进行初步分类鉴定,利用体外抑菌方法筛选有抗菌活性的菌株,用于考察对虾实验室养殖过程中抗有关致病菌的效果。试验结果显示,自虾肠道分离得到W7、W25、W27、W31菌株,分别属于啤酒酵母、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌沙漠亚种和暹罗芽孢杆菌,它们对致病菌副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有一定的抗菌活性,其中暹罗芽孢杆菌W31抗菌效果最好。将啤酒酵母W7和暹罗芽孢杆菌W31菌体与饲料混合用于对虾的养殖,能够明显增强凡纳滨对虾抵抗弧菌侵染的能力,提高存活率。     

饲料中添加潜在益生菌对凡纳滨对虾肠道消化酶活性和菌群组成的影响

在基础饲料中添加不同配伍的坚强芽孢杆菌Bacillus firmus活菌（1.0×108CFU/g）、美人鱼发光杆菌Photobacterium damsela灭活菌（1%）和溶藻弧菌Vibrio alginolyticus灭活菌（1%）作为实验饲料,基础饲料为对照组。实验所用凡纳滨对虾初始质量为3.2±0.26 g,投喂15d后进行WSSV感染实验并继续观察14d。实验期间定期取样测定对虾肠道胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性变化,并分析可培养肠道细菌总数和优势菌数量。结果表明,实验组对虾肠道中胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性整体水平均显著高于对照组（P<0.05）,肠道细菌数量较对照组有显著增加。其中,坚强芽孢杆菌与美人鱼发光杆菌灭活菌复合菌组具有最高的淀粉酶活性,坚强芽孢杆菌与溶藻弧菌灭活菌复合组具有最高的脂肪酶和胃蛋白酶活性,而坚强芽孢杆菌单一组具有最大的肠道细菌总数和优势菌数。本研究表明,饲料中添加潜在益生菌可以提高凡纳滨对虾肠道消化酶活性并调节肠道菌群变化,利于养分的消化吸收。其中以坚强芽孢杆菌与美人鱼发光杆菌灭活菌复合组的整体效果较佳。     

几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异免疫力和抗病力的影响

以基础饲料为对照组,在基础饲料中分别添加坚强芽孢杆菌活菌(Bacillus firmus)、坚强芽孢杆菌活菌(1.0×108 CFU/g)+美人鱼发光杆菌(Photobacterium damsela)灭活菌(1％)、坚强芽孢杆菌活菌(1.0×108 CFU/g)+溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)灭活菌(1％)配制3种免疫饲料.每组3个重复,对个体质量为(3.2±0.26)g的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行了为期30d的养殖实验.每5d取样,以血清中的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(UL)活性为免疫指标,探讨了肠道益生菌及其灭活菌体作为免疫制剂对凡纳滨对虾非特异性免疫水平的影响;在投喂免疫饲料后的第16天,按0.9 g/10尾剂量,直接投喂感染白斑综合征病毒(wssV)对虾病料,计算各实验组每天的累计死亡率,分析肠道益生菌及其灭活菌体作为免疫制剂对凡纳滨对虾病毒感染能力的影响.结果显示:添加益生菌的实验组对虾血清中SOD、ACP、AKP和NOS活性明显高于对照组(P＜0.05),特别是显著提高了对虾抗WSSV感染的能力.其中坚强芽孢杆菌活菌(1.0× 108 CFU/g)和美人鱼发光杆菌灭活菌(1％)实验组的抗病毒感染能力最强,感染WSSV 14 d后累计死亡率为10.71％;而对照组为64.28％.结论认为,饲料中添加肠道益生菌及其灭活菌体能提高凡纳滨对虾非特异性免疫水平和抵抗疾病的能力,有望作为新型对虾免疫增强剂应用于对虾养殖业.     

