大口黑鲈肌肉生长抑制素基因单核苷酸多态性位点的筛选及其与生长性状关联性分析

采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术对大口黑鲈肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因全序列进行了SNPs位点筛选和分型,共筛选到2个单核苷酸多态性(SNPs)位点(C-1453T和T+33C),其中C-1453T位于启动子E8 box和Octamer(＋)调控元件之间的区域,T+33C的突变位于第一外显子区域,属于同义突变,氨基酸没有发生变化;利用一般线性模型分析单标记位点与大口黑鲈生长性状(体重、体长、体高、体宽和眼间距)相关性,均未达到显著水平(P>0.05)。将2个SNPs位点不同基因型组合成6种双倍型(去掉频率小于3%的组合),关联分析表明,双倍型D2在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均高于其它双倍型,而双倍型D5在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均低于其它双倍型,双倍型D2与D5之间在5个主要生长性状均存在差异显著(P＜0.05),推测双倍型D2对生长性状起正相关,而双倍型D5与大口黑鲈的生长性状呈负相关,因此推断MSTN基因突变位点双倍型D2与D5可作为大口黑鲈生长性状的两个标记位点,用其分子标记位点来辅助大口黑鲈育种工作以期加快育种进程。     

大口黑鲈肌球蛋白重链基因SNPs的筛选及与生长性状的关联

肌球蛋白是肌肉细胞的重要组成成分,影响肌纤维的组成和肌肉生长。为了研究肌球蛋白重链(MYH)基因多态性与大口黑鲈生长性状的相关性,本研究采用PCR技术扩增得到编码区序列全长为9759 bp的大口黑鲈MYH基因,该基因包含37个外显子和36个内含子,编码1940个氨基酸。采用直接测序法在MYH基因上筛选到8个单核苷酸多态性标记(SNP)位点(A-305G、G-558C、A-2784C、A-2816G、T-4765A、C-6206T、C-6811T和G-6935T),有4个位于外显子上,其中2个属于同义突变。用SNa Pshot方法对从同批繁殖、同塘养殖的大口黑鲈"优鲈1号"群体中随机选取的430尾个体中各位点的基因型进行检测。结果显示,内含子上的A-2784C和A-2816G位点完全连锁,所有位点在大口黑鲈"优鲈1号"群体中的平均有效等位基因数、平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为1.635、0.406和0.373,仅C-6206T、C-6811T和T-4765A位点的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg定律。采用一般线性模型分析各位点与大口黑鲈生长性状之间的相关性,研究发现,C-6811T位点CC基因型个体的体质量和全长显著大于TT基因型,CC基因型个体的体高和尾柄长显著大于CT和TT基因型,其余位点不同基因型个体间的生长性状均不存在显著差异。C-6811T位点与生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种的候选标记。     

大口黑鲈MyoD基因结构和单核苷酸多态性位点的筛选

本研究采用PCR技术和基因组步移技术从大口黑鲈基因组DNA中扩增得到MyoD基因及其5’调控区序列。该基因序列全长3797bp,其中5’调控区长1077bp,MyoD基因转录区由3个外显子（分别为591bp、81bp和78bp）和2个内含子（分别为1077bp和486bp）组成。5’调控区含有与肌肉特异性基因转录密切相关的转录调控元件E box、肌细胞增强因子2（MEF2）、肌肉特异性金属硫蛋白结合位点（MTBF）及一些转录反应调控元件（TATA box 、OCAAT box、OCT1、PRE、AP4、Pit1）。运用PCR-SSCP技术和直接测序法进行大口黑鲈MyoD基因SNP位点筛选,结果表明MyoD基因序列中存在7个突变点,均位于内含子上。养殖群体中这7个突变点分析结果显示突变比例范围在0.042～0.353之间。本研究结果为SNPs位点与大口黑鲈生长性能关联分析奠定了基础。     

