刺五加鲨烯合酶基因DNA和启动子的克隆及分析

在已克隆出的刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)基因cDNA序列基础上,利用TAIL-PCR技术克隆SS的基因组DNA及启动子序列。克隆得到刺五加SS的DNA序列长8 244 bp,启动子序列长1 984 bp,转录起始位点位于起始密码子ATG上游568 bp处。基因包括13个外显子,12个内含子,其剪切符合GT-AG原则。启动子序列含有37个顺式作用元件,其中包括128个TATA-box、38个CAAT-box等核心调控元件,并且含有部分光响应元件、激素应答的元件等顺式调控元件。本研究首次克隆出刺五加SS基因组DNA及启动子序列,为后续研究SS基因表达的调控机制有很大帮助。     

桃PG基因启动子克隆及序列分析

为获得桃多聚半乳糖醛酸酶( PG)基因启动子并分析调控元件,以桃品种大久保基因组DNA为模板,采用染色体步移技术克隆了PG基因的部分序列及其5′侧翼区,并分析其调控元件组成。结果表明,克隆产物长986 bp,3′侧翼序列与 GenBank中的PG基因序列的5′端部分序列同源性为96%,登录号为FJ940722。在789~839 bp位置存在基础启动子序列,转录起始位点位于828 bp的碱基C,其可能性为0.98。除含有CAAT-Box、TATA-Box等基本启动子元件外,还存在众多参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、水杨酸响应元件等应答激素和胁迫信号元件,表明PG基因的转录和表达可能受到激素、干旱、光照等外界环境的胁迫以及衰老的调控。     

猪STAB2基因启动子的克隆及转录活性分析

旨在克隆和分析猪STAB2基因启动子及其转录活性。利用基因克隆、双荧光素酶报告基因系统以及生物信息学分析等方法,克隆得到了STAB2基因转录起始位点上游1 997 bp的候选启动子序列并对其序列特征进行了分析,同时,构建了不同长度的5'端缺失的重组载体并利用双荧光素酶报告基因系统分析了其荧光素酶活性,进而确定了STAB2基因的核心启动子区域及关键调控区域,并对关键调控区域内的转录因子及其结合位点进行了分析。结果表明:STAB2基因的候选启动子区域内包含4个核心启动子和1个Cp G岛;-309--39 bp为STAB2基因的关键调控区域,-1 045--309 bp可能存在一个正向调控元件,而-1 506--1 045 bp可能存在一个负向调控元件; STAB2基因的关键调控区域内包含72个转录因子结合位点,部分转录因子在这一区域具有多个结合位点,如Arnt∶∶Ahr、ZNF354C、Klf4和KLF5,并且,转录因子结合位点之间也存在重合区。为进一步研究猪STAB2基因的表达调控机制以及其在调控猪抗病和肌肉品质中的功能提供了理论依据。     

苦瓜MAP30基因启动子克隆与单倍型分析

为探明MAP30基因的表达调控规律,从苦瓜种质Y5中克隆了MAP30基因上游包括起始密码子在内1 682 bp序列,选取转录起始位点上游1 500 bp序列利用PlantCARE在线启动子预测工具进行分析,结果表明:MAP30启动子除了含有核心元件TATA-box和CAAT-box外,还含有大量的光响应元件、植物激素脱落酸响应元件、热胁迫响应元件、干旱应答元件、水杨酸应答元件等,该预测结果表明,MAP30启动子可能参与光、厌氧、逆境胁迫、脱落酸、水杨酸和乙烯等诱导,同时它还可能参与胚乳高效表达及昼夜节律调控。以30份苦瓜种质为材料,分析了MAP30启动子区域SNPs和In Dels分布情况,共发现37个SNPs位点和6个In Dels,SNPs分组发现,30份苦瓜种质资源MAP30基因启动子共存在3种单倍型,Y5、Y7、Y16、Y39、Y58、Y60、Y66、Y77、Y83、Y96、Y100、Y112、Y121属于第1组,Y43、Y50、Y90、Y108、Y113、Y115、Y140、Y141、Y144属于第2组,Y69、Y72、Y85、Y131、Y139、Y146、Y147、Y153属于第3组。结合顺式调控元件的位置,其中5个SNPs,342位点的T/C,584位点的A/G,783位点的G/T,872位点的A/G,1087位点的T/G,位于顺式调控元件内部,涉及的顺式调控元件分别为MBSI、ABRE、ARE、5UTR Py-rich stretch、GAG-motif、TC-rich repeats,SNP导致转录因子结合位点发生改变,可能对MAP30基因的表达调控有重要作用。为进一步揭示MAP30基因转录调控机制奠定理论基础。     