天津市周边地区养殖凡纳滨对虾肠道菌株的分离鉴定及耐药性分析

随着抗生素在水产养殖业中的普遍应用,细菌耐药性成为环境和食品安全的主要问题。本文旨在通过对天津地区养殖凡纳滨对虾体内细菌的耐药信息进行分析统计,为凡纳滨对虾养殖业的疾病控制和提高水产品安全性提供理论指导。本研究对天津市津南区、汉沽区及西青区等对虾养殖基地取样的凡纳滨对虾进行肠道微生物的分离培养,抗生素药敏实验以及抗生素抗性基因的检测。共获得菌株1 219株,选取其中有代表性的215株菌株进行鉴定,结果显示,所鉴定菌株属于56种不同种属,主要以芽孢杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、席罗弧菌、溶藻弧菌、格氏乳球菌、希瓦氏菌、霍氏肠杆菌、库特氏菌、施氏假单胞菌、荚膜红细菌、液化沙雷氏菌、不动杆菌、假单胞菌、假交替单胞菌及霍乱弧菌等为主。所鉴定菌株的抗生素药敏实验分析结果发现,凡纳滨对虾肠道微生物普遍存在抗生素抗性,其中β-内酰胺类的氨苄西林、糖肽类的杆菌肽、喹诺酮类的罗美沙星和磺胺类的磺胺抗药性最为明显。因此本文进一步对其中耐药种类较多且耐药性较强的82株细菌对四大类抗生素(链霉素类、磺胺类、四环素类和青霉素类)的抗性基因(str A-str B,sul II,sul II,sul III,tet A,tet C,tet G,blao XA-1,bla PSE-1,bla TEM)以及整合子(in T1和in T2)携带情况进行检测。研究结果表明,所检测耐药菌株均携带抗性基因,其中磺胺类抗性基因的检出率最高,可达63%,其次是青霉素类抗性基因,检出率为61.4%,整合子基因平均检出率为42.1%,四环素类相对较少为35.4%,且四环素类只检测出tet A抗性基因,其中67.1%的菌株存在多种耐药基因。     

Biolog-ECO方法探究饲喂益生菌对凡纳滨对虾肠道微生物代谢及有效作用时间的影响

以霍氏肠杆菌(E3)和乳酸菌(R3)2株益生菌对凡纳滨对虾进行为期4周的养殖饲喂实验,饲喂后期利用Biolog-ECO方法对实验组及空白组的凡纳滨对虾肠道微生物菌群多样性的差异进行比较分析,以评价益生菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群代谢功能的影响。结果显示,添加霍氏肠杆菌(E3)或乳酸菌(R3)的实验组,与空白组相比较,平均每孔颜色变化率显著上升,表明益生菌增强了肠道微生物活性;凡纳滨对虾肠道微生物利用各类碳源的整体能力显著增强,表明益生菌可以促进水产动物的代谢功能;肠道微生物多样性指数(包括Shannon、Simpson和McIntosh指数)有明显差异,表明饲喂2株益生菌可以提高凡纳滨对虾肠道菌群的丰富度。其中,停喂霍氏肠杆菌后第1天和第5天取样结果表明,Shannon指数显著降低,Simpson和McIntosh指数显著升高;停喂乳酸菌后的第1天和第5天取样结果表明,Shannon指数无显著差异,Simpson和McIntosh指数显著升高;二者在第10天取样的结果中均无显著差异,表明饲料中添加益生菌可以改变凡纳滨对虾肠道内原有菌群的数量和结构,促进对虾肠道内微生物群落间复杂的相互作用,进而在维持或者促进对虾健康方面发挥着重要的作用,同时也表明此两株益生菌在凡纳滨对虾肠道中停留时间最少为5 d。     

益生菌在凡纳滨对虾育苗中的应用

实验研究了在凡纳滨对虾育苗中添加益生菌(芽孢杆菌、光合细菌或芽孢杆菌 光合细菌)对水体中pH值、H2S、COD、NH 4N、NO-2N和幼体成活率的影响。结果表明:光合细菌对提高水体的pH值有一定作用,而芽孢杆菌对pH值无显著影响;益生菌能显著降低水体中的H2S、NH 4N和NO-2N含量,其中光合细菌去除H2S和NO-2N的效果略优于芽孢杆菌,而芽孢杆菌去除NH 4N的能力比光合细菌强;实验中COD均在较适宜范围,益生菌对COD无显著影响。5mg·L-1芽孢杆菌和1mg·L-1芽孢杆菌 10mg·L-1光合细菌能显著提高育苗成活率。在实验中,1mg·L-1芽孢杆菌 10mg·L-1光合细菌的综合效果最佳,芽孢杆菌和光合细菌具有协同作用。     