大口黑鲈POU1F1启动子区域SNPs对生长的影响

采用基因组步移技术克隆了大口黑鲈垂体特异性转录因子POU1F1启动子序列,该序列全长1 629 bp,预测存在4个八聚体转录因子1(Oct-1)结合位点和TATA框等基本转录元件,1个Homeobox转录因子结合位点和2个cAMP反应元件结合蛋白(CREB)结合位点。采用直接测序法研究发现,大口黑鲈POU1F1启动子序列的-18和-183两个位点存在SNPs,该两个突变位点只检测到A、B两种单倍型。对养殖群体进行不同单倍型的基因频率和生长关联分析,结果表明,单倍型A的等位基因频率为0.246,单倍型B的等位基因频率为0.754;群体关联分析表明,基因型为AA型和AB型的个体在体质量、体长、全长、体高和体宽等方面明显高于BB型个体,但基因型为AB型和AA型的个体之间在体质量方面没有明显差异。该研究结果为下一步进行分子标记辅助选择提供了基础。     

大口黑鲈组织蛋白酶B基因SNP筛选及其与生长性状关联分析

在动物体内组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)是以酶原形式存在于溶酶体中,能水解多种蛋白,是调控动物生长发育的重要候选功能基因。为开发与大口黑鲈(Micropterus salmoides)生长性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记,本研究对大口黑鲈EST-SNP库中CTSB基因上的SNP位点进行筛选。经PCR扩增和测序分析,从该基因中筛选到1个SNP位点(命名为C+598G),该位点属于错义突变位点,编码的甘氨酸突变成为精氨酸。采用Sna Pshot方法对C+598G位点在165尾大口黑鲈养殖样本中的基因型进行检测,并分析其在群体中的遗传多样性。结果显示,C+598G位点在养殖群体中存在CC、GC和GG3种基因型,其频率分别是40.6%、47.3%和12.1%,C和G等位基因频率分别是64.2%和35.8%;该位点在群体中的观测杂合度(Ho)和多态信息含量(PIC)分别为0.473和0.354,符合哈代-温伯格平衡定律。进一步分析不同基因型与大口黑鲈生长性状相关性,结果表明,3种基因型个体的体质量、全长、体高、尾柄长和尾柄高性状平均值从小到大依次为GG型、GC型和CC型,其中GG型个体在体质量上显著小于CC型个体(P<0.05)。本研究获得的C+598G标记与大口黑鲈生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种研究中的生长标记。     

缢蛏α-淀粉酶基因外显子区域SNPs筛选及其与生长性状关联性

α-淀粉酶是广泛存在于生物体内的消化酶,主要参与生物体内碳水化合物的代谢,为生物体提供维持生命、生长发育和繁殖所需的能量。为研究α-淀粉酶基因外显子与缢蛏(Sinonovacula constricta)生长性状的相关性,实验采用PCR产物直接测序法对其进行筛选比对,共获得18个候选SNPs位点,分别为:Rs-1:48G/C、Rs-2:247 C/A、Rs-3:420 A/G、Rs-4:441C/T、Rs-5:537 G/T、Rs-6:837 G/T、Rs-7:936 A/G、Rs-8:952A/C、Rs-9:1047 T/G、Rs-10:1062 C/T、Rs-11:1287C/T、Rs-12:1350 A/C、Rs-13:1362 C/T、Rs-14:1371 C/T、Rs-15:1503T/C、Rs-16:1536 T/C、Rs-17:1737T/C、Rs-18:1788 C/T。随机选取同批繁殖、同塘养殖的缢蛏快长新品种"申浙1号"群体,运用MassARRAY质谱检测方法进行SNPs位点的分型,结果显示:除Rs-13位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05),Hardy-Weinberg平均值为0.581;多态信息含量平均值为0.237。基因型与生长性状的关联性分析结果表明:Rs-5:537 G/T与Rs-10:1062 C/T位点基因型个体之间部分性状存在显著性差异(P <0.05)。13个位点组成的双倍型与生长性状的关联性分析显示:双倍型S6的壳高高于S3、S5、S7(P <0.05),S6的总重大于S7(P <0.05);另外,S6各个生长性状值在所有双倍型中最高。获得的缢蛏α-淀粉酶编码区外显子与生长性状相关的SNPs标记,可为缢蛏遗传改良特征标记筛选及定制培育提供有益参考。     

