茶树类黄酮3′-羟化酶基因的克隆与表达特性分析

类黄酮3′-羟化酶(Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)是细胞色素P450酶家族(Cytochrome P450,CYP450)的单加氧酶,在植物次生代谢和逆境调控方面起着重要的作用。本实验以茶树品种龙井43作为试验材料,利用RT-PCR方法,从c DNA中克隆得到茶树中编码类黄酮3′-羟化酶基因,命名为Cs F3′H1。序列分析显示,Cs F3′H1基因开放阅读框为1 530 bp,编码509个氨基酸,含有相对保守的P450酶系结合域。进化树分析表明,Cs F3′H1与Cs F3′H3的进化树关系相近,与Cs F3′H2的进化树关系较远。序列多重比对显示,Cs F3′H1蛋白具有F3′H蛋白的特征基序,并与高粱、猕猴桃、杨树、拟南芥和葡萄同源蛋白一致性为66.48%。氨基酸组分、理化性质、亲水性/疏水性和无序化分析显示,Cs F3′H1是亲水性蛋白,无序化特征不明显。利用实时荧光定量PCR对Cs F3′H1基因在茶树不同组织和不同激素处理下的表达谱进行检测,结果显示:不同组织中,Cs F3′H1基因的表达水平在第一叶中最高,之后随着叶片的成熟逐渐下降,Cs F3′H1基因在老叶和根中几乎不表达,表达水平从高到低依次为第一叶第二叶第三叶第四叶嫩茎根老叶;在不同激素处理中,Cs F3′H1在SA激素处理下的表达量最高,为对照的2.24倍,在Me JA处理下表达量最低,为对照的0.43倍。     

海南龙血树查尔酮合酶基因(DcCHS)的克隆及表达分析

利用RT-PCR和RACE技术对海南龙血树查尔酮合酶基因进行克隆,得到1条1 456 bp的cDNA序列,命名为DcCHS。DcCHS含有1 173 bp的阅读框架、99 bp的5′非编码区和184 bp的3′非编码区,编码390个氨基酸。DcCHS与其他植物的CHS氨基酸序列同源性高达84%以上,具有高度保守的CHS_like结构域、活性位点以及信号序列。推测DcCHS的分子量为42.7 ku,等电点pI为6.14,稳定性极差,具有15个磷酸化位点,无跨膜结构,无信号肽,亚细胞定位在细胞质的可能性较大,并预测了蛋白质的二级、三级结构。组织特异性分析结果表明,DcCHS在花中的表达远远高于根、茎、叶和果实。     

海南龙血树DcbHLH1的克隆与表达分析

碱性螺旋-环-螺旋(basic/helix-loop-helix,bHLH)转录因子在真核生物的生长发育过程中起着重要的调控作用。在前期龙血树转录组测序结果基础上克隆了1个海南龙血树bHLH转录因子基因,命名为DcbHLH1。序列分析显示,DcbHLH1阅读框基因序列长1 080 bp,编码360个氨基酸,推测分子量为39 ku,等电点为8.21。氨基酸序列比对结果显示,DcbHLH1具有bHLH转录因子家族保守的HLH结构域。进化分析结果表明,DcbHLH1和中粒咖啡中的bHLH亲缘关系最近。定量PCR结果表明,DcbHLH1在诱导剂处理后3 d内表达量快速下降,到第6天达到最低,与转录组测序的数字表达谱一致。DcbHLH1在海南龙血树的根、茎、叶等组织中均有表达,但在叶中表达量较高,根中表达量最低。结果为进一步分析DcbHLH1在龙血树中的功能奠定了基础。     

甘薯黄烷酮3-羟化酶基因IbF3H的克隆和表达特性分析

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是黄酮类化合物合成途径中的一个关键酶.本研究基于前期转录组数据,以'福菜薯7-6'叶片为材料成功克隆CDS序列长度为1107 bp的基因IbF3H,利用生物信息学分析甘薯F3H基因的序列特征、氨基酸序列对比、蛋白系统进化树、蛋白的二、三级结构、预...     