益生菌对凡纳滨对虾免疫功能及肠道菌群的影响

以类芽孢杆菌和双歧杆菌为益生菌,添加到凡纳滨对虾(平均体质量3.45g)的饲料中,饲养28d(水温25~27℃,盐度25~26,pH 7.8~8.1,溶解氧6mg/L),采用南京建成试剂盒和变性梯度凝胶电泳技术,研究益生菌对凡纳滨对虾免疫功能及肠道菌群的影响。结果表明,益生菌能够显著提高对虾血清过氧化物酶(对照组43.22U/mL,试验组76.33U/mL)、超氧化物歧化酶(对照组60.61U/mL,试验组101.18U/mL)、一氧化氮合酶(对照组7.54U/mL,试验组12.44U/mL)、酸性磷酸酶(对照组0.0446U/mL,试验组0.0574U/mL)和碱性磷酸酶(对照组0.0183U/mL,试验组0.0236U/mL)的活性(P0.01),明显改善对虾肠道的菌群组成,从而提高对虾抵抗疾病的能力。     

凡纳滨对虾内源优势腐败菌的分离和鉴定

为了确定凡纳滨对虾在冷藏条件下内源优势腐败菌的种类,实验采用了细菌分离纯化法,将分离得到的内源腐败菌菌株进行分解蛋白质对比实验,筛选出分解蛋白质能力较强的菌株,进一步采用细菌自动生化系统鉴定法以及16S rRNA序列测定法进行鉴定,实验结果显示凡纳滨对虾在冷藏条件下的内源优势腐败菌是短杆菌属细菌,可以通过控制短杆菌属细菌的方法进行研究对虾内源保鲜技术。细菌自动生化系统鉴定结果的相似度为98.8%,16S rRNA序列鉴定结果的相似度为99.065%。     

凡纳滨对虾饲料添加剂的研究进展

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾,是目前世界养殖产量最高的三大虾种之一,具有对水环境抗逆能力强、营养要求低、生长速度快,虾体含肉量大、肉质鲜美、营养丰富等诸多优点,自1998年来,在广东、广西、海南等省(区)广为     

凡纳滨对虾养殖成本控制浅析

本文主要从养殖管理、饵料选择投喂及苗种选择等几方面介绍了凡纳滨对虾在养殖过程中成本控制技术要点,为指导生产实践提供借鉴。     

2株消化道优势菌对凡纳滨对虾免疫酶活性和抗白斑综合征病毒感染力的影响

以凡纳滨对虾为研究对象,在基础饲料中分别添加从健康对虾消化道中分离纯化的优势菌菌株——美人鱼发光杆菌PC463和坚强芽孢杆菌PC465(菌含量≥1011CFU/g)的活菌和破碎菌各1 g/kg,观察其对凡纳滨对虾血淋巴免疫酶活性和抗WSSV感染保护率的影响。经过20 d养殖实验后发现,与对照组相比,饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫实验,其凡纳滨对虾血淋巴中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性在不同程度上有所提高,并显著高于对照组(P<0.05)。WSSV感染后饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组存活率(53%±12%)和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫组存活率(49%±15%)显著高于对照组(P<0.05)。结果表明:饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌和美人鱼发光杆菌灭活菌可以在一定程度上提高凡纳滨对虾免疫酶活性和抗WSSV感染能力,上述有防病作用的益生菌株以饲料添加剂的方式应用于对虾养殖生产,可望成为对虾白斑病生物防治的有效途径之一。     

