云南蚕区采集桑褐斑病病原真菌基于rDNA-ITS序列的分类鉴定与系统发育分析

已报道的桑褐斑病的病原真菌有桑粘隔孢(Septogloeum mori Briosi et Cavara)和桑褐斑壳丰孢[Phloeospora maculans(Bereng.)Allesch]两种。在云南省不同蚕区选择感染桑褐斑病的桑树分离病原菌株,以待测病原菌株的基因组DNA为模板,采用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增各菌株的r DNA-ITS序列。对菌株PCR产物测序后比对Gen Bank数据库中已提交桑褐斑病病原菌的r DNA-ITS同源序列,应用MEGA5.2软件和Neighbor-Joining法,分别计算遗传距离及构建系统发育进化树分析亲缘关系。结果表明,从云南省不同蚕区感病桑树分离的桑褐斑病病原菌r DNA-ITS序列与Gen Bank中登录桑褐斑壳丰孢P.maculans的r DNA-ITS序列(登录号:GU214670.1)、桑球腔菌[Mycosphaerella mori(Fckl.)Wolf]r DNA-ITS序列(登录号:AB435069.1)的遗传距离很近,序列相似度达99%以上,聚为同一分支,其中编号BS、DY、ML、QJ的菌株与来自印度的桑球腔菌的序列相似度达到100%。由此认为,引起云南蚕区桑褐斑病的病原真菌为桑褐斑壳丰孢Phloeospora maculans,有性态为桑球腔菌Mycosphaerella mori。     

桑褐斑壳丰孢菌pmcamk基因的克隆与表达时相分析

钙/钙调素依赖性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinases, CAMK)作为钙信号途径中的关键蛋白,在多种细胞过程中发挥重要作用。以桑褐斑壳丰孢菌(Phloeospora maculans)为研究对象,利用反转录PCR结合RACE技术克隆桑褐斑壳丰孢菌(Phloeospora maculans)钙/钙调素依赖性蛋白激酶基因pmcamk的序列全长,利用荧光定量PCR技术,研究pmcamk在桑褐斑壳丰孢菌侵染宿主后不同时期以及其分生孢子在水中萌发过程中的表达模式,以期深入了解桑褐斑壳丰孢菌Ca²⁺信号转导途径与孢子萌发之间的关系。结果表明,pmcamk的cDNA序列全长为1 422 bp,由1 221 bp的开放阅读框和201 bp的3′非翻译区组成,GenBank登录号为MK713976。pmcamk开放阅读框共编码406个氨基酸残基,蛋白质分子质量约为45.5 kD,等电点为6.28。系统进化树分析表明桑褐斑壳丰孢菌与小麦叶枯病菌的CAMK同源性最高,属于CAMKⅠ类群并且聚类在同一进化分支。在桑褐斑壳丰孢菌...     

桑褐斑壳丰孢菌Phloeospora maculans的主要生物学特性研究

桑褐斑壳丰孢(Phloeospora maculans)是近几年鉴定的云南蚕区桑园发生桑褐斑病的主要病原菌之一。采用菌丝生长速率法研究不同培养基及碳源和氮源、p H值、温度、光照条件对该病原菌菌丝生长与产孢量的影响。结果表明,桑褐斑壳丰孢的菌丝适宜在PDA培养基和PDA+1%桑叶碎片培养基(简称PDA桑叶培养基)上生长,其中PDA桑叶培养基是最佳的产孢培养基;菌丝生长最佳培养基中的碳源和氮源物质分别是麦芽糖、蛋白胨,以可溶性淀粉为碳源的培养基产孢量最大,而在所有有氮源和无氮源物质的培养基上均不产孢;菌丝生长的最适培养基p H值为6~9,而p H 6时产孢量最大;在22~28℃培养条件下,菌丝生长最快,产孢量最大;连续黑暗条件适合菌丝生长和产孢;菌丝的致死温度条件为50℃水浴处理10 min。上述研究结果提示桑褐斑壳丰孢有很强的营养利用和环境适应能力。     

