利用体外受精-胚胎移植技术进行ALK3基因敲除小鼠的保种鉴定

建立用于ALK3基因敲除小鼠品种保存的体外受精一胚胎移植(IVF-ET)模型.采用杂合子雌性ALK3小鼠卵子与杂合子雄性ALK3小鼠精子进行体外受精,收集2-cell,进行胚胎冷冻,1周后进行胚胎复苏移植,通过PCR方法进行子代鉴定.结果表明,冻存胚胎320枚,复苏获得存活胚胎96枚,移植80枚,产子23只,获得杂合子11只,通过体外受精一胚胎移植可对ALK3基因敲除小鼠进行保种鉴定.     

ALK3基因敲除小鼠的繁育及基因鉴定

为了繁育和鉴定ALK3基因敲除小鼠,将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后提取每种基因型小鼠组织基因组DNA,用PCR法进行鉴定,将其雄性杂合子与雌性杂合子交配。结果表明：ALK3杂合子小鼠的繁殖和饲养均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠。说明正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得ALK3基因敲除纯合子小鼠的有效途径。     

F1代和ICR小鼠体外、体内受精后8-细胞胚胎玻璃化冷冻的比较

探讨了F1代(♀ICR×♂BALB/C6J)和ICR小鼠体外受精及体内受精两种不同来源获得的8-细胞胚胎玻璃化冷冻效果。不同来源的小鼠胚胎在预热到37℃1MDMSO溶液中处理后,转移到冷冻管中5min然后加入DAP213,并在0℃平衡5min后冷冻。体外受精及体内受精两种方法获得的F1代小鼠8-细胞胚胎解冻后的存活率分别为92.5%和93.33%;ICR代小鼠8-细胞胚胎解冻后的存活率分别为65.83%和67.50%。同一品系体外受精与体内受精来源的8-细胞胚胎冷冻复苏后胚胎存活率差异不显著(P>0.05),但不同品系体外受精及体内受精来源的8-细胞胚胎复苏率差异均显著(P<0.05),表明8-细胞胚胎冷冻复苏率的高低与胚胎获得的方法无关,但与品系的不同有关。     

湖羊胚胎和精液超低温保存效果的评价

【目的】 检验长期保存在国家家畜基因库的湖羊冷冻胚胎和冷冻精液的质量,评价超低温冷冻保存技术保种的效果。【方法】 对保存于国家家畜基因库的冷冻胚胎（保存20年）和冷冻精液（保存20和30年）进行复苏,进行相应鉴定后分别进行胚胎移植和人工授精,同时以0年冷冻精液和新鲜精液为对照,测定其受胎率和后代的羔皮性能、生长性能及繁殖性能,检验保存效果。【结果】 本试验共解冻胚胎36枚,其中,A级胚胎22枚,B级胚胎7枚,C级胚胎5枚,D级胚胎2枚,冷冻胚胎复苏利用率达到94.44%（34/36）,A级胚胎率达到61.11%（22/36）,移植34枚,产羔17只,冷冻胚胎复苏移植产羔率达50.00%;保存30年的冷冻精液复苏后平均精子活力达35%,受胎率为58.57%,平均产羔1.90只;保存20年冷冻精液复苏后平均精子活力达31%,受胎率为53.66%,平均产羔1.95只;胚胎复苏移植羊、30和20年冷冻精液后代体型外貌鉴定均符合纯种湖羊特征,没有畸形个体;羔羊一级羔皮率分别是31.25%、42.03%和23.81%,保持了当年湖羊的羔皮特性;生长发育及繁殖性能与现有湖羊群体性能基本保持一致。【结论】 利用超低温冷冻技术长期保存湖羊冷冻胚胎和冷冻精液的方法是可行的,对地方品种保种具有重要意义。     

牛性控体外受精冷冻胚胎移植试验

从美国引进的荷斯坦牛性控体外受精冷冻胚胎95枚,以鲁西黄牛、南阳牛、西杂牛、荷斯坦牛为受体进行移植试验.结果显示,移植受体95头,妊娠44头,妊娠率46.3%,流产7头,产母犊37头,效果良好.     