健康和患病凡纳滨对虾幼虾消化道菌群结构的比较

凡纳滨对虾养殖过程中,早期阶段是病害易感阶段,而消化道菌群结构与对虾健康关系密切。因此,探讨幼虾的消化道菌群尤其是弧菌类细菌与对虾发病的关系对病害有效防治具有重要意义。本实验采用Illumina测序研究了凡纳滨对虾健康和患病幼虾的消化道细菌群落结构,并基于纯培养和16S r DNA,rec A和pyr H基因序列比对,分析了幼虾消化道中弧菌的主要种类组成。结果发现,健康幼虾消化道中α-变形菌纲和厚壁菌门丰度较高,而患病幼虾中γ-变形菌纲、拟杆菌门、放线菌门和β-变形菌纲较高,其中放线菌门丰度差异显著。基于科水平的响应比分析,发现患病幼虾消化道中动性球菌科和噬菌弧菌科的丰度显著降低,而弧菌科的丰度显著升高。相似度分析发现,驱动群落变异的OTU主要来源于弧菌属、海洋杆状菌属、冷杆菌属、假交替单胞菌属以及未分类至属的红杆菌科和微杆菌科。健康幼虾消化道弧菌组成以锡那罗亚州弧菌为主,而患病幼虾消化道弧菌组成以坎氏弧菌为主。尽管健康和患病幼虾消化道内细菌群落结构整体差异不显著,但一些重要类群丰度变化显著,其特征与已知的生态功能一致。     

凡纳滨对虾养殖环境及肠道微生物群落特征分析

为探究凡纳滨对虾养殖过程中其肠道和养殖环境微生物群落的结构及变化,本实验采用Illumina MiSeq测序平台,基于16S rRNA基因的测序结果,对46和86 d虾龄的凡纳滨对虾肠道以及养殖水样、底泥中的微生物群落进行分析。结果显示,86 d时微生物Shannon-Wiener多样性指数显著高于46 d,水样中的Shannon-Wiener指数显著低于底泥和凡纳滨对虾肠道;有35个门、70个纲、152个目、274个科以及420个属在水样、底泥和虾肠道中均能检测到,其中虾肠道和底泥间共有菌类较水样中更多。微生物群落随养殖时间增加发生变化,46与86 d的差异性门类为放线菌门、绿菌门、丝状杆菌门、浮霉状菌门和TM6,相对丰度随时间增加而增高。水样、底泥和虾肠道中有相对固定的优势菌群,在水样、底泥和虾肠道中主要的门类均为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门,优势纲类为α变形菌纲、β变形菌纲以及放线菌纲,除此以外,虾肠道与底泥共有的优势纲为δ变形菌纲、γ变形菌纲以及芽单胞菌纲;从目、科、属的分类水平上看,水样、底泥和虾肠道中菌类相对丰度各异,鲜有明显重叠的优势菌类,在水样、底泥和虾肠道中均为一种未...     

高通量测序法分析两株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

为分析荚膜红细菌和蜡样芽孢杆菌2株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响,本实验对凡纳滨对虾进行为期30 d的养殖饲喂实验,饲喂后期利用高通量测序凡纳滨对虾肠道微生物的16S rDNA V4区,来分析不同益生菌饲喂后凡纳滨对虾肠道菌群的结构特征,并结合对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的宏观指标来进行分析。结果显示：①空白组（CK）、荚膜红细菌组（Rc）和蜡样芽孢杆菌组（Bc）样品OTU范围为374~506,其中CK组对虾肠道菌群OTU数量最低,饲喂益生菌后的2组对虾肠道菌群中OTU数量相对较高;②在门分类水平上,3组的变形菌门数均为最多,CK组主要为变形菌门和少量拟杆菌门,Bc组主要有变形菌门、拟杆菌门、无壁细菌门、厚壁细菌门和假单胞菌,Rc组主要是变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、放线细菌、梭杆菌门和蓝细菌;③稀释曲线和Shannon指数结果可见,CK组样品物种丰度和复杂度最低,且Bc组样品丰度和复杂度相对较高;④PCA分析发现,Rc组和CK组样品微生物组成较为接近,结合宏观对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的结果分析,可见相较于荚膜红细菌,蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群影响更显著,且益生效果更佳。研究表明,饲喂益生菌可以扩增对虾肠道微生物菌群丰度,并能抑制弧菌属等有害菌群的生长,提高对虾体质量增加率并降低死亡率,从而达到益生效果,其中以饲喂蜡样芽孢杆菌菌株效果更佳。     