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT（P51094.2）的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。     

海南龙血树的核型分析

采用染色体压片技术研究了海南龙血树的染色体数目和核型。结果表明:在饱和对二氯苯和0.002 mol/L8-羟基喹啉预处理中,后者预处理2 h效果最好;海南龙血树染色体数为2n=42,核型类型为"2B"型。核型公式为:2n=2x=42=22 m+20 sm,核型不对称系数为62.67%。海南龙血树主要由中部着丝粒染色体和近中部着丝粒染色体组成,未观察到随体染色体。     

龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

海南龙血树的组织培养与快速繁殖

以海南龙血树的顶芽和侧芽作为外植体,把其接种于MS＋BA1mg/L＋NAA0．1mgg/L＋PVP100 mg/L＋蔗糖30g／L培养基上培养40-50d可诱导其腋芽萌发,再把萌发后所形成的新芽切割下来接种于MS＋BA 2mg／L＋KT 0．5mg／L＋蔗糖30g／L的培养基上培养25-30d可诱导形成丛生芽,丛生芽在继代培养过程中每25-30d可增殖3～5倍。把丛生芽分割成单株并接种于MS＋BA3mg厂L＋GA,1mg／L＋蔗糖30g／L培养基上培养4周后使其壮苗后再接种于MS＋NAA0．5～1．0mg／L＋蔗糖30g／L培养基上培养4周可诱导小芽形成完整的根系,小植株移栽成活率可达98％。该体系的建立为海南龙血树的工厂化育苗奠定了坚实的基础。     

巴西橡胶树14-3-3蛋白基因的克隆及表达分析

根据在巴西橡胶树幼态无性系与老态无性系胶乳之间差异表达的一个SSH片段序列信息设计引物,通过RACE技术获得了2个编码14-3-3蛋白的cDNA,命名为Hb14-3-3a和Hb14-3-3b。序列分析表明,Hb14-3-3a和Hb14-3-3b基因长度分别为1 154、1 050 bp,分别编码252、263个氨基酸,分子量为61.7 Ku和64.7 Ku,等电点为5.51和5.14。Hb14-3-3a/b基因在所检测的组织中均有表达,但Hb14-3-3a和Hb14-3-3b的表达模式不一样,Hb14-3-3a在树皮中表达量最高,而Hb14-3-3b在叶中表达量最高。     

海岛棉黄烷酮3－羟化酶（F3 H）基因序列分析和表达

根据棉纤维发育相关基因转录组学、表达谱分析结果,从海岛棉（新海21）中筛选到一个与棉纤维发育相关的黄烷酮3－羟化酶基因（GbF3H）。生物信息学分析表明,该基因编码区长1107bp,编码368个氨基酸,多序列比对发现 GbF3H序列保守性较高,具有典型的2－酮戊二酸双加氧酶结构域。实时定量PCR分析表明,GbF3H基因在纤维发育的不同时期中均有表达,在开花后5 d的胚珠中表达量最高,推测GbF3H基因可能对棉纤维发育具有重要作用。     

海南龙血树组织培养过程中血竭形成的诱导

以海南龙血树组培苗为材料,研究组织培养过程中不同植物激素和浓度、不同龙血树组织、不同光照条件对血竭形成诱导的影响.结果表明:植物细胞分裂素(6-Benzylamino purine,6-BA)可以诱导龙血树组培苗产生血竭,其诱导的效果与6-BA的浓度无关.而与光照条件有关,并且在一定的范围内其诱导效率与光照强度成正相关:血竭的形成与组培苗的木栓化程度有关,木栓化程度越高,越容易诱导血竭的形成.     

玉米大斑病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆和表达分析

利用RT-PCR技术克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的GAPDH基因StGAPDH。该基因c DNA全长1 014 bp,编码337个氨基酸;蛋白质分子量36 505.44,理论pI值6.72,属弱酸、亲水、稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽。亚细胞定位于细胞质、线粒体和细胞核的概率分别为43.5%、30.4%和21.7%;氨基酸序列高度保守,在亲缘关系上与玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzae)最近。荧光定量PCR分析表明,在病菌接种抗病玉米自交系3 d时,StGAPDH基因表达量显著高于接种5～10 d(P<0.05);接种感病玉米自交系时,接种10 d的StGAPDH基因表达量显著高于接种3～7 d(P<0.05)。     

甘蔗苏氨酸脱氨酶基因的克隆与表达分析

应用电子克隆技术,以烟草AAG59585序列为探针,获得了甘蔗苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase)基因的全长cDNA,命名为ScTD。经RT-PCR扩增和验证,该基因序列与电子克隆结果一致性高达99%。序列分析结果表明:ScTD基因全长2 120 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,164~1 681 bp),编码505个氨基酸,该基因编码蛋白定位于微体,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构原件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要在氨基酸合成中发挥作用。电子表达分析结果显示,该基因在甘蔗根尖、根颈、花序、叶片、全株、芽和茎中组成型表达,其中在花序和根中的表达量最高。荧光定量PCR结果分析表明:该基因在甘蔗各组织中均有表达,且在根中的表达量最高。此外,该基因的表达受水杨酸胁迫后表达量最高,约为对照组的43.16倍,其次为聚乙二醇和茉莉酸甲酯,分别为6.90倍和4.40倍,推测该基因的表达与甘蔗抗病虫和抗渗透胁迫有关。此结果为甘蔗ScTD基因的克隆和功能验证以及在甘蔗基因工程中的应用奠定基础。     

