牛精子染色体制备及影响因素探讨

用去透明带金黄地鼠卵异种体外受精技术制备了牛精子单倍染色体。冻精复苏、洗涤、获能用 Ｈａｍ  Ｆ１０ 和 Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ１６４０ 为主的混合培养基，辅以亚牛磺酸、肾上腺素，１０ μｍ ｏｌ／ Ｌ 钙离子载体（ Ｉ Ａ）处理牛精子 １２～１５ ｍ ｉｎ，诱导获能。异合卵用 Ｔ Ｃ１９９ 培养，以鬼臼毒素和长春花碱阻断原核融合和纺锤体形成，其浓度为常规浓度的 ２ 倍，在第 １ 次卵裂中期制备染色体。结果显示穿卵率达 ８３８％ ，可分析精子染色体核型成功率为 ４２４％ 。认为这是一种有效制备牛精子染色体的方法，并对其影响因素进行了探讨。     

诱导牛精子体外获能方法的研究

用去透明带的金黄地鼠卵异种精子体外穿透试验,检测冻精复苏,经各种处理后的精子穿卵率,结果表明,B0培养基,经咖啡因2mmol/L,肝素50μg/ml处理,并添加亚牛磺酸70μmol/L和透明质酸酶1g/L,是诱导牛精子体外获能的有效方法。     

添加咖啡因、亚牛磺酸对牛精子功能的影响

为研究获能液中添加咖啡因和亚牛磺酸对牛精子功能的影响,本研究将荷斯坦牛冻精解冻后分别添加在含不同浓度咖啡因(0、2.5、5.0、7.5mmol/L)或亚牛磺酸(0、5、10、20、40μmol/L)的获能处理液中,且每个处理组加入约200μL的精液,在CO_2培养箱里经上游处理45min,以评估咖啡因和亚牛磺酸对牛精子活力、顶体及质膜完整性的影响,进而探讨在获能液中亚牛磺酸替代咖啡因的效果。结果显示,添加2.5、5.0mmol/L咖啡因组经上游法获能处理后的牛精子活力和顶体完整率均显著高于对照组(P0.05),且2.5mmol/L咖啡因组精子活力最高;添加10、20μmol/L亚牛磺酸组经上游法获能处理后的牛精子活力、顶体完整率和质膜完整率均显著高于对照组(P0.05),且20μmol/L亚牛磺酸组的精子功能参数值最高;将筛选的最佳浓度2.5 mmol/L咖啡因和20μmol/L亚牛磺酸采用同样的方法处理,发现20μmol/L亚牛磺酸组的精子顶体完整率和质膜完整率均显著高于2.5mmol/L咖啡因组和对照组(P0.05)。因此,20μmol/L亚牛磺酸可以替代2.5mmol/L咖啡因用于体外受精体系中的精子获能处理,有助于提高精子功能参数。     

添加咖啡因、亚牛磺酸对牛精子功能的影响

为研究获能液中添加咖啡因和亚牛磺酸对牛精子功能的影响,本研究将荷斯坦牛冻精解冻后分别添加在含不同浓度咖啡因（0、2.5、5.0、7.5 mmol/L）或亚牛磺酸（0、5、10、20、40 μmol/L）的获能处理液中,且每个处理组加入约200 μL的精液,在CO₂培养箱里经上游处理45 min,以评估咖啡因和亚牛磺酸对牛精子活力、顶体及质膜完整性的影响,进而探讨在获能液中亚牛磺酸替代咖啡因的效果。结果显示,添加2.5、5.0 mmol/L咖啡因组经上游法获能处理后的牛精子活力和顶体完整率均显著高于对照组（P<0.05）,且2.5 mmol/L咖啡因组精子活力最高;添加10、20 μmol/L亚牛磺酸组经上游法获能处理后的牛精子活力、顶体完整率和质膜完整率均显著高于对照组（P<0.05）,且20 μmol/L亚牛磺酸组的精子功能参数值最高;将筛选的最佳浓度2.5 mmol/L咖啡因和20 μmol/L亚牛磺酸采用同样的方法处理,发现20 μmol/L亚牛磺酸组的精子顶体完整率和质膜完整率均显著高于2.5 mmol/L咖啡因组和对照组（P<0.05）。因此,20 μmol/L亚牛磺酸可以替代2.5 mmol/L咖啡因用于体外受精体系中的精子获能处理,有助于提高精子功能参数。     

金黄地鼠体外受精的初步研究

实验用ＴＹＨ、Ｔ６两种培养液做为精子获能培养液和受精培养液进行了金黄地鼠的体外受精。用经获能培养的精子分别与具卵丘和去卵丘的卵子进行受精培养。结果在ＴＹＨ中分别得到了２７．５％和３３．３％的受精率。在Ｔ６中得到了４７．２％和２６．３％的受精率；用未经获能培养的精子分别与具卵丘和不具卵丘卵子进行受精培养，结果在ＴＹＨ中得到了４１．８％和７．１％的受精，在Ｔ６中得到了４８．５％和５７．７％的受精率。实验结果说明：（１）适用于小鼠体外受精的培养液Ｔ６和ＴＹＨ并不适合于金黄地鼠，其主要原因是不能使精子有效获能；（２）卵丘细胞的存在有使受精率提高的趋势；（３）来自不同公鼠的精子的受精能力差异很大，进行体外受精时必须严格挑选公鼠     