大口黑鲈生长性状相关标记的聚合效果分析

选择已经获得的8个与大口黑鲈(Micropterus salmoides)生长性状相关的分子标记, 其中4个单核苷酸多态性标记分别位于IGF-I、POU1F1、PSSIII和MSTN基因上, 4个微卫星位点分别是JZL60、JZL67、MisaTpw76和MisaTpw117。从养殖群体中筛选出具有4个以上优势基因型数量的大口黑鲈亲鱼20尾进行群体繁殖, 其中雌鱼9尾, 雄鱼11尾。所产子代进行同塘饲养, 9月龄时随机挑选288尾进行体质量测量与STR基因分型。结果显示:子代体质量为103~401 g, 含有生长优势基因型的数量在1~6之间, 含有1~6个生长优势基因型的个体其平均体质量依次为227.83、239.56、258.81、273.02、302.50和305.60 g, 生长优势基因型的数量与大口黑鲈生长速度呈正相关。进一步分析表明子代中优势基因型的平均数量为2.99, 相比亲本群体的优势基因型平均数量(2.36)得到提高。研究结果说明, 利用有限的与生长相关的优势基因型进行聚合可以获得具有优良生长性状的大口黑鲈, 也为下一步大口黑鲈分子标记辅助育种提供理论依据。

     

大口黑鲈

从十月开始,大口黑鲈进入成鱼上市阶段,除以前介绍过的捕大留小,减少密度,促进尚未达到商品规格快速生长,以便在年底前绝大部分能够达到上市场规格。     

大口黑鲈生长性状的遗传参数和育种值估计

采用最佳线性无偏差预测法(BLUP法)对大口黑鲈(Micropterus salmoides)体质量、体长和体高的遗传参数和育种值进行估计.4月龄和6月龄的体质量遗传力分别为0.29±0.08和0.28±0.10、体长遗传力分别为0.31±0.08和0.26±0.10,6月龄的体高遗传力为0.29±0.10.这些性状的传力都属于中度遗传力(P＜0.01),表明在加性效应控制下,大口黑鲈生长性状具有较大的遗传改良潜力.6月龄的体质量与体长、体质量与体高及体长与体高的遗传相关分别为0.790±0.094、0.820±0.081和0.990±0.001,这些性状之间均表现为高的正遗传相关性(P＜0.01),说明在对体质量进行选择的同时,其他生长性状也可以获得相应的间接选择反应.从不同评定方法的秩相关来看,6月龄时综合育种值与体质量育种值、体长育种值以及体质量育种值与体长育种值的秩相关系数均达到了极显著(P＜0.01),分别为0.998、0.914和0.890,用综合育种值对大口黑鲈的评定名次排序与用单性状育种值排序的差异不大.本研究对大口黑鲈生长性状的遗传参数和育种值进行确定与分析,旨在为该物种的人工选育提供理论依据和技术参考.     

大口黑鲈仔、稚鱼生长和食性的观察

大口黑鲈仔、稚鱼生长和食性的观察陆伟民（上海水产大学，２０００９０）关键词大口黑鲈，仔、稚鱼，生长，食性ＯＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＯＮＧＲＯＷＴＨＡＮＤＦＥＥＤＩＮＧＨＡＢＩＴＳＯＦＬＡＲＧＥＭＯＵＴＨＢＡＳＳ，ＭＩＣＲＯＲＴＥＲＵＳＳＡＬＭＯＩＤＥＳ，...     