桑褐斑病病原菌的分离鉴定及高通量测序分析

桑褐斑病是一种发生较为普遍的真菌性病害。从陕西安康蚕桑主产区收集桑褐斑病病样,结合科赫氏法则,采用形态学及分子生物学的方法对桑褐斑病病原菌进行分离鉴定;使用高通量测序技术,确定桑褐斑病病原菌的主要类群;通过水合氯醛透明反应观察桑褐斑病病原菌在宿主桑树叶片中的定植状态。结果表明,侵染陕西安康桑树的桑褐斑病病原菌为桑新褐斑壳丰孢Neophloeospora maculans;病原菌在PDA培养基上呈白色,生长速度缓慢,分生孢子为透明圆柱形,两端逐渐变细,有隔膜;菌丝主要寄生在桑叶的气孔与叶脉周边;病原菌rDNA序列全长5 512 bp, GC含量51.16%。上述结果确定了侵染陕西安康蚕桑主产区桑褐斑病病原菌的种类,为桑褐斑病的防治提供了理论依据。     

5种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢病菌的抑制活性和对家蚕的毒力测定

为筛选对桑褐斑病病原菌有高效抑制作用且对养蚕生产安全的杀菌剂,在室内测定了5种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢[Phloeospora maculans(Bereng.)Allesch]病菌的抑制活性,以及对家蚕(Bombyx mori)3龄起蚕的急性毒性。5种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢病菌的菌丝生长抑制活性从高到低依次为苯醚甲环唑、丙环唑、氟环唑、戊唑醇、嘧菌酯,以上排序杀菌剂对菌丝生长的抑制中浓度(EC50)分别为0.006 6、0.020 5、0.028 9、0.258 0和2.265 0 mg/L;5种杀菌剂对病原菌孢子萌发的抑制活性从高到低依次为嘧菌酯、苯醚甲环唑、丙环唑、戊唑醇、氟环唑,以上排序杀菌剂对病原菌孢子萌发的EC50分别为12.835 5、16.996 4、19.491 8、20.466 1和30.025 2 mg/L。5种杀菌剂对3龄起蚕的24 h毒性从大到小依次为嘧菌酯、氟环唑、苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑,以上排序杀菌剂对3龄起蚕的致死中浓度(LC50)分别为899.075 8、1 728.665 7、1 914.126 6、3 283.528 3、6 058.064 5 mg/L,均表现为低毒性。试验结果提示,嘧菌酯对病原菌孢子萌发有较高的抑制活性,可以用于桑园中对桑褐斑病的预防;其余4种三唑类杀菌剂对病原菌的菌丝生长有较高的抑制活性,可以用于感染桑褐斑病的桑树的治疗。具体的施药方案,则需要进一步评估田间用药对家蚕的安全风险性后确定。     

椒碱烯酰胺对桑褐斑病的防效及对家蚕的毒性

为了探索杀菌剂椒碱烯酰胺用于蚕业生产上防治桑褐斑病的可行性,采用菌丝抑制法测定椒碱烯酰胺对其病原真菌桑褐斑壳丰孢菌(Phloeospora maculans)的毒力,采用田间喷雾法进行田间防治试验,并采用食下毒叶法测定其对非靶标生/L,抑制效果明显高于对照药剂甲基硫菌灵;田间用药2次后,椒碱烯酰胺300倍稀释液防效最高为4458%,500倍稀释液为3249%,对照药剂甲基硫菌灵1 000倍稀释液为004%。椒碱烯酰胺对3龄起蚕的致死中浓度(LC_(50))为18166 mg/L,约为甲基硫菌灵的19倍。椒碱烯酰胺对家蚕龄期经过、茧层量和健蛹体质量无明显影响,但会影响眠蚕的体质量。研究结果可以为用椒碱烯酰胺与化学农药配伍防治桑褐斑病提供依据。     

桑天牛不同地理种群遗传分化的AFLP分析

研究桑天牛不同地理种群的遗传分化,为探讨桑天牛在不同区域暴发危害的规律提供理论依据。采用AFLP技术,对6个桑天牛地理种群的DNA进行扩增,5对引物组合得到扩增条带共241条,有多态性条带196条,平均多态性位点比率为81.33%,其中杭州种群具有13条特异条带。遗传距离分析结果:来自河北省的4个桑天牛地理种群间的平均遗传距离为0.270 3;来自浙江杭州的桑天牛种群与来自河南济源的桑天牛种群之间的遗传距离为0.397 2,二者与河北省的4个桑天牛地理种群间的平均遗传距离分别为0.418 2、0.333 4。聚类分析也显示,地理上相距越远,桑天牛种群间的遗传分化越大。     