一株芽孢杆菌PC024的鉴定及其抗WSSV感染效果的研究

为了筛选WSSV的防病益生菌株,从健康中国明对虾消化道分离纯化一株芽孢杆菌PC024,经Biolog碳源利用反应、ATB微生物自动鉴定系统、脂肪酸气相色谱分析得出该菌株与坚强芽孢杆菌的生理生化特性最为相似,该菌株为革兰氏阳性菌,有一根端极鞭毛;细胞呈球杆状,有椭圆芽孢;单个菌落呈圆形,中间略微凸起;16S rRNA序列分析表明,该菌株与坚强芽孢杆菌进化地位最接近,同源性均达到100％,综合以上4种方法的鉴定结果,该菌株被鉴定为坚强芽孢杆菌.将已鉴定的PC024菌株粘附于对虾饲料表面投喂给凡纳滨对虾20 d后,进行WSSV肌肉注射感染,测定投喂和感染后对虾血淋巴上清和肝胰腺的免疫相关酶活性,并对对虾肠道总菌数和添加菌PC024进行计数及鉴定.结果表明:添加该菌的实验组对虾相对存活率高,相对保护率达33.7％;投喂含该菌饲料的实验组对虾血清和肝胰腺的相关免疫酶活性较对照组显著提高,对虾肠道总细菌数始终显著高于对照组,并在实验组能够分离得到坚强芽孢杆菌,坚强芽孢杆菌PC024可作为WSSV的防病益生菌株应用于对虾养殖生产.     

凡纳滨对虾多个引进群体的杂交配合力分析

利用人工授精技术,通过双列杂交和巢式交配设计,以7个凡纳滨对虾群体生产家系130个,建立育种基础群体.利用混合线性模型和广义线性模型,结合约束极大似然法估计不同引进群体体质量和存活性状的一般配合力(general combining ability,GCA)和特殊配合力(special combining ability,SCA).结果显示,对于体质量性状,UA5、UA4和SIN 3个群体的GCA值最高,分别为0.42、0.32和0.19;17个杂交组合中,UA5×SIN、UA1×UA2、UA4×UA5、UA4×SIN和UA1×SIN 5个组合体质量和存活性状的SCA值正向优势较明显,是生产优良子代的优先搭配组合;体质量和存活性状配合力方差分析结果显示,不同环境下体质量性状GCA和SCA方差组分所占比例不同,但总体差异不大;相关性分析显示,不同环境下体质量性状配合力之间存在正相关,而存活性状存在负相关.     

玉足海参与凡纳滨对虾的混养效果

在室内条件下进行了玉足海参与凡纳滨对虾的混养实验,分析了单养与混养两种条件下养殖水体营养盐结构以及底质成分的变化,测定了对虾与海参的存活率与生长性能。结果显示,混养海参可以明显改变养殖系统的营养盐结构,可使水体中的磷酸盐和硝酸盐浓度有所升高,同时也可有效地控制系统中氨氮浓度。混养海参也可以大幅度地降低沉积物中有机质和硫化物含量,实验结束时混养组硫化物含量为(7.71±1.33)mg/kg,仅相当于单养组浓度的1/3。混养海参对对虾生长及存活具有明显的促进作用,其中混养组对虾体长特异增长率为(0.69±0.13)%/d,显著优于单养组(0.45±0.06)%/d;混养组对虾成活率可达72.5%±22.9%,显著高于对照组55.0%±17.5%。在混养系统内,对虾不会对海参的生存造成负面影响,海参能够有效地选择摄食和利用沉积物中的营养物质(对食物中有机质的同化率可达36.36%±13.79%),并以较快的速度生长。结果表明,在对虾养殖系统中混养玉足海参具有明显的环境与经济效益。本研究可为我国海水养殖业的可持续发展提供一定的科学依据。