柑橘大实蝇NPC2基因的序列分析和组织表达模式

柑橘大实蝇是柑橘上的重要害虫,主要为害柑橘果实。NPC2是一种小分子蛋白,参与了脊椎动物的脂质代谢,最近有研究表明,NPC2有着类似于昆虫气味结合蛋白的功能,参与了昆虫的化学通讯。为了明确NPC2基因在柑橘大实蝇成虫组织中的分布,本研究从柑橘大实蝇转录组中,鉴定了NPC2基因,命名为BminNPC2。通过生物信息学方法分析了该基因序列特征并构建了系统进化树,采用实时荧光定量PCR技术研究了BminNPC2基因在柑橘大实蝇成虫组织中的表达模式。结果表明:BminNPC2基因开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸,等电点为6.10,分子量大小为16.66 kD,含有6个半胱氨酸。BminNPC2基因在柑橘大实蝇头部(去掉触角)和腹部表达量最高。据此结果我们在文中对BminNPC2基因功能进行了简要讨论。     

黑尾叶蝉精氨酸激酶和一个谷胱甘肽S转移酶基因的克隆和发育表达特性研究

黑尾叶蝉（Nephotettix cincticeps）是一种能传播病毒的水稻害虫,对水稻生产有着巨大的威胁。本文在黑尾叶蝉中克隆得到了一个精氨酸激酶基因（NcAK）和一个delta类型的谷胱甘肽-S-转移酶基因（NcGST）,并对两个基因进行了序列分析和表达特性检测。结果表明,NcAK包含的开放阅读框长度为1 068 bp,编码一个含356个氨基酸的蛋白。进化研究表明该蛋白序列与玻璃翅叶蝉（Homalodisca vitripennis）的精氨酸激酶的序列亲缘关系最近。Real time结果表明NcAK在黑尾叶蝉的雄成虫中表达量高于在卵、1龄若虫、5龄若虫和雌成虫中的表达量。NcGST的开放阅读框由651个碱基组成,编码一个包含217氨基酸的蛋白,进化研究表明该蛋白与美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)GSTs编码蛋白亲缘关系最近。表达量检测表明NcGST在5龄若虫和雌雄成虫中的表达量要高于在卵和1龄的表达量。     

韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白基因的克隆及光强度对其表达量影响

为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用qPCR技术检测了不同发育阶段、不同组织及不同光强度下Bo-uv基因的相对表达量。结果表明,Bo-uv基因cDNA全长2 757 bp,开放阅读框1 542 bp,编码514个氨基酸。韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为21.93%～43.00%,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的氨基酸序列同源性最高。Bo-uv基因在韭菜迟眼蕈蚊蛹末期、成虫期表达,在成虫头部的相对表达量较高。在0～10 000 lx光强范围内雌、雄成虫体内该基因的相对表达量均呈先增高后降低趋势。与对照相比,1 000 lx光强度下其相对表达量显著升高,10 000 lx时相对表达量显著降低。表明光强度能够有效地调控Bo-uv基因的表达,该基因在韭菜迟眼蕈蚊感知外界光刺激过程中具有重要作用。     

柑橘大实蝇低覆盖度基因组及其分析

为探究柑橘大实蝇Bactrocera minax的全基因组信息,以海关口岸截获的柑橘大实蝇样本为材料,提取DNA后构建350 bp短片段文库,采用Illumina二代测序平台开展全基因组测序,进行基因组组装、完整性评估和注释分析。结果表明,柑橘大实蝇的基因组大小为368.14 Mb,重复序列占比为16.27%,杂合率为0.79%,属于中等杂合度基因组。基因组组装得到43 124条contigs,contig N50长度为94 994 bp。BUSCO评估显示,组装的基因组可完整覆盖98.80%昆虫保守的单拷贝直系同源基因,表明该组装的完整性很高,可以满足后续分析。通过EVM注释流程整合了从头预测、同源预测和基于转录组预测等不同方法的注释结果,共预测到35 655个蛋白编码基因,其中24 343个基因有功能注释。     

芽胞杆菌CQBS03抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

为了探讨柑桔溃疡病生防菌芽胞杆菌Bacillus CQBS03菌株TasA基因的功能,采用PCR方法从CQBS03基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建pEASY-E1/TasA原核表达载体,经大肠杆菌Escherichia coli表达获得TasA基因的融合表达蛋白,纸碟法检验融合蛋白对柑桔溃疡病菌Xanthomonas citri citri的抑制作用。结果显示,CQBS03菌株的TasA基因包含1个786 bp的完整开放阅读框（GenBank登录号为JQ309841）,编码261个氨基酸残基;该序列与来源于解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens的1个已知同源TasA基因序列FJ713580的相似性达99.75%。原核表达产物经SDS-PAGE分析,检测到约31 kD的融合蛋白;纯化后的融合蛋白对柑桔溃疡病菌有明显的抑制作用,72 h后抑菌圈直径达11.5 mm。研究表明TasA基因是生防菌芽胞杆菌CQBS03抑制柑桔溃疡病菌的功能基因之一,并且该基因对原核表达宿主没有抑制作用,具有较好的开发利用前景。     

八字地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因cDNA序列的克隆及原核表达研究

［目的］ 克隆八字地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的cDNA序列并进行原核表达。［方法］ 以八字地老虎预蛹期幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术克隆基因cDNA序列,将cDNA序列编码区连接到原核表达载体pET21b并转化BL21进行原核表达,并使用His tag纯化试剂盒将目的蛋白进行纯化。［结果］ 得到cDNA全长序列,含有2 488个碱基,包括一个1 785个碱基的开放阅读框,编码一个含594个氨基酸的蛋白,分子量为67.8 ku,等电点5.38,该序列登录GenBank并获得登录号FJ848784。诱导表达蛋白经SDS PAGE电泳得到目的蛋白带,纯化结果也获得了目的蛋白带。［结论］获得了一条新的八字地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的cDNA序列并对其在原核表达系统中进行了成功表达和纯化。     

大螟两个mGST1基因的时空分布及经氯虫苯甲酰胺诱导后的表达情况

为明确微粒体谷胱甘肽S-转移酶（microsomal glutathione S-transferase,mGST）是否参与大螟Sesamia inferens对氯虫苯甲酰胺的解毒代谢，采用Illumina深度测序技术分析大螟转录组数据获得mGST1基因序列，利用实时荧光定量PCR技术测定其在大螟不同龄期幼虫和4龄幼虫不同组织中的表达模式，及经不同浓度氯虫苯甲酰胺处理不同时间后的相对表达量。结果表明，共获得2个mGST1基因序列，分别命名为SimGST1-1和SimGST1-2(GenBank登录号分别为OL770267和OL770268)。SimGST1-1和SimGST1-2的开放阅读框分别为456 bp和447 bp，分别编码152个和149个氨基酸，均具有昆虫mGST的特征序列。SimGST1-1和SimGST1-2在大螟不同龄期幼虫体内均有表达，且在4～6龄幼虫体内的相对表达量显著高于1～3龄幼虫。SimGST1-1在4龄幼虫中肠和脂肪体中的相对表达量显著高于在头部和表皮中的相对表达量，SimGST1-2在头部和中肠中的相对表达量显著高于在表皮和脂肪体中的相对表达量。与对照组...     

悬铃木方翅网蝽非典型气味受体基因CcilOrco的克隆与序列分析

为进一步研究悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliate嗅觉通讯分子机制和寻求新的悬铃木方翅网蝽防治技术,本研究克隆了悬铃木方翅网蝽的非典型气味受体基因CcilOrco,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中已发表的半翅目昆虫非典型气味受体家族基因的氨基酸保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其克隆至pEASY-Blunt载体并测序。将克隆获得悬铃木方翅网蝽非典型气味受体Orco的cDNA序列命名为CcilOrco(GenBank登录号:MF564288),序列分析结果显示,CcilOrco开放阅读框长1 419bp,编码472个氨基酸。预测其分子量为53.25kD,等电点为6.22,序列中有7个跨膜区,N-端在细胞膜内,C-端在细胞膜外。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,该基因与已公布的半翅目昆虫的非典型气味受体基因序列有较高的同源性。克隆所获得的基因属于非典型气味受体家族基因。qPCR结果显示CcilOrco主要在雌雄成虫触角中高表达。     

沙葱萤叶甲己糖激酶基因的克隆、相对表达量及RNA干扰效应

为揭示沙葱萤叶甲Galeruca daurica己糖激酶基因的功能,根据本课题组组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）克隆获得沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列与其它昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,采用实时荧光定量技术（real-time quantitative polymerasechain reaction,qPCR）测定不同发育阶段和不同温度下沙葱萤叶甲己糖激酶基因的相对表达量以及对RNA干扰的响应。结果表明,沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长为1 699 bp,开放阅读框长为1 479 bp,编码492个氨基酸;沙葱萤叶甲己糖激酶氨基酸序列与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera己糖激酶氨基酸序列一致性最高,为65.42%。己糖激酶基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,成虫滞育期间相对表达量维持在低水平,而滞育结束后相对表达量急剧上升达最高值。在0~40℃范围内,随着温度增加,己糖激酶基因在沙葱萤叶甲成虫体内相对表达量呈先升高后下降的趋势。采用RNA干扰技术沉默沙葱萤叶甲成虫己糖激酶基因2 d后,与对照相比,己糖激酶基因相对表达量下调90%以上,4 d后仍下调40%以上;该基因干扰后12 d内,沙葱萤叶甲成虫存活率下降了25%以上。表明己糖激酶基因可能在沙葱萤叶甲生长发育和滞育过程中起着重要作用。     

Harpin-elicited hypersensitive cell death and pathogen resistance require the NDR1 and EDS1 genes

Plants sprayed with harpin, a bacterial protein that induces hypersensitive cell death (HCD), develop systemic acquired resistance (SAR) without macroscopic necrosis. HCD sometimes accompanies the development of resistance conferred by resistance (R) genes. In Arabidopsis, some R genes require one or both of the signalling components NDR1 and EDS1 for function. This study addresses whether HCD, NDR1 and EDS1 are required for induction of SAR by harpin. When Arabidopsis and tobacco leaves were sprayed with harpin, microscopic hypersensitive response (micro-HR) lesions developed. Systemic expression of PR genes and the development of resistance were accompanied by micro-HR, except in the ndr1-1 mutant, in which harpin induced micro-HR without the development of resistance or expression of the PR-1 gene. Cell death and resistance did not occur following treatment with harpin in plants that could not accumulate salicylic acid. Harpin also failed to induce resistance in Arabidopsis eds1-1 mutants. Therefore, harpin-induced resistance seems to develop concomitantly with cell death and resistance requires NDR1 and EDS1.     

东亚小花蝽对草地贪夜蛾1龄幼虫的捕食作用

为明确天敌昆虫东亚小花蝽Orius sauteri对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda幼虫的捕食潜力,在室内测定东亚小花蝽5龄若虫和成虫对草地贪夜蛾1龄幼虫的日捕食量,并对其捕食功能、搜寻效应和干扰效应进行分析。结果表明:东亚小花蝽5龄若虫和成虫对草地贪夜蛾1龄幼虫的捕食功能反应符合Holling II模型;东亚小花蝽5龄若虫对草地贪夜蛾1龄幼虫的日最大捕食量、瞬时攻击率和处理单头猎物的时间分别为20.833头、0.747和0.048 d;东亚小花蝽成虫对草地贪夜蛾1龄幼虫的日最大捕食量、瞬时攻击率和处理单头猎物的时间分别为11.236头、1.355和0.089 d。东亚小花蝽的日捕食量与草地贪夜蛾密度呈正相关,搜寻效应与草地贪夜蛾密度呈负相关。东亚小花蝽自身密度对其捕食作用的干扰符合Hassell模型,对草地贪夜蛾1龄幼虫的捕食作用率随自身密度的增加而降低。     

Excision of the Candystripe1 transposon from a hyper-mutable Y1-cs allele shows that the sorghumY1 gene controls the biosynthesis of both 3-deoxyanthocyanidin phytoalexins and phlobaphene pigments

The 3-deoxyanthocyanidin phytoalexins produced in sorghum leaves in response to Colletotrichum sublineolum have chemical structure similarities to the 3-deoxy flavonoids that are precursors of phlobaphene pigments. Phlobaphenes are commonly observed in the pericarp of mature sorghum grains, while synthesis of 3-deoxyanthocyanidin phytoalexins is a site-specific response to infection with C. sublineolum. We have taken a genetic approach to investigate the possible overlap between the two sub-branches of flavonoid biosynthesis in sorghum that lead to phlobaphenes and 3-deoxyanthocyanidin phytoalexins. A sorghum line with a functional y1 gene synthesizes 3-deoxyanthocyanidins as well as phlobaphenes. However, a progenitor line with the mutable Y1-candystripe (Y1-cs) allele shows variable levels of biosynthesis of these compounds. The Y1-cs allele carries a copy of the Candystripe1 (Cs1) transposable element in the y1 gene. We demonstrate here that the variability in the expression of 3-deoxyanthocyanidins produced in individual mesocotyls of hyper-mutable Y1-cs plants is a function of the activity of the y1 gene. TheCs1 insertion in the Y1-cs allele blocks y1 function, while excision of Cs1 out of they1 locus restores the gene to a functional state. The combined molecular and biochemical characterization of sibling plants confirms that the allelic state of the y1 gene is completely correlated with the production of phytoalexins in response to fungal infection. These results provide support for the idea that the y1 gene regulates the biosynthesis of both 3-deoxyanthocyanidin phytoalexins and phlobaphene pigments in sorghum.     

转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗虫性评价

为评估转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)和斜纹夜蛾Prodenia litura(Fabricius)的抗虫性,在室内测定了3个转cry1Ab/cry2Aj玉米品系和1个转cry1Ab/vip3DA玉米品系对3种害虫幼虫存活和生长发育的影响,研究了该系列Bt玉米不同组织器官对害虫的杀虫活性和控制效果。结果显示,棉铃虫初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片96h后死亡率为87.50%~90.00%,取食花丝和雌穗的幼虫96h后几乎全部死亡;甜菜夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗168h后死亡率为22.50%~68.33%,幼虫的生长发育受到明显抑制,体重抑制率达85.00%~95.00%;斜纹夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗96 h后死亡率显著高于非转基因亲本对照,168h后幼虫死亡率达90.00%以上。研究表明,转cry1Ab/cry2Aj和cry1Ab/vip3DA玉米品系对棉铃虫和斜纹夜蛾的初孵幼虫表现出较好的抗性,可以作为转多基因抗虫玉米育种的备选材料。     

生防菌株ZA1的GFP基因标记及其功能稳定性测定

为明确生防莫海威芽胞杆菌Bacillus mojavensis菌株ZA1在作物体内定殖与作物和病原物的作用机理,运用电击转化法将绿色荧光蛋白表达载体pGFP78导入菌株ZA1体内,并采用细菌培养法、继代培养法和平板抑制法检测其功能稳定性。结果表明,质粒pGFP78成功导入菌株ZA1,标记后菌株ZA1-gfp经形态学和分子生物学验证均证明菌株ZA1已成功标记,标记菌株ZA1-gfp与菌株ZA1形态一致,在荧光显微镜下呈现明亮的绿色,并且能够提取导入质粒pGFP78,扩展出质粒所携带的启动子78序列。功能稳定性鉴定结果表明,标记菌株ZA1-gfp遗传稳定性达100%;与菌株ZA1的生长速率差异不显著,且不影响菌株的运动性;菌株ZA1对马铃薯枯萎病菌、马铃薯炭疽病菌和马铃薯坏疽病菌的抑制率分别为64.50%、68.35%和66.55%,标记菌株ZA1-gfp对3种病原真菌的抑制率分别为67.46%、76.56%和66.75%,表明外源质粒的导入,不影响菌株的抑菌能力。     

Mating type gene MAT1-2-1 is common among Japanese isolates of Verticillium dahliae

Mating type genes of Verticillium dahliae, a wilt pathogen affecting many plant species, were identified to examine sexual recombination between Japanese pathotypes. We amplified a DNA sequence encoding high mobility group (HMG) box from V. dahliae using PCR. A cloned genomic DNA fragment included a sequence homologous to MAT1-2-1 gene. Despite that sequence's presence in all V. dahliae isolates we used, MAT1-1-1 (an opposite mating type gene) was never amplified. We concluded that V. dahliae is potentially heterothallic. Furthermore, sexual bias practically obviates sexual recombination between Japanese pathotypes. This report describes, for the first time, a mating type gene of phytopathogenic Verticillium.     

西伯利亚蝗卵发育过程中血蓝蛋白基因Hc1、Hc2表达、差异及其与土壤温度的关系

为明确血蓝蛋白基因在新疆优势害虫西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus卵发育过程中的作用,本研究采用实时荧光定量PCR技术检测血蓝蛋白基因Hc1、Hc2在西伯利亚蝗卵不同发育阶段和1龄蝗蝻中的相对表达量,比较基因Hc1、Hc2相对表达量的差异,并分析这2个基因与土壤温度的相关性。结果表明,血蓝蛋白基因Hc1和Hc2在西伯利亚蝗卵所有发育阶段均有表达,并具有阶段特异性。在蝗卵早期发育阶段,Hc1基因相对表达量较高,Hc2基因相对表达量较低,其中在I阶段,Hc2基因相对表达量最低,为0.05;在滞育阶段,Hc1基因相对表达量降低,且在深度滞育期降至最低,为0.12,Hc2基因相对表达量略有增加;在滞育解除后发育阶段,Hc1基因相对表达量无显著变化,Hc2基因相对表达量在第VIII阶段最高,为17.26;在1龄蝗蝻阶段,Hc1基因相对表达量急剧升高至最大值,为39.43,Hc2基因相对表达量急剧下降。在西伯利亚蝗卵发育过程中,Hc1基因相对表达量平均数为8.83,高于Hc2基因的平均数,且蝗卵早期发育阶段、滞育后发育阶段和1龄蝗蝻阶段的Hc1和Hc2基因相对表达量之间差异显著。土壤温度与西伯利亚蝗卵各发育阶段和1龄蝗蝻阶段中Hc1基因相对表达量正相关,但相关性不显著,与Hc2基因相对表达量无显著相关性。     

粘质沙雷氏菌S-JS1与5种杀虫剂对灰飞虱的联合作用及该菌对灰飞虱相关酶活性的影响

为明确粘质沙雷氏菌Serratia marcescens S-JS1与杀虫剂对灰飞虱的联合作用,以及S-JS1对灰飞虱解毒酶和保护酶活性的影响,以灰飞虱3龄若虫为对象,采用喷雾法比较了S-JS1与5种杀虫剂 (螺虫乙酯、噻虫嗪、吡虫啉、啶虫脒和毒死蜱) 单用,以及菌、药混用对灰飞虱的杀虫活性,测定了灰飞虱取食经S-JS1处理的水稻后,虫体内羧酸酯酶 (CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶 (GSTs)、过氧化物酶 (POD) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性变化。结果表明:粘质沙雷氏菌S-JS1分别与不同浓度杀虫剂混用,均可提高杀虫剂对灰飞虱的致死率。其中,109 cfu/mL的S-JS1与1.25 mg/L的噻虫嗪混用处理3 d,或与25 mg/L的螺虫乙酯混用处理5 d,灰飞虱的死亡率分别为65.58%和76.27%,均显著高于同浓度杀虫剂单用的处理 (噻虫嗪单用时致死率为44.24%,螺虫乙酯为49.22%),表现为增效作用 (χ2 > 3.84,实测死亡率 – 预期死亡率 > 0);其他各混用处理均为相加作用 (χ2 < 3.84)。灰飞虱取食经粘质沙雷氏菌处理的水稻苗后12和24 h,其CarE活性与对照组间无显著性差异,GSTs活性呈先降低后升高趋势,POD和SOD活性均低于对照组。研究表明,粘质沙雷氏菌S-JS1可能降低了灰飞虱对杀虫剂的抵抗力。本研究可为探索昆虫病原细菌与杀虫剂间的联合应用提供参考,为灰飞虱的有效防治提供新思路。     

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号对田间稻纵卷叶螟和二化螟及其捕食性天敌的影响

为研究转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号对稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis和二化螟Chilo suppressalis及其捕食性天敌的影响,采用剥查法和吸虫法,于2012—2013年在江西省南昌县调查了赣绿1号田间稻纵卷叶螟与二化螟的发生为害情况及其捕食性天敌拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata和拟水狼蛛Pirata subpiraricus的种群动态。结果表明,与非转基因亲本9311水稻相比,在2012和2013年螟虫为害高峰期,赣绿1号田间稻纵卷叶螟百株虫量分别减少57.78头和27.78头,卷叶率分别降低20.46%和6.50%;二化螟百株虫量分别减少24.44头和152.22头,枯心/白穗率分别降低13.02%和14.20%。此外,赣绿1号与9311水稻田间拟环纹豹蛛和拟水狼蛛的种群动态趋势基本一致。研究表明,转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号能有效控制稻纵卷叶螟和二化螟,而对其捕食性天敌拟环纹豹蛛和拟水狼蛛无显著影响。     

酵母pac1基因介导对葡萄B病毒的抗性

为明确广谱性抗病毒基因—酵母pac1基因对葡萄B病毒(Grapevine virus B,GVB)的抗性效果,通过农杆菌介导的遗传转化,将pac1基因导入西方烟37B,对转基因植株进行PCR鉴定及Southern blot分析,通过病毒摩擦接种观察症状以及实时荧光定量RT-PCR检测植株体内病毒含量,并对转基因植株抗病性进行初步鉴定。结果表明,目的基因pac1成功导入并整合至西方烟37B基因组,共获得10个转基因株系。不同株系的T1代烟草中阳性植株比例为16.7%~72.7%,表明目的基因可成功遗传到子代。接种病毒后转基因植株普遍延迟发病,但后期症状与非转基因对照相似,其中仅1个转基因株系B6具有不表现典型症状等抗性反应。接种植株病毒含量检测中,所有转基因植株均检测到病毒存在,但表现为抗病的B6株系中病毒含量显著低于非转基因对照,表明该转基因植株虽不能完全抵抗GVB侵染,但对GVB具有耐病性。