基于转录组测序的大口黑鲈驯食相关SNP开发及其与生长性状的关联分析

大口黑鲈为肉食性鱼类,传统养殖过程中使用大量的冰鲜鱼为饵料,冰鲜鱼的使用不仅增加了养殖成本,而且多余的冰鲜鱼残饵还会给环境带来严重的污染。为了保护环境并降低养殖成本必须减少冰鲜鱼的使用量,本实验以选育适合人工配合饲料饲喂大口黑鲈为研究目标,用人工配合饲料作为饵料驯化大口黑鲈幼鱼,在驯食后14和16 d,测定其体质量、全长、体高等生长指标。同时在大口黑鲈转录组测序分析获得的SNP位点中,选择其所在序列的基因功能与能量代谢有相关性的7个SNP位点进行SNaPshot分型,用SPSS 19.0进行卡方分析标记与生长性状的相关性。结果发现,序列Unigene031044中的C1332G位点、Unigene085384中的A741G位点和Unigene022319中的A284G位点在体质量、全长及体高性状上存在显著差异。这3个SNP位点所在的基因经预测分别与雌二醇17β脱氢酶12B (hsd17b12b)基因、长链酰基辅酶A合成酶家族成员1(acsl1)基因和琥珀酸脱氢酶组装因子2(sdhaf2)基因具有很高的同源性,推测上述3个SNP位点的变异可能影响了基因表达产物对脂肪酸代谢或三羧酸循环的调节功能,与大口黑鲈对人工配合饲料的利用能力存在密切的相关性。本研究筛选得到的与驯食相关的SNP位点为大口黑鲈功能基因多态性的进一步研究,及加快大口黑鲈食性改良与驯化育种的遗传研究提供了科学的参考依据。     

大口黑鲈幼鱼对饲料中锌的需求量

为确定大口黑鲈幼鱼对饲料锌的适宜需求量,以酪蛋白、明胶和鱼粉为主要蛋白质源,以ZnSO_4·H_2O为锌源制作半精制基础饲料,分别向基础饲料中添加0、25、50、100和200 mg/kg锌,制成5种含不同锌水平饲料(24.8、48.8、78.9、126.1和223.6 mg/kg干物质)(命名为Zn-25、Zn-49、Zn-79、Zn-126和Zn-224),投喂初始体质量为(10.99±0.07) g的大口黑鲈幼鱼8周。结果显示,饲料中补充25 mg/kg锌(Zn-49)显著提高了大口黑鲈增重率,降低了饲料系数,进一步提高锌的添加量后,各组增重率和饲料系数趋于稳定。当饲料锌含量为25～49 mg/kg时,T-SOD和CuZn-SOD活性增加,锌含量达到49 mg/kg后,其活性保持基本稳定,而AKP活性在Zn-79组最高。大口黑鲈全鱼和脊椎骨中的锌含量随饲料中锌含量的增加而上升,当饲料锌含量达到126 mg/kg (Zn-126)后,全鱼和脊椎骨中的锌含量不再显著增加,而全鱼铁、骨铁、骨锰含量和全鱼铁、锌沉积率则随饲料锌含量的增加而下降。研究表明,在半精制饲料中补充锌可以显著改善大口黑鲈的生长和饲料利用,提高血清免疫能力、全鱼锌和骨锌的沉积,以增重率、饲料系数、全鱼锌和骨锌为指标,基于折线模型确定大口黑鲈幼鱼对饲料中锌的需求量分别为45.5、44.6、121.8和130.5 mg/kg干物质。     

