猪APOA2启动子与转录因子GATA1作用的研究

对猪APOA2潜在启动子区进行克隆及活性分析,确定核心启动子区域,并进一步分析转录因子GATA1对APOA2基因转录活性的影响。结果表明,APOA2基因主要在猪的肝脏及脂肪组织中表达。双荧光素酶活性显示,猪APOA2基因5′端侧翼-813～-565 bp区域为核心启动子区,且-659～-565 bp区域内更可能存在一些促进APOA2转录的顺式作用元件。过表达GATA1基因结果显示,转录因子GATA1显著促进APOA2基因的转录;定点突变试验确认,转录因子GATA1可直接与APOA2基因启动子区的GATA1结合位点(-608～-599 bp)相结合。转录因子GATA1可直接靶向APOA2基因启动子区并促进APOA2的转录。     

牛FoxO1基因启动子转录调控分析

为鉴定牛叉头框转录因子1(Forkhead box,FoxO1)的核心启动子区及其关键转录因子,利用PCR扩增牛FoxO1基因的启动子序列,同时设计7个逐段缺失片段引物扩增其启动子逐段缺失片段,进一步将其构建双荧光素酶报告载体并分别转染小鼠C2C12和3T3-L1细胞系,通过检测不同缺失片段荧光素酶报告载体的活性,以确定牛FoxO1启动子的核心区域;使用Genomatix和JASPAR在线软件预测牛FoxO1基因启动子核心区域的关键转录因子,采用定点突变试验在小鼠C2C12细胞系中初步鉴定预测的关键转录因子对FoxO1的转录调控作用。结果表明：1）成功扩增了牛FoxO1的启动子区1 920bp序列,获得了FoxO1基因启动子序列的7个逐段缺失片段序列;2）经双荧光素酶报告试验进一步证实,牛FoxO1基因核心启动子位于-285/-27区域;3）预测并通过定点突变试验鉴定出MEF2A、KLF4、HOXA5和KLF5转录因子对FoxO1基因的转录活性具有关键调控作用。综上,本研究初步鉴定出牛FoxO1基因启动子核心区（-285/-27）内转录因子MEF2A、KLF4、HOXA5和KLF5对F...     

猪羰基还原酶1（CBR1）基因克隆及组织表达谱分析

为了深入研究猪羰基还原酶1(CBR1)基因的表达调控,通过PCR获得包括猪CBR1基因启动子和外显子、内含子的序列,并进行蛋白结构分析和系统进化关系比较,通过RT-PCR方法检测了CBR1基因在不同组织的表达丰度。结果表明,猪CBR1基因启动子区长度为2 875 bp,具有潜在典型的NFκB等转录因子结合位点;CBR1基因由3个外显子和2个内含子组成,外显子长度分别为289、108和437 bp,其中5′UTR和3′UTR分别为107 bp和242 bp,内含子长度分别为572 bp和3 219 bp,编码区由289个氨基酸组成;该蛋白为亲水性蛋白,无明显的信号肽,有2个跨膜区域;蛋白二级结构和三级结构主要由7个α-螺旋、7个β-折叠以及loop环构成。猪CBR1基因氨基酸序列与人、绵羊氨基酸的相似性较高,为84.48%。q RT-PCR结果表明,怀孕12 d的二花脸子宫内膜中CBR1基因m RNA的表达量极显著高于长大二元母猪;在怀孕12 d母猪9个组织中,CBR1在肾脏中的表达量最高,其次是肝脏和小肠。     

Whirly转录因子对非寄主菌诱导水稻HR反应的负调控作用

用RNA干扰技术研究了Whirly转录因子对水稻非寄主抗性反应HR的调控作用。PCR扩增编码Whirly转录因子的Oswhirly基因片段,分别以正向、反向顺序连接到载体pTCK303的两个多克隆位点中,构建Oswhirly基因沉默的RNA干扰载体pTCK303-Oswhy,经农杆菌EHA105菌株转化水稻细胞,结果发现转基因水稻细胞受非寄主菌诱导后,HR反应明显,细胞死亡率显著高于野生型及空载体转化水稻细胞。Oswhirly基因沉默导致HR反应增强,初步揭示Whirly转录因子可能是调控水稻HR反应的负调控因子。     

猪OLR1基因对肌内前脂肪细胞分化的影响

研究氧化型低密度脂蛋白受体1(oxidized low-density lipoprotein receptor1,OLR1)基因在猪前脂肪细胞分化过程中的作用,为深入研究OLR1基因在脂肪沉积中的功能奠定基础。根据GenBank中猪OLR1基因序列(登录号:NM₂13805),构建OLR1基因过表达载体OLR1-pcDNA3.1,同时合成干扰OLR1表达的siRNA。从恩施黑猪背最长肌中分离前脂肪细胞,分别将OLR1-pcDNA3.1和OLR1-siRNA转染前脂肪细胞,并对细胞进行诱导分化,至第6天,通过油红O染色、甘油三酯含量测定和荧光定量PCR检测OLR1基因对前脂肪细胞分化的影响。结果显示,OLR1过表达组脂滴明显多于对照组,甘油三酯含量显著(P<0.05)增加,成脂分化标志基因PPARγ的表达量极显著(P<0.01)升高、C/EBPα和FAS的表达量显著(P<0.05)升高;干扰OLR1后,细胞内脂滴减少,甘油三酯含量显著(P<0.05)下降,成脂分化标志基因PPARγ的表达量极显著(P<0.01)下降,C/EBPα和FA...     