不同品种绵羔羊超数排卵及胚胎体外生产技术研究

探讨品种对羔羊超数排卵效果和卵母细胞发育能力的影响,并将体外受精胚胎进行了移植,为研究利用绵羊羔羊卵母细胞生产后代提供理论和技术方法。对4～8周龄不同品种羔羊用FSH+PSMG处理后获得的平均卵母细胞数量和体外胚胎卵裂率和囊胚率进行了比较,并比较成熟液中有无β-巯基乙醇对胚胎卵裂率和囊胚率的影响。结果:各品种获得的平均卵母细胞数分别为:哈萨克为210.22枚,湖羊为0枚,美利奴为135.80枚,湖羊与哈萨克的杂交后代为37.80枚,湖羊羔羊和湖羊与哈萨克羊的杂交羔羊获得的平均卵母细胞数显著低于哈萨克羔羊(P<0.01,P<0.05)。哈萨克羔羊卵裂率(69.0%)显著高于湖羊与哈萨克羊杂交羔羊(66.4%,P<0.05);哈萨克羔羊囊胚率(17.5%)和美利奴羔羊囊胚率(16.2%)显著高于湖羊×哈萨克羔羊(13.8%)(P<0.01,P<0.05)。β-巯基乙醇对羔羊胚胎卵裂率影响不显著,对囊胚率影响极显著(P<0.01)。哈萨克羔羊卵子体外受精获得的2-8细胞胚胎进行输卵管移植,14只受体羊中7只妊娠,妊娠率为50.0%;共产羔9只,其中8只存活。     

由体外受精囊胚获得ICR小鼠ES细胞

收集鼠卵母细胞和精子，采用体外受精技术，获得早期胚胎。体外培养胚胎至囊胚，分离内细胞团，获得ICR小鼠的ES细胞。结果不但获得了来自体外受精囊胚的ICR小鼠ES细胞，而且表明用体外受精方法获得的小鼠早期胚胎的数量明显大于常规方法，且比较稳定。ICR小鼠ES细胞的获得，为研究小鼠的ES细胞分化提供了条件。     

囊胚注射转基因ES细胞制作嵌合体的研究

在小鼠胚胎成纤维细胞制作的饲养层上培养并成功的维持了携带LacZ基因的胚胎干细胞系（S8），在此基础上，以S8为供体细胞，以远交系昆明白小鼠3．5d胚胎为受体，通过显微注射法将供体细胞转移到受体的囊胚腔内，经过恢复培养，移植到代孕鼠昆明白雌鼠的子宫中；后代在嵌合体出生一周后进行判定。本试验用8～13代的S8细胞共注射胚胎597枚，经1～3h恢复培养，有585枚胚胎重新具有膨大的囊胚腔，细胞轮廓分明，滋养层细胞间连接也清晰可见，胚胎成活率为97％；胚胎移植后，代孕母鼠共移植胚胎228枚，经17～19d的妊娠期后，产仔37只（2只死胎），产仔率为16％；有35只仔鼠（雄鼠18只，雌鼠17只）存活到可以判断毛色，共获得8只S8细胞毛色嵌合体小鼠，嵌合体的产生率为21．6％。结果表明用S8细胞经囊胚注射后能够获得嵌合体，并且嵌合体明显发生了性偏离现象。本试验为国内利用囊胚注射携带LacZ基因的胚胎干细胞获得嵌合体小鼠的首例报道。     

特克塞尔绵羊在山西右玉的胚胎移植效果

选取12只纯种特克塞尔羊作为供体,并采用递减法注射FSH进行超数排卵,发情后采用人工授精方式进行配种,手术法回收胚胎,鉴定后移植.164只右玉绵羊作为受体,采用两次PG注射法进行同期发情.结果表明12只供体获得胚胎共129枚,可用胚胎109枚,每只供体羊获得9.1枚可用胚胎,胚胎合格率为84.50%.134只受体表现发情,发情率为81.70%,其中同期发情的羊108只,同期发情率65.85%.109枚胚胎移入97只受体,其中12只移植双胚.61只受体被确认为妊娠,产下52只羔羊,产羔率为53.60%.12只供体手术后产下17羔羊.     