32份广东桑类型桑树种质资源亲缘关系的SRAP标记分析

广东桑类型是由分布在广西壮族自治区和广东省的广东桑种形成的桑树栽培类型。利用相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记技术,对两广地区的部分广东桑类型桑树种质资源的亲缘关系进行分析,为地方桑树种质资源的遗传多样性保护和利用提供依据。选用22对SRAP引物组合在32份桑树种质材料中共扩增出144条带,其中有44条多态性带,多态性比率30.56%,平均每对引物组合扩增出2条多态性带。32份桑树种质材料间的遗传相似系数值变化范围为0.826 4～1.000 0,平均值0.894 4,说明供试广东桑类型桑树种质材料间存在较高遗传变异。采用UPGMA法进行聚类分析,将32份桑树种质材料划分成3类:第Ⅰ类包括了20份来自广西的地方品种资源,第Ⅱ类包括了3份来自广东的选育品种资源和7份来自广西的选育品种资源,第Ⅲ类的2份种质资源分别来自广西和广东。同一类群的各亚类群又多以同一地理来源的品种或亲本有相近、相同血缘的品种聚集。研究结果说明SRAP标记能很好地揭示同一桑种不同种质材料间的遗传多样性和亲缘关系,广东桑类型桑树种质资源的遗传多样性与地理来源有密切关系。     

柑橘链格孢褐斑病菌种群对嘧菌酯的抗性监测和抗性分子机制

摘要：为明确抗嘧菌酯柑橘链格孢褐斑病菌在我国的分布、频率、抗性水平和抗性分子机制,本文从重庆、湖南、浙江、云南、广东和广西等有链格孢褐斑病发生的地区收集了54个链格孢褐斑病菌(Alternaria alternata)菌株,通过刃天青染料显色法测定菌株对嘧菌酯的敏感性,扩增、测序和比较嘧菌酯敏感和抗性菌株Cytb基因部分序列,探明我国柑橘链格孢褐斑病菌种群对杀菌剂嘧菌酯(azoxystrobin)的抗性现状和抗性分子机制。结果表明,嘧菌酯抗性菌系在各采样的果园菌存在,抗性频率达14～42%,平均为30%,抗性系数18～112。2个敏感菌株的Cytb 基因第143位氨基酸为甘氨酸,16个抗性菌株则为丙氨酸,由此推测Cytb基因143位氨基酸从甘氨酸突变为丙氨酸是褐斑病菌抗嘧菌酯的分子机制,这一结论与之前国外报道一致。抗嘧菌酯柑橘链格孢褐斑病菌群体在我国褐斑病发生地区的普遍存在,提醒我们在防治柑橘链格孢褐斑病时需谨慎选择QoI类杀菌剂。     

利用ISSR标记对93份广东桑桑树种质资源的遗传多样性分析

应用ISSR分子标记技术分析广东桑(Morus atropurpurea Roxb.)桑树种质资源的遗传多样性,为桑树种质资源保存、鉴定及新品种选育提供基础依据。以13个ISSR引物从93份广东桑桑树种质材料的基因组DNA中共扩增出128条带,其中多态性条带94条,多态性比率为73.44%,表明供试的广东桑桑树种质材料间存在丰富的遗传多样性。93份广东桑桑树种质材料间的遗传相似系数为0.585 9～0.937 5,平均为0.761 7。基于供试种质材料间的遗传相似系数,采用UPGMA法对93份广东桑桑树种质材料的遗传关系进行聚类分析,93份种质材料在遗传相似系数0.664处被划分为6个组群,在遗传相似系数0.685处,第Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ组群分别被分成2个亚组。研究结果显示,供试广东桑桑树种质材料的亲缘关系与地理分布、花性等存在关联。     

贵州修文猕猴桃溃疡病菌遗传多样性分析

采用16S rDNA序列分析及ERIC-PCR对从贵州修文贵长猕猴桃枝条、叶片、花蕾分离到的35株猕猴桃溃疡病菌进行遗传多样性分析。通过16S rDNA序列分析,鉴定所分离的病原菌为Pseudomonas syringae pv.actinidiae,并运用ERIC-PCR分析病菌群体的遗传多样性分析,相似系数为0.808时,35株菌株分为4个类群,85.7%的菌株属于第一个类群,且菌株无明显的采集地、采集部位的聚类;表明修文猕猴桃溃疡病菌具有丰富的遗传多样性;此研究为溃疡病的检测、防治提供科学依据。     