二花脸猪linc-NORFA核心启动子鉴定与转录调控分析

[目的]前期研究证实linc-NORFA作为母猪繁殖性状候选基因参与调控卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞凋亡过程,进一步鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子并分析其转录调控机制,为解析linc-NORFA介导猪卵泡闭锁的分子机制奠定理论基础并提供新的研究思路.[方法]采集二花脸猪耳组织样品并提取基因组DNA,利用PCR扩增...     

转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立 及抗猪瘟病毒转基因猪的构建

【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞,将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中,获得体细胞核移植胚胎,移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建,对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株,其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用,将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植,获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响,筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果;通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段（P2）的转基因猪。     

猪圆环病毒ORF2基因的插入对猪细小病毒VP2基因蛋白表达的影响

将扩增得到的PCV2SC株ORF2基因插入PPVSC-1株VP2基因的HindⅢ(522bp处)和SacⅠ(1220bp处)2个特异限制酶切位点,并将此重组基因分别连接到含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒转移载体(pPI-2.EG-FP),脂质体转染系统转染COS-7细胞,倒置荧光显微镜观察重组基因表达情况。结合测序结果预测重组基因所编码的蛋白质的二级结构。     

猪博卡病毒NP1基因的克隆及其生物信息学分析

根据Gen Bank发表的猪博卡病毒主要抗原基因NP1基因设计1对引物,采用降落PCR方法进行扩增,克隆后测序,并对该基因进行生物信息学分析。结果表明:成功克隆到猪博卡病毒NP1基因;NP1蛋白的二级结构中自由卷曲含量最高(51.77%),无跨膜蛋白,含有1个糖基化位点、30个磷酸化位点,有6个线性B细胞优势抗原表位,分别位于NP1蛋白的7—14位、27—50位、59—73位、85—94位、102—108位、151—155位。     

猪IFN-α在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

为了获得高效抗病毒活性的猪α-干扰素蛋白,采用PCR法扩增获得猪α-干扰素基因完整的开放阅读框(ORF),构建重组表达质粒pPICZαC-IFN,电击转化毕赤酵母感受态细胞X33.挑阳性菌落诱导表达,离心取上清,SDS-PAGE和Western-blotting分析,可见1条相对分子质量约19 400的清晰蛋白条带,与理论值相符,表明表达产物为猪α-干扰素.在Vero细胞上检测该干扰素抗VSV的活性为4.04×106IU/L.     

猪细小病毒HNZM01株NS1基因的克隆及序列分析

为加强猪细小病毒病的监控,对分离的猪细小病毒(PPV)HNZM-01株NS1基因的序列进行了分析。设计一对特异性引物,以抽提的PPV HNZM-01株的DNA为模板,通过PCR反应扩增出大小约2.27kb的目的片段,并将其插入克隆载体pGEM-T Easy上,构建了重组质粒并测序。结果表明,NS1基因全长1 989bp,与预期目的片段大小一致。序列分析结果表明,PPV HNZM-01株的NS1基因与其他PPV毒株同源性在98.2%～99.8%,说明NS1基因具有高度保守性。同时应用ANTHEPROT软件分析了HNZM-01株NS1基因编码蛋白质的氨基酸组成和二级结构的含量、分布。结果表明,由于HNZM-01株中碱基的突变,造成其氨基酸序列与NADL-2株有所不同,形成的二级结构略有差异,但二级结构元件分布大致与NADL-2株相同。     

Identification and Promoter Activity Analysis of Porcine miR-181 and miR-1

Since its discovery a decade ago,microRNA has been identified as one of the major regulatory gene families in eukaryotic cells.Many functions of microRNAs have been revealed both in flora and fauna in ...     

影响猪生长激素基因工程菌表达效率的因素研究

在摇瓶条件下研究了影响猪生长激素(pGH)基因工程菌表达效率的某些因素。实验结果表明:工程菌 pJW301/JA221在不同光密度时开始诱导,诱导不同时间及不同通气量对pGH 的表达效率影响较大;过夜培养物存放时间的长短及不同氨苄青霉素(Amp)浓度对表达效率稍有影响。表达载体 pJW301转化不同受体菌,其表达效率有较大差异。     

猪CACNA1S基因部分序列多态性检测及其与肉质性状的关联分析

采用PCR-SSCP技术,对30头苏钟猪和97头金华与皮特兰杂交F2代(JPF2)猪CACNA1S基因进行多态性检测,结合肉质性状作关联分析。结果表明:在猪CACNA1S基因1 234 bp核酸序列中,检测到25个单核苷酸突变点(SNP);关联分析结果显示,引物1S-65的AA、BB基因型对后腿肌肉重存在显著影响(P<0.05),AB基因型对后腿pH存在显著影响(P<0.05);引物1S-66的BB、BC基因型对蹄重存在极显著影响(P<0.01)。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

以细胞总基因组提取试剂盒抽提PCV2细胞毒株总DNA为模板,用特异性引物扩增PCV2 ORF3基因。将ORF3和表达载体pGEX-6p-1用BamH I和Sal I双酶切回收后连接,将测序验证为阳性的重组质粒命名为pGEX-6p-1-ORF3。重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达并纯化,对获得的表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测。结果表明:PCV2 ORF3在pGEX-6p-1中获得了高效表达,其表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约为37 kD,且能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用,具有免疫学活性。     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。