饲料中脂肪与蛋白质比对大口黑鲈生长、体组成和非特异性免疫的影响

为探讨大口黑鲈饲料中不同脂肪与蛋白质含量比对其生长、体组成和非特异性免疫的影响,实验设计了8种(D1~D8)不同脂肪与蛋白质含量比的总能递增饲料。D1~D8饲料的脂肪水平递增(9.0%～26.5%),而蛋白质水平递减(52.0%～31.0%)。用上述饲料饲养体质量为(10.06±0.02)g的大口黑鲈88 d,每饲料设3重复,每重复30尾鱼。结果显示,特定生长率、饲料效率、蛋白质消化率、脂肪消化率和脂肪沉积率均以D2组最高,但随饲料中脂肪与蛋白质含量比的进一步升高呈现显著下降趋势。D3~D5组的蛋白质效率显著高于D1和D8组。D2、D3组与D4组间的蛋白质沉积率差异不显著,但显著高于其他各组。D1~D4组间的总能消化率差异不显著,但显著地高于其他各组。饲料中脂肪含量过高对鱼体组成产生显著的影响,使体脂的积蓄显著增高。随着饲料中脂肪与蛋白质含量比的升高,成活率呈显著下降趋势,D1和D2组的成活率显著高于D5~D8组。非特异性免疫分析显示,D4组血清溶菌酶活力和D2组血清补体活性及头肾白细胞呼吸爆发活性为最高。以饲料为单因子作单因素方差分析得出,满足大口黑鲈最适生长和饲料利用的饲料蛋白质和脂肪水平分别为49.30%和11.50%。以饲料中蛋白质和脂肪水平为自变量,分别以特定生长率和蛋白质沉积率为因变量进行二元二次回归分析得出,特定生长率最大时,饲料中蛋白质、脂肪和脂肪与蛋白质含量比分别为48.20%、12.44%和0.26;蛋白质沉积率最高时,饲料中蛋白质、脂肪和脂肪与蛋白质含量比分别为46.42%、13.96%和0.30。以饲料蛋能比为自变量作一元二次回归分析得出,蛋白质沉积率最大时,饲料的蛋能比、蛋白质、脂肪和脂肪与蛋白质含量比分别为23.72mg/kJ、46.16%、14.18%和0.31。研究认为,饲料的脂肪和蛋白质水平对大口黑鲈的生长、体组成、饲料效率和免疫力有着不同程度的影响;饲料中过高的脂肪会抑制蛋白质的消化与利用,表明脂肪对蛋白质的节约作用有限。建议大口黑鲈实用饲料的蛋白质和脂肪水平分别保持在46%~49%和11.5%~14%范围内较为适当。     

发酵桑叶替代鱼粉对大口黑鲈生长、脂质代谢与抗氧化能力的影响

在基础饲料中用发酵桑叶分别替代0、15%、30%鱼粉,再对30%鱼粉替代水平饲料补充晶体赖氨酸和蛋氨酸,配制成4种等能等氮(CP 42%,GE 18 MJ/Kg)的实验饲料,分别表示为D_1、D2、D_3和D4,饲喂大口黑鲈(初始体质量10 g)8周,研究发酵桑叶替代鱼粉对大口黑鲈生长、脂质代谢和抗氧化能力的影响。结果显示,发酵桑叶替代30%鱼粉会显著降低大口黑鲈的终末体质量、特定生长率(SGR)、脏体比(VSI)和肝体比(HSI),补充晶体氨基酸(CAA)后会明显改善大口黑鲈的生长性能。各实验组蛋白质效率、饲料系数、摄食率、肥满度以及全鱼常规组成均无显著差异。发酵桑叶替代30%鱼粉会显著降低大口黑鲈血清总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量,提高HDL-C/CHO和HDL-C/LDL-C比值。随发酵桑叶替代水平的增加,大口黑鲈血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量和丙二醛(MDA)含量显著降低,而超氧化物歧化酶(SOD)活性显著升高。研究表明,发酵桑叶替代适宜水平鱼粉不会影响大口黑鲈的生长,而替代鱼粉水平过高会显著抑制大口黑鲈的生长,但可以改善大口黑鲈的脂质代谢和机体抗氧化能力。饲料中补充晶体氨基酸可以提高桑叶的利用率,促进大口黑鲈生长。     

珠江三角洲地区大口黑鲈池塘养殖系统的能值评估

为评价珠江三角洲地区大口黑鲈池塘养殖系统的生态经济性能,实验以能值理论为基础,定量分析该系统的能流和物流特点,通过建立能值评价指标体系,综合评估该系统的环境影响及可持续性。结果显示,大口黑鲈养殖系统投入的资源分为可更新资源(太阳能、风能、雨水能、地球循环能和河水能)和购买的外部资源(设施、苗种、电能、饵料、药品、劳动力、租金、维护费)两部分。养殖系统投入的总能值为4.51×10~(17)sej/(hm~2·a),其中可更新资源能值总和为1.24×10~(16) sej/(hm~2·a),占总投入能值的2.75%。河水能在可更新资源中所占比例最大,为9.77×10~(15) sej/(hm~2·a),占总投入能值的2.17%。购买的外部资源能值总和为4.38×10~(17) sej/(hm~2·a),占总投入能值的97.25%。饵料投入在购买的外部资源中所占比例最大,其能值为3.49×10~(17) sej/(hm~2·a),占总投入能值的77.33%,其次是劳动力,能值为2.29×10~(16) sej/(hm~2·a),占总投入能值的5.08%。大口黑鲈池塘养殖系统太阳能值转换率TR为2.18×106 sej/J,产出能值交换率EERY为2.028,能值产出率EYR为1.028,环境负载率ELR为35.39,能值持续性指数ESI为0.029,可持续性发展的能值指数EISD为0.059。大口黑鲈池塘养殖系统经济效益较高,但过多依赖购买的外部资源,对环境压力较大,可持续性较差。减少饵料投喂量、提高饵料利用率(如选择优质配合饲料及添加剂、改进投喂策略等)以及开展综合养殖是提高珠江三角洲地区大口黑鲈养殖系统持续性、减小环境负载率的有效途径。     