菜用豌豆酵母单杂交cDNA文库及糖转运蛋白PsSWEET15诱饵载体构建

SWEETs (Sugars will eventually be exported transporter)是近年来新发现的一类重要的糖转运蛋白,调控植物体内的糖转运和分配过程。在菜用豌豆中,有关PsSWEETs基因功能及作用机制的报道甚少。本研究克隆获得了PsSWEET15启动子,长度为1 182 bp。通过启动子作用元件分析,发现其含有种子特异表达元件GCN4 motif、光、无氧、乙烯、赤霉素等环境胁迫应答元件以及ERF、DOF、MYB、WRKY、NAC、NF-Y、TCP等多个转录因子结合位点。进一步构建了PsSWEET15启动子酵母单杂诱饵载体pPsSWEET15::HIS3以及菜用豌豆cDNA文库,库容为3.056×10⁸CFU,插入片段平均长度约1 000 bp。研究结果为后续筛选PsSWEET15基因上游转录调控因子并探究PsSWEET15基因调控机制提供了基础。     

巴西橡胶树HbbHLH1启动子的克隆与序列分析

bHLH转录因子在高等植物生长发育、激素应答和次生代谢调节中具有重要的功能.根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)HbbHLH1基因设计了2个特异性反向引物,利用GenomeWalking方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbbHLH1基因起始密码子上游819 bp的调控片段.序列分析表明,该片段除了含有一个典型的真核生物核心启动子区域(-60～-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与激素和胁迫诱导相关的顺式调控元件,其中在-290 bp和-309 bp位点分别有一个应答MeJA信号反应的调控元件,但没有发现典型的乙烯响应元件.这暗示了HbbHLH1转录因子可能在橡胶树乳管分化和胶乳生物合成中具有调控作用.     

转录因子和启动子互作分析技术及其在植物应答逆境胁迫中的研究进展

转录因子是一类调节基因表达的重要调控蛋白,转录因子和与其结合的启动子中的相关顺式作用元件,在基因表达方面起着分子开关的作用,因此探究转录因子与启动子的相互作用尤为重要。为了研究在植物遭受逆境胁迫时,转录因子对下游靶基因的调控机制,本文综述了参与逆境胁迫的主要转录因子家族、转录因子的转录激活活性鉴定、转录因子和启动子互作分析技术及其在植物应答逆境胁迫中的应用,为全面、深入研究植物应答逆境胁迫时的基因表达调控机制提供参考。     

猪EIF2S3基因启动子的克隆、活性及转录调控元件分析

旨在初步分析猪EIF2S3基因的启动子活性以及转录调控元件。利用生物信息学分析、PCR扩增、基因克隆、细胞转染、双荧光素酶活性分析等方法,获得了EIF2S3基因启动子区域的序列特征,构建了不同片段长度的EIF2S3基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体并分析了其荧光素酶活性,进而确定了EIF2S3基因的核心启动子区域以及关键的调控区域,最后还预测了关键调控区域的转录因子及其结合位点。结果表明,EIF2S3基因候选启动子区包含3个核心启动子以及2个Cp G岛;-706～+200 bp为EIF2S3基因的核心启动子区域,-706～-253 bp为EIF2S3基因启动子的关键调控区域,且发挥正向调节作用,而-1 563～-706 bp不存在任何对EIF2S3基因启动子活性有影响的调控元件; EIF2S3基因启动子的关键调控区域包含440个转录因子结合位点,且多个转录因子在此区域均有多个结合位点,如SP1、KLF4、Myo D1、Myo G、NFKB1。为进一步研究猪EIF2S3基因的表达机制奠定了基础。     

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及序列分析

以大豆基因组文库Phytozome公布的大豆Williams82基因组序列为参考,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,用PCR技术扩增了大豆GmWRI1a基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGM-TpGmWRI1a,并通过PCR扩增对阳性克隆进行鉴定送测序。克隆获得GmWRI1a基因启动子序列1 686bp,该启动子序列除含有必需的起始转录位点、TATA-box、CTTA-box外还包含多个顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素应答元件、表达分生组织相关元件、抗旱诱导元件等。同时,构建了该启动子植物表达载体pBI-pGmWRI1a,通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定,为启动子的功能研究奠定基础。大豆GmWRI1a基因启动子克隆与序列分析,将为进一步研究大豆GmWRI1a基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

