猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立

猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。     

猪IL-18 mRNA定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪白介素(IL)-18基因序列,设计1对引物,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出其411 bp cDNA片段,将其与pGEM-T Easy载体连接,经转化、筛选阳性克隆、酶切与测序鉴定后,构建出含猪IL-18 cDNA部分片段的重组质粒。后用反向PCR技术构建出与扩增411 bp片段共用同1对引物,但缺失174 bp的竞争重组质粒。通过上述2种质粒的竞争PCR方法,建立了猪IL-18 mRNA的标准竞争曲线,得到其直线回归方程^y=0.583 2x-2.903 4(R2=0.9898)。     

稳定表达CD163蛋白的猪肺泡巨噬细胞系的建立

以RT-PCR方法从原代猪肺泡巨噬细胞中获得CD163 cDNA序列,然后测序鉴定,对突变碱基进行修正,将修正后碱基序列克隆入真核表达载体pcDNA4.0中,构建重组真核表达质粒pcDNA4.0-CD163,通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。使用脂质体2000将pcDNA4.0-CD163转染猪肺泡巨噬细胞系3D4/21(CRL-2843),通过Zeocin抗性筛选,建立稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系。RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)检测结果表明CD163在mRNA和蛋白质水平均已表达。通过Zeocin抗性筛选,共获得8株表达CD163的重组细胞株,IFA检测结果表明表达的CD163定位于重组细胞的细胞膜表面。去除筛选抗性后连续传代10代,间接免疫荧光检测结果确定重组细胞株在10代内性状稳定,说明稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系构建成功。     

猪下丘脑促生长激素释放激素(GHRH)基因克隆及序列分析

从杜长大杂交猪的下丘脑中提取基因组RNA,根据报道的猪GHRH cDNA序列设计引物1和引物2,用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）进行cDNA扩增,获得一条132 bp的片段,克隆于pGEM-T Easy载体后进行序列分析表明,该片段为GHRH基因的cDNA,它由132个核苷酸组成,编码44个氨基酸组成的多肽,即GHRH。本研究扩增得到的基因片段与报道的猪GHRH基因编码区序列完全一致。     

CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的影响

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪子宫内膜内皮细胞的机制,研究了CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的影响。将CD163分子转染猪子宫内膜内皮细胞,构建稳定表达CD163分子的猪子宫内膜内皮细胞系,用0.1 MOI的VR2332株PRRSV感染表达CD163分子的猪子宫内膜内皮细胞,收获不同感染时间的子代病毒并测定病毒滴度。结果显示,同一时间点CD163转染细胞组的PRRSV子代病毒滴度与空载体转染细胞组无明显差异。可见,CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞无明显作用。     

猪肌生成抑制素(MSTN)基因cDNA克隆及序列分析

利用GenBank中猪肌生成抑制素(MSTN)编码序列设计引物,以湖北白猪背最长肌肌细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出MSTN基因cDNA片段。该片段全长1277bp,包含猪MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与pUCm-T载体连接,转化到DH5α大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道的一致。     

抗有机磷农药单链抗体cDNA文库的构建与鉴定

为了获得针对不同有机磷农药的单链抗体,以人工合成的2种有机磷农药(杀螟硫磷和毒死蜱)抗原免疫小鼠,测定抗血清效价后,提取小鼠脾细胞总RNA,设计引物,通过RT-PCR扩增得到片段大小分别约为400bp和700bp的小鼠重链、轻链可变区基因,再利用融合PCR连接重链、轻链可变区,构建抗有机磷的单链抗体cDNA文库,片段约为1 100bp。将构建的cDNA文库与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α,测序分析表明,所构建的文库片段互补决定区序列变化明显,多样性好,为进一步筛选抗有机磷的高特异性、高亲和力单链抗体奠定了基础。     

猪肠道抗菌肽PR-39基因克隆及序列分析

从杜长大猪的骨髓中提取基因组RNA,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增,获得一条349bp的片段,克隆于pGEM-T Vector后进行序列分析结果表明,该片段为PR-39基因cDNA的部分序列,编码113个氨基酸组成的多肽,是成熟肽的主体部分.本研究得到的基因片段与报道的猪PR-39 cDNA部分序列完全一致.     

猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表达

依据Gen Bank中猪伪狂犬病毒(PRV)BJ/YT株gD基因设计引物,扩增gD蛋白抗原表位,其设计扩增长度为702 bp,将扩增片段克隆到p MD19-T载体获得p MD19-T-gD。利用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切p MD19-T-gD质粒,进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切片段,将回收片段与原核表达载体p ET-28a连接,成功构建了p ET-28a-gD表达载体。将表达载体转化感受态细胞Rosetta,IPTG诱导表达后,进行SDS–PAGE电泳,结果显示,在25 ku处出现特异性蛋白质条带。Western blot分析结果表明,表达产物能够被PRV的阳性血清识别。综上,成功克隆并表达了gD蛋白抗原表位,且其表达产物具有较好的生物学活性。     

猪带绦虫45W基因家族cDNA克隆和序列分析

 根据猪带绦虫45W基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对六钩蚴总RNA进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收,与载体pGEMT-easyVector连接,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,测序。结果显示,已成功克隆到重要保护性抗原45W基因B型转录本cDNA,完整开放阅读框(ORF)的大小为459bp。序列同源性分析与比较表明,所获得的9个B型转录本cDNA除TSO45W-4B-1和TSO45W-4B-2与已报道的TSO45W-4B同源外,其余均属于首次报道的4