饲料纤维源对大口黑鲈生长、血浆生化指标、肠道抗氧化能力和组织学的影响

为比较评价纤维源在鱼饲料中的营养生理功能差异,在基础饲料中分别添加豆渣(SF)、发酵豆渣(FF)、羧甲基纤维素(CF)和微晶纤维素(MF)配制成相同纤维水平的等氮等脂实验饲料,饲喂大口黑鲈[平均体质量(21.59±0.12) g] 8周,从生长、血浆生化、肠道抗氧化以及组织学等指标比较不同纤维源对大口黑鲈的作用差异。结果显示,CF组大口黑鲈的终末体质量(FBW)、特定生长率(SGR)和蛋白质效率(PER)显著低于其他组,而饲料系数(FCR)、肝体比(HSI)和肝脂含量显著高于其他组。CF组血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性以及甘油三酯(TG)含量显著高于其他组。同时发现,CF组大口黑鲈肠道超氧化物歧化酶(SOD)和Na+, K+-ATP酶活性显著低于其他组,丙二醛(MDA)含量显著高于其他组,而一氧化氮(NO)含量以FF组最高。与其他组相比,CF组大口黑鲈肝脏外观发白,肝细胞空泡化严重,后肠绒毛机械性损伤加剧。研究表明,饲料不同纤维源会显著影响大口黑鲈的肝脏和肠道健康,进而影响其生长性能,而且应重新评估羧甲基纤维素作为水产饲料黏合剂的可行性。     

饲料中添加脱氧胆酸钠对大口黑鲈生长、糖代谢及肠道菌群的影响

为了评估脱氧胆酸钠作为大口黑鲈饲料添加剂的作用效果,实验配制了脱氧胆酸钠添加量分别为0 (对照组)和300 mg/kg的2种实验饲料,饲养初始体质量为(10.80±0.12) g的大口黑鲈8周后,分析了脱氧胆酸钠对大口黑鲈生长、代谢以及肠道菌群的影响。结果显示,脱氧胆酸钠显著增加了大口黑鲈的终末体质量、体长和肥满度(CF),而对脏体比(VSI)、肝体比(HSI)、全鱼的总脂肪和粗蛋白含量无显著影响;脱氧胆酸钠显著增加了肝脏和肌肉中糖异生相关基因的表达,同时脱氧胆酸钠通过增加肌肉中糖原合成酶(GCS)的活性显著增加了肌肉中糖原的含量,而对肝脏中的糖原含量则无显著影响。此外,脱氧胆酸钠显著增加了胆囊中胆汁酸的含量,结果发现,脱氧胆酸钠主要通过下调肝脏中胆汁酸受体基因(fxr)的表达,以及上调胆固醇合成酶7α-羟化酶基因(cyp7a1)的表达,促进胆汁酸的合成。大口黑鲈摄食含脱氧胆酸钠的饲料后,肠道中厚壁菌门和拟杆菌门的微生物丰度下降,放线菌门的丰度升高。研究表明,脱氧胆酸钠作为饲料添加剂可以促进大口黑鲈的生长、肌糖原的积累以及胆汁酸合成的增加,并会对肠道菌群组成产生影响。因此,脱氧胆酸钠可以作为大口黑鲈的一种饲料添加剂,研究成果将为进一步扩展胆汁酸盐在水产养殖中的应用提供重要的理论基础。