洋葱转录组测序及黄酮类化合物合成相关基因的分析

洋葱是世界范围内种植的重要蔬菜作物,其鳞茎颜色是洋葱选育和食用的重要性状。本研究对紫皮洋葱和黄皮洋葱进行高通量转录组测序,挖掘黄酮类化合物合成的基因,探讨不同皮色形成的分子基础。本研究共获得5 809个差异表达基因,包括2 991个上调表达基因,2 818个下调表达基因。差异基因GO功能富集分析显示,差异基因主要参与细胞组分、生物过程和分子功能3大类。KEGG显著富集分析显示,差异表达基因主要富集在3条代谢途径上。黄酮类化合物合成相关的通路有类黄酮合成途径、花青素合成途径、异黄酮合成途径、黄酮和黄酮醇合成途径,并筛选出了F3’H、FLS、CHI和DFR等黄酮类合成相关的结构基因。本研究为进一步探讨洋葱皮色相关的代谢合成途径关键酶的功能及其调控机制提供了基础。     

茉莉花香气相关基因JsGDS启动子的克隆及功能分析

大根香叶烯合成酶在植物萜类化合物合成中具有重要作用.前期从茉莉花cDNA文库中克隆获得香气相关基因JsGDS基因,但是其表达调控机制还不是很清楚,本研究拟采用染色体步移法从茉莉花基因组中克隆了JsGDS上游1 646 bp的启动子序列.生物信息学分析表明,该启动子片段中包含启动子的基本元件TATA-box和CAAT-b...     

茶树硒营养代谢关键酶硒半胱氨酸甲基转移酶基因克隆及启动子结构分析

为探明茶树硒营养代谢关键酶基因硒半胱氨酸甲基转移酶（SMT,GenBank登录号： DQ480337）的表达调控规律,通过PCR和基因步移技术获得SMT的DNA全长和部分启动子序列,用PLACE、PlantCARE分析SMT内含子和启动子的序列,预测其顺式作用元件及功能。结果表明SMT基因全长5473bp,有7个外显子和6个内含子,内含子富含光响应元件,激素响应元件和抗逆性相关元件,通过基因步移法克隆得到的SMT启动子长375bp,除了含核心启动子保守元件TATA-box和CAAT-obx外,还有其它重要顺式作用元件,如光响应元件、低温响应元件和胚乳表达特异性元件等。植物硒营养代谢关键酶SMT启动子的克隆及结构分析为进一步揭示SMT基因的生物学功能和表达调控机制奠定了理论基础。     

豆科植物根瘤菌结瘤因子的感知与信号转导

结瘤因子（脂壳寡糖,lipo-chito-oligosaccharides,LCOs）是根瘤菌在宿主植物根系分泌的类黄酮的作用下,合成并分泌的一类多糖信号分子,在根瘤菌与植物的共生结瘤过程中起重要作用。结瘤因子通过一定的机制感知,与某种特定受体（结瘤因子结合蛋白）结合,通过结瘤因子激活的信号转导途径如Ca2+介导的信号转导途径或磷酸类脂信号转导途径,诱导宿主植物的一系列反应,如根毛质膜去极化、皮层细胞分裂和结瘤素基因表达等。同时,结瘤因子的感知与信号转导也受一定基因和反馈机制调控。就豆科植物根瘤菌结瘤因子感知机制、信号转导途径及反馈调控等方面的研究进展进行了全面阐述。     

截干对银杏类黄酮代谢及其抗氧化性的影响

为了探究截干措施对银杏(Ginkgo biloba L.)叶类黄酮代谢及其抗氧化特性影响,本研究通过对银杏嫁接苗进行截干处理,分析了截干处理对一个年生长周期内的银杏叶类黄酮代谢相关酶结构基因表达量、总黄酮醇苷含量及抗氧化活性的变化影响。结果表明,截干处理后,在一个年生长周期内银杏类黄酮代谢途径上、中游的酶基因表达量与对照相比均有提高,且与总黄酮醇苷含量呈正相关。银杏类黄酮代谢通路下游基因表达量呈先上升后下降的变化趋势,截干处理后差异变化不明显;截干处理能提高银杏叶总黄酮醇苷含量,在芽后15 d时总黄酮醇苷含量最高,提高了14.36%,与对照差异显著;截干处理能增强银杏叶抗氧化性能,在芽后15 d时,总还原力及自由基清除率最强,差异显著。     