香蕉MaTET基因的克隆与表达分析

采用RACE技术克隆香蕉果实采后成熟相关基因MaTET的全长cDNA,利用生物信息学方法分析MaTET基因及推导蛋白的序列,再利用RT-PCR技术对该基因的组织器官表达特性和在果实采后成熟过程中的表达特性进行分析。结果表明,MaTET的cDNA序列全长为1 234 bp,包含一个852 bp的完整开放阅读框,编码283个氨基酸残基,5′端非编码区222 bp,3′端非编码区160 bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG。MaTET蛋白具4个跨膜区域,属于四跨膜蛋白（Tetraspanins）,拥有多个与信号传导有关的修饰位点,在系统发生上更接近鹰嘴豆、野草莓和番茄等双子叶植物。MaTET可在香蕉根、茎、叶、花以及果实中表达,在根和叶中的表达量高于其它器官;MaTET在自然成熟香蕉果实中的微黄(TY)阶段开始上调表达,在黄多于绿(MY)阶段表达量急遽升高,随后降低,乙烯可增强MaTET表达且表达高峰提前至绿多于黄(MG)阶段,1-MCP抑制MaTET的表达。     

小麦TaGeBPL基因的克隆及表达分析

无表皮毛增强子结合蛋白GeBP(GLABROUS1 enhancer-binding protein)是植物体内特有的一类转录因子,可调控植物表皮毛的生长过程,在植物生长发育、衰老、抗逆、防御反应进程中发挥着重要作用。前期对自发斑点细胞坏死RILs(N13039H/N)进行转录组学比较,发现一个未知功能基因在两个材料中表达差异显著。为深入了解小麦中该基因的序列特征和表达特性,通过RT-PCR方法克隆获得了CDS区域片段。生物信息学分析结果表明,该基因位于3D染色体上,CDS编码区长度为1 527 bp,共编码508个氨基酸,含有1个DUF573结构域和3个核定位信号。InterPro比对表明,编码蛋白属于GeBP家族,故将该基因命名为TaGeBPL。亚细胞定位结果表明,TaGeBPL定位于细胞核。白粉病菌(Blumeria graminis f. sp.tritici,Bgt)侵染条件下的定量qRT-PCR结果表明,TaGeBPL基因在感白粉病近等基因系N9134S中的表达模式呈双峰曲线变化,侵染12和36 h时,基因表达显著上调,而在抗白粉病近等基因系N9134R中的表达呈单峰曲线变化,在侵染12 h时显著下调。TaGeBPL在N9134S中的相对表达量始终高于在N9134R中的表达量,由此推测TaGeBPL基因可能参与病原菌响应的相关途径。酵母转录激活试验表明,TaGeBPL转录因子没有转录自激活活性。本研究结果为深入解析GeBP的功能奠定了基础。     

青花菜肉桂酰辅酶A还原酶基因的克隆与表达特征分析

为研究肉桂酰辅酶A还原酶在青花菜生长发育中的作用,采用RT-PCR技术克隆青花菜Bo CCR基因全长c DNA序列,并利用q RT-PCR检测其在不同器官中的表达模式。结果表明:Bo CCR基因开放阅读框为987 bp,推导编码328个氨基酸。预测蛋白分子量为36.86 ku,PI值为6.04。该蛋白亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸,为亲水性蛋白。高级结构预测表明青花菜Bo CCR蛋白具有完整的二级结构,三级结构的α-螺旋主要位于外部,β-折叠位于内部。分子进化分析显示CCR蛋白在植物进化过程中,各属形成单独的分枝,可以区分其亲缘关系。荧光定量技术检测到青花菜的Bo CCR基因在花蕾发育早期表达最高,推测该基因可能与青花菜花粉发育相关。     

香蕉泛素结合酶基因的克隆及其功能初步分析

根据香蕉根系均一化全长cDNA文库筛选出一个香蕉泛素结合酶基因的片段通过RACE技术克隆该基因,命名为mauce2.生物信息学分析表明,该基因全长为929 bp,有一个完整的ORF编码148个氨基酸,蛋白分子量为16 505.1 ku,理论等电点为8.41,是一个碱性氨基酸.与江南卷柏、大豆、苹果、拟南芥的同源性为97.97％、97.30％、96.62％、95.95％.器官特异性表达分析表明,该基因在各器官中均有表达,在花中表达量最高,根次之,叶中表达量最低.