蒙古绵羊体外受精胚胎干细胞建系培养研究

蒙古绵羊体外受精的胚胎干细胞(SESC)一直未能成功建系,确定一种适合的培养体系及传代方法对其成功建系有着重要的意义。本研究将获得的体外受精胚胎直接培养,以胎鼠成纤维细胞为饲养层,运用机械传代法传代,采用培养液Ⅰ和培养液Ⅱ两种不同的培养液培养绵羊胚胎干细胞。采用形态鉴定、碱性磷酸酶染色、类胚体形成,免疫荧光染色等方法对获得的SESC进行干细胞检测。结果显示:培养液Ⅰ和培养液Ⅱ都可用于SESC的培养,而无血清的培养液Ⅱ更利于细胞的生长;机械传代法适合于SESC的传代培养;冷冻复苏之后经过形态鉴定、碱性磷酸酶染色、体外分化以及免疫荧光染色,均与胚胎干细胞的形态特征一致。     

荷斯坦奶牛与和牛活体采卵-体外受精（OPU/IVF）体系的建立及应用

[目的]研究牛活体采卵-体外受精（ovum pick-up and in vitro fertilization,OPU/IVF）体系,建立高效的牛体外胚胎生产系统。[方法]以从屠宰场采集的健康牛新鲜卵巢为试验材料,进行卵母细胞体外成熟、体外受精、体外胚胎培养相关条件的摸索,重点考查体外胚胎培养液中添加瘦素（leptin）对囊胚率的影响。选取13～15月龄健康荷斯坦奶牛及和牛各10头作为供体,进行活体采卵、卵母细胞体外成熟、体外胚胎生产,记录可用卵数及可用囊胚数,统计卵裂率、囊胚率;2个品种牛的体外冷冻胚胎解冻后,以荷斯坦奶牛为受体进行胚胎移植,移植后45 d统计妊娠率。[结果]添加30 U/mL的leptin可以显著（P<0.05）提高屠宰场来源牛体外胚胎的囊胚率。随机选择供体牛活体采卵,平均每头荷斯坦奶牛获得可用卵7.5枚,平均每头和牛获得可用卵8.1枚;荷斯坦奶牛及和牛的卵裂率分别为84.00%、82.71%,二者差异不显著（P>0.05）。体外培养条件下,平均每头荷斯坦奶牛获得可用囊胚4.3枚,平均每头和牛获得可用囊胚3.7枚;荷斯坦奶牛的囊胚率（57.33%）显著...     

水平显微注射法制备转基因小鼠的研究

由于传统显微注射法具有操作繁琐、技术要求高和外源基因导入率低等局限性,本试验对常规显微注射法进行改进,旨在建立一套比较完善的水平显微注射方法。采用水平微注射系统,将外源DNA片段导入胚胎的雄原核中,获得子代鼠,分娩后3周提取鼠尾基因组DNA,PCR法筛选转基因阳性鼠。本试验采用Puc/BLG IN S和Chym os in基因,共使用710枚鼠原核胚进行研究,胚胎经注射后移植了25只受体,产下仔鼠77只;妊娠率分别为33.3%(5/15)和50%(5/10),胚胎成活率分别为9.47%(41/433)和l3.00%(36/277),阳性率分别为4.88%(2/41)和8.33%(3/36)。将阳性雌鼠配种妊娠后,对外源基因整合情况进行检测,结果表明初步获得了转基因阳性小鼠。     

不同超数排卵方法所获羔山羊卵母细胞体外成熟率及体外受精率…

本研究观察了不同超排处理方法对羔山羊卵母细胞体外成熟及体外受精的影响并将体外受精胚胎进行了移植，以便探讨利用羔山羊卵母细胞生产体外受精胚胎的技术途径。     

核心群奶牛超数排卵技术影响因素的研究

[目的]为进一步研究核心群奶牛超数排卵技术影响因素。[方法]试验使用3个FSH剂量和4 个公牛精液对27头青年奶牛进行超数排卵。对供体牛胚胎生产情况和受体胚胎移植妊娠率进行统计。[结果]结果显示供体2次超排获得7.8枚平均可用胚胎显著高于1次超排获得的5.7枚平均可用胚胎(P<0.05);260,280 mg FSH超排供体获得6.0和7.7 枚平均可用胚胎显著高于300 mg FSH超排供体获得的4.6枚平均可用胚胎(P<0.05);供体使用4个公牛精液人工授精后获得的平均可用胚胎数和平均未受精卵数差异不显著(P>0.05);移植前接种疫苗的受体胚胎移植妊娠率显著降低(P<0.05）。[结论]核心群奶牛超排适宜FSH剂量为260-280 mg,使用高受精力公牛精液和对超排反应好的供体重复超排能够提高超排效率,受体移植前避免疫苗接种能够提高胚胎移植妊娠率。     