拟南芥RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价

RBCS编码光合碳同化关键酶核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基, 是控制植物光合作用的重要基因之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析拟南芥RBCS-1A受光调节表达模式, 结果表明, AtRBCS-1A表达受光诱导, 同时具有组织表达特异性; 运用生物信息学手段分析发现, 该基因启动子序列中存在多个参与光应答的顺式作用元件; 采用PCR技术从拟南芥基因组中分离到长度为1 691 bp的AtRBCS-1A启动子片段, 将该片段与GUS报告基因融合构建植物表达载体并转化野生型拟南芥, 对获得的转基因植株进行GUS染色, 结果显示, AtRBCS-1A启动子是光诱导型和组织特异型启动子。以上结果初步证明, AtRBCS-1A启动子应用于植物遗传转化切实可行, 具有重要应用价值。     

棉花光合基因GhRCAα启动子的克隆及活性分析

为了克隆棉花Rubisco活化酶基因(RCA)启动子,研究其表达调控的分子机制,以百棉1号为材料,对GhRCAα启动子区2 000 bp的片段进行克隆、顺式作用元件分析以及活性分析,结果表明,许多重要的顺式作用元件包括响应于光、生物钟、逆境胁迫、植物激素以及其他的基本顺式作用元件特异地存在于GhRCAα启动子区;进一步对GhRCAα进行表达特性分析发现,该基因在光合作用进行的主要位置叶片中表达量最高,在其他组织表达量很低,其表达具有组织特异性,这与该启动子区存在许多光响应及组织特异性表达相关元件的结果相一致;将克隆的GhRCAα启动子片段以烟草叶片为受体材料进行瞬时表达分析表明,GhRCAα启动子可以驱动GUS基因的表达,表明克隆的启动子片段具有驱动目标基因表达的活性。克隆的GhRCAα启动子可能是一种组织特异型启动子,有望用于植物的遗传转化,进而更好地调控重要基因的特异性表达。     

植物基因启动子的克隆方法及其应用

植物基因的表达调控已成为分子生物学研究热点,启动子是基因表达调控的重要顺式元件,启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到PCR方法的应用,此后相继问世的一些基于PCR的克隆启动子技术,如载体锚定PCR、反向PCR、接头PCR、交错热不对称PCR等,为克隆启动子提供了更可靠,更合理的方法。本文着重介绍了几种植物基因启动子的克隆方法,分析了它们的优缺点,并展望了今后的研究前景。     

陆地棉钾转运体基因GhHAK5启动子的克隆与功能分析

KUP/HAK/KT钾转运体基因的转录调控是植物响应低钾胁迫的一项重要机制。克隆和分析棉花钾转运体基因的启动子,不仅有助于了解其表达模式及调控机制,对于改良棉花的钾吸收特性也具有重要意义。陆地棉钾转运体基因GhHAK5是一个在根中特异性高表达的基因,其表达受低钾胁迫诱导,目前关于该基因启动子的功能还不清楚。本研究以陆地棉品种百棉1号为材料,通过PCR方法对GhHAK5上游2000bp启动子片段(pGhHAK5)进行克隆,并通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能。结果表明, pGhHAK5除具有TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、逆境胁迫、植物激素和生物钟等的顺式作用元件。pGhHAK5与雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要调控元件的数量和位置分布上具有较高的一致性,均具有5个参与根特异性表达调控的元件(ATAAAAT)和1个参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点(TGTCNN)。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和胚轴维管束组织染色较深,根系染色较浅;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉和花萼维管束组织染色较深,茎和荚皮染色较浅,表明pGhHAK5驱动的GUS主要在拟南芥成熟的根和地上部维管束组织中表达。进一步低钾诱导表达特性分析表明, PGhHAK5驱动的GUS在拟南芥幼苗幼嫩根中的表达很弱,且其表达不受低钾胁迫诱导而增强,表明PGhHAK5可能是一个主要在成熟根中具有功能的低钾诱导型启动子。转录组分析和荧光定量PCR结果表明, GhHAK5主要在成熟的根中表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pGhHAK5驱动的GUS在拟南芥根中的表达结果一致。本研究结果有助于深入了解GhHAK5表达调控的分子机制,并为棉花钾吸收效率的提高及钾高效棉花品种的培育提供理论依据。     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。