桑褐斑病病原菌的分离及以离体叶片接种测定致病性的方法

桑褐斑病是桑树的主要真菌病害,病原为桑粘格孢菌(Septogleum mori Bri et Cav)。分别采用4种方法从发病桑树分离桑褐斑病病原真菌,并以离体叶片接种法测定分离菌株的致病性,比较不同浓度菌液和不同接种方式对离体桑树叶片感染率的影响及观察病斑数随接种时间的变化情况,筛选简便、有效的病原菌分离与致病性鉴定方法。除组织块分离法外,采用分生孢子团块分离法、单孢分离法和改良稀释单孢分离法均可分离得到纯的病原菌株。离体桑树叶片以不同浓度菌液和不同接种方式接种病原菌后,其病斑数以及病情指数差异显著,病原菌以菌落悬浮液涂抹法和孢子悬浮液喷雾法接种均可有效感染离体桑树叶片,其中菌落悬浮液涂抹法处理叶片的病斑数和病情指数最高,分别为108.83和60.00;用于接种的病原菌分生孢子浓度为1×105~5×105m L-1有利于离体桑树叶片感染致病;随着接种病原菌后的时间延长,发病桑树叶片的病斑数逐渐增加。上述对桑褐斑病病原菌的分离及菌株致病性测定方法,可为桑褐斑病病原菌株的致病性分化研究和桑树种质资源的抗病性评价提供参考。     

云南桑树褐斑病的发生与防控

蚕桑产业是云南农业产业化主导产业之一,发展势头强劲、市场潜力大,云南现成为全国栽桑养蚕第三大省份。然而,桑树病害的发生成为影响蚕桑产业稳定发展的重要因素,其中以桑褐斑病最为严重。桑褐斑病是云南桑树最重要的叶部病害,由桑褐斑壳丰孢[Phloeospora maculans (Bereng.) Allesch]感染引起,发病率高,危害严重,严重影响蚕桑生产发展。国内外学者对桑褐斑病的研究主要集中于桑褐斑病的分布、危害、病原、症状、传播途径、发病条件及防治方法等方面。本文从以上几个方面进行综述,以期为桑褐斑病更深入的研究及防治提供参考。     

扁蓿豆遗传多样性的SSR分析

应用SSR分子标记对内蒙古野生扁蓿豆4个地理种群进行了遗传多样性研究.结果表明,扁蓿豆具有较高的遗传多样性,12对引物共扩增出66个位点;物种水平上Nei's基因多样性指数为0.2222,Shannon多样性指数为0.3639,种内总基因多样性为0.2223;种群内基因多样性为0.2153,96.88%的遗传变异存在于种群内,3.12%的遗传变异存在于种群间;种群间的遗传分化系数为0.0312,基因流为15.5256;4个种群间有一定遗传分化,但遗传漂变不会引起遗传分化.UPGMA遗传距离聚类结果表明,生态地理条件相似的种群优先聚集.     

西北不同地理种群红色型豌豆蚜的遗传多样性

为探讨西北地区红色型豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum(Harris)(Pink form)) 不同地理种群的遗传结构,了解其遗传多样性,采用微卫星技术(simple sequence repeat,SSR),用15对引物,对5个地理种群进行了测定和聚类分析.结果表明:共检测出46个多态性位点、多态性条带百分率(PPB)为100％、等位基因数1.7391、有效等位基因数1.33380基因多样性指数(Nei's)在0.1488～0.3132之间,其中新疆呼图壁种群的多样性最高.Shannon信息指数(I)为0.3256、多态位点百分率73.91％.种群基因分化系数Gst为0.3198,表明种群间遗传分化程度较大.AMOVA分析表明,种群间变异占39％,种群内变异占61％.聚类分析表明在相似系数为0.56时,固原、民和、兰州、临夏的种群聚为一类,呼图壁种群独自聚为一类.     

扁蓿豆遗传多样性的SSR分析

应用SSR分子标记对内蒙古野生扁蓿豆4个地理种群进行了遗传多样性研究。结果表明,扁蓿豆具有较高的遗传多样性,12对引物共扩增出66个位点;物种水平上Nei＇s基因多样性指数为0．2222,Shannon多样性指数为0．3639,种内总基因多样性为0．2223;种群内基因多样性为0．2153,96．88％的遗传变异存在于种群内,3．12％的遗传变异存在于种群间;种群间的遗传分化系数为0．0312,基因流为15．5256;4个种群间有一定遗传分化,但遗传漂变不会引起遗传分化。UPGMA遗传距离聚类结果表明,生态地理条件相似的种群优先聚集。     