兔体外受精的研究

为完善家兔体外生产胚胎技术，采用FSH＋HCG法处理48只母兔，获得卵母细胞.采用获能的精子与卵母细胞进行体外受精，使用TCM199为基础液进行受精卵的体外培养.结果显示：平均每只供体兔可获得30.69枚可用卵母细胞.屠宰法获得的精子获能以后与卵母细胞进行体外受精，卵裂率达65.51%，囊胚发育率18.04%.自然射出法获得的精子获能以后，与卵母细胞进行体外受精，卵裂率达66.33%，囊胚发育率17.83%.屠宰法与自然射出法获得的精子获能以后卵裂率和囊胚发育率差异不显著.     

FVB和EIIa-Cre小鼠胚胎冷冻保存研究

为探索FVB和EIIa-Cre小鼠的最佳超排及胚胎冷冻方法,对4～6周龄FVB和EIIa-Cre小鼠进行超数排卵效果比较。结果表明,FVB和EIIa-Cre的超排数量分别为每鼠平均33.71枚和24.23枚,发育至2-细胞期的数量分别为30.43枚和17.08枚,EIIa-Cre的胚胎数明显少于FVB。FVB和EIIa-Cre的胚胎复苏率、妊娠率和产仔率均存在较大差异,分别为77.7%和63.0%、80.0%和57.1%、13.6%和8.2%,FVB小鼠均高于EIIa-Cre小鼠。     

EFS20/40和GP25玻璃化法冷冻保存小鼠体外受精2细胞期胚的效果

为了筛选适合用于冷冻保存小鼠体外受精2细胞期胚胎的方法,本研究采用EFS20/40法和GP25法对体外受精小鼠2细胞胚进行冷冻保存,并经解冻后进行体外培养,观察其胚胎发育至扩张囊胚的能力。其结果,虽然两种方法冷冻解冻后的正常胚胎回收率相近,但采用EFS20/40法冷冻解冻的胚胎在体外发育至扩张囊胚比率(84.9%)显著高于GP25法的54.8%(P0.05)。表明EFS20/40法适合用于小鼠体外受精2细胞期胚胎的冷冻保存。     

奶牛鲜胚移植试验研究

对11头荷斯坦奶牛进行超排处理,超排有效9头,有效率82%,头均获得胚胎7.8枚,其中可用胚头均5.3枚.移植荷斯坦受体牛37头,妊娠率51.4%;移植秦川黄牛6头,妊娠率50%.     

应用LAMP法鉴定牛早期胚胎性别试验

使用LAMP法对12枚牛体外受精胚胎的基因扩增,通过使用不同的引物,对牛胚胎中的雄性特异性核酸序列和雌雄共有的核酸序列进行扩增,鉴定胚胎的性别,结果7枚为雌性,5枚雄性。     

牛双胎生产技术的现状

在自然状态下牛的双胎率因品种、胎次、地区的不同而异,但一般牛的双胎率为1～4％。使用胚胎移植技术可以得到较高的双胎率,从而有可能扩大肉牛生产并降低生产成本。本文就应用胚胎移植技术生产双犊的方法作一简介。一.双犊生产技术双犊生产有以下几种方法。 1.移植2枚胚胎生产双犊此法是给一头母牛移植2枚胚胎,使之一次妊娠并分娩2头犊牛。应用该项技术,受胎率和双胎率都高,这是当前双犊生产的主要方法。通过移植2枚胚胎生产双犊的方法有两种:向两侧子宫角各移植1枚胚胎或向黄体侧子宫角移植2枚胚胎。