γ-氨基丁酸等药物对日本血吸虫运动性的影响

采用肉眼观察法测定有关药物对日本血吸虫运动性的影响。结果表明：（１）１０－３,１０－４,１０－５ｍｏｌ／Ｌγ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）均有兴奋虫体的作用,其兴奋性随浓度递增而增强;（２）用１０－３、１０－４ｍｏｌ／Ｌ巴氯酚（ｂａｃｌｏｆｅｎ）、毕扣扣林（ｂｉｃｕｃｕｌｉｎｅ）和印防己毒素（ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ）作用虫体后,巴氯酚、毕扣扣林在浓度为１０－３ｍｏｌ／Ｌ时对虫体有明显抑制作用,浓度为１０－４ｍｏｌ／Ｌ时抑制作用不明显;而１０－３、１０－４ｍｏｌ／Ｌ印防己毒素均表现一定的兴奋作用;（３）先用１０－３ｍｏｌ／ＬＧＡＢＡ兴奋虫体后,再加入上述药物,结果仍是相同。表明一定浓度的巴氯酚,毕扣扣林不仅对内源性的ＧＡＢＡ有拮抗作用,而且对外源性的ＧＡＢＡ有拮抗性;而印防己毒素不仅无拮抗性,还有协同ＧＡＢＡ的兴奋作用。初步判定,ＧＡＢＡ为日本血吸虫的一种兴奋性神经递质,有别于其它寄生虫（如曼氏血吸虫和鸡蛔虫）。     

肝素和钙离子载体诱导波尔山羊精子体外获能和体外受精

运用肝素、钙离子载体（IA）协同咖啡因诱导波尔山羊精子体外获能，利用去透明带金黄地鼠卵穿透试验检测了精子的获能效果。结果发现：精卵孵育4h和6h时的穿透率均高于2h时的穿透率；肝素和钙离子载体对精子获能有明显的促进作用，与未添加组相比差异极显著（P〈0．01）；20mg／L和50mg／L的肝素剂量组，去透明带金黄地鼠卵穿透率为64．7％、68．4％；钙离子载体的添加剂量在0．3μmol／L时，穿透率达到68．2％；咖啡因与肝素、钙离子载体具有明显的协同作用。将获能的精子与山羊卵母细胞进行体外受精孵育17h，也获得了60％以上的受精率。     

钙通道阻断剂对豚鼠精子顶体反应的影响

电压依赖性Ｃａ２＋通道阻断剂ｖｅｒａｐａｍｉｌ、ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ、ｄｉｌｔｉａｚｅｍ和Ｄ６００等，对非同步培养系统中的获能早期豚鼠精子和同步培养系统已获能豚鼠精子的顶体反应，均呈显著的促进作用，但对同步培养系统未获能豚鼠精子的顶体反应无显著影响。在碱性条件下，Ｋ＋浓度在１０～６０ｍｍｏｌ／Ｌ范围内对精子顶体反应无显著影响。Ｌａ３＋在５０～２００μｍｏｌ／Ｌ浓度可完全抑制Ｃａ２＋诱导的已获能精子的顶体反应     

牛卵泡卵母细胞冷冻保存后发育潜力的研究

对用３种不同方法（Ａ法：１．０ｍｏｌ／Ｌ甘油平衡，从２０℃开始以１℃／ｍｉｎ的速度降至－℃，植冰，１０ｍｉｎ后以０．３℃／ｍｉｎ降至－３０℃，再以０．１℃／ｍｉｎ降至－３３℃，投入液氮；Ｂ法：１．６ｍｏｌ／Ｌ丙二醇＋０．ｌｍｏ１／Ｌ蔗糖平衡，５℃冰箱中保存１５ｍｉｎ，从Ｏ℃开始按Ａ法中的程序降温；Ｃ法：即玻璃化法）冷冻保存的牛ＧＶ期卵母细胞的发育潜力进行了研究。解冻后，Ｃ组卵母细胞形态正常率显著高于Ａ、Ｂ两组。３种方法冷冻的卵母细胞成熟培养后，平均卵丘扩展率为６０％，其中Ｃ组最高（６９．９％）。卵丘扩展的卵母细胞中，７９．３％发生ＧＶＢＤ，但大多数没有达到ＭＩ期。３组冷冻卵母细胞的体外成熟率、体外受精率分别为１４．２％、８．３％、２０．０％和１０．０％、７．１％、１２．１％，其中Ａ组中有１枚卵裂。     

以MTT比色法检测鸡脾淋巴细胞转化效果

本研究运用ＭＴＴ比色法以正交试验对鸡脾脏淋巴细胞转化的最佳条件（ｃｏｎＡ量、血清种类和浓度）进行了研究。结果表明，无论血清种类和浓度如何，低剂量ＣｏｎＡ（２．５～１０μｇ／ｍｌ）可以获得较好的转化效果。当ＣｏｎＡ的量确定时，低浓度鸡血清（０．５％～１．２５％）的转化效果优于高浓度（２％～３％）：５％犊牛血清优于任何浓度的鸡血清