裸果木种群遗传多样性特点及与地理气候因子关联研究

本文利用ISSR标记技术,选取15对引物,对分布于西北荒漠区12个裸果木种群的遗传多样性以及与地理气候因子的相关性进行了分析。结果表明：群体内多态性位点百分率（PPL）为88.81%,种群水平为69.93%;Nei’s基因多样性指数（He）变化范围为0.2356~0.2697,Shannom信息指数（I）变化范围为0.3509~0.4057,具较高的遗传多样性水平。基因分化系数（Gst）为0.2790,种群间遗传分化较小,种群内存有丰富的遗传变异。经Mantel检验,种群遗传距离与地理距离有相关性（R²=0.2144）。利用NTSYSpc-2.1软件进行UPGMA法聚类,各种群样品间的遗传相似系数在0.81～0.99之间,按照遗传距离远近,裸果木12个种群可分为4大类群。经相关性分析,种群遗传多样性与纬度、海拔存在正相关（P<0.05）与年均温存在负相关（P<0.05）。     

基于微卫星标记的中国斑翅山鹑遗传多样性及遗传结构分析

斑翅山鹑(Perdix dauuricae)是具有很高经济价值的猎用禽.为了获得其群体遗传多样性及遗传变异信息,为我国斑翅山鹑进一步有效保护和合理利用提供科学依据,本研究共采用了8个微卫星标记位点对分布于我国北方的斑翅山鹑23个地理种群285个个体进行了群体遗传多样性及遗传结构分析.结果表明,我国斑翅山鹑为遗传多样性较丰富的群体,且每一群体均表现出较高的遗传多样性,其中柴达木盆地地区的种群拥有最高的遗传多样性.遗传分化分析显示组间及组内种群间均表现为遗传分化显著,遗传分化系数(FST)值表明大部分种群间表现出显著的遗传分化.系统树构建和贝叶斯聚类分析结果均显示斑翅山鹑23个地理种群被分化为明显的两个组群.另外,通过BOTTLENECK对各地理种群的分析显示斑翅山鹁种群曾经历过近期瓶颈效应.本研究结果表明,柴达木盆地地区种群、华北平原地区种群、静宁种群、张家川种群以及六盘山地区种群应予以相应关注,以保证有足够的种群大小来保持这些种群的遗传多样性.     

能源草芦竹遗传多样性的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术,对我国6省11个芦竹种群共89个个体的遗传多样性水平和遗传结构进行了研究。从UBC801~900中筛选出7个有效引物,共扩增出40个位点,其中多态性位点为38个。PCR产物的分子量为100~2 000 bp。在物种水平上,Shannon多样性指数为0.494,Nei指数为0.329,遗传分化系数G_st为0.826,平均基因流N_m为0.097。种群内的平均遗传多样度H_s为0.040。表明芦竹在物种水平上具有较高的遗传多样性而种群内的分化极小。UPGMA法聚类结果表明, 芦竹11个种群分为3个类群:浙江和江苏的芦竹聚为一簇,湖南、贵州和广西的芦竹聚为一簇,云南种群单独为一支。不同种群芦竹亲缘关系的远近与它们的地理距离有一定的关系,但不完全一致。     

四川白三叶根瘤菌SRAP遗传多样性分析

利用SRAP分子标记对来自四川省雅安、康定、泸定、西昌、成都和乐山6个地区的71份白三叶根瘤菌株的遗传多样性和遗传关系进行分析,结果表明:(1)23对引物组合共扩增出292条带,其中多态性条带279条,多态位点百分率95.55%;(2)单引物组合平均多态信息量(PIC)为0.341,条带信息指数(BI)为0.429,分辨力(RP)为6.226,标记指数(MI)为4.507;(3)供试菌株间遗传相似系数(GS)值介于0.493~0.962之间,平均为0.673;(4)采用UPGMA聚类方法,在GS=0.59时71份供试根瘤菌株可划分为3个组,地理来源相同或相似的菌株聚类结果相对集中;(5)方差分析(AMOVA)显示,在总的遗传变异中有85.05%发生在地理类群内,14.95%发生在地理类群间,均表现为极显著(P0.001)。表明SRAP标记对白三叶根瘤菌遗传变异的鉴别能力具有一定的可行性,是分析其遗传多样性的有效手段;供试白三叶根瘤菌株具有丰富的遗传多样性,且在分子水平上具有较远的亲缘关系;同时也揭示了不同地理环境根瘤菌株的遗传变异与其地域分布具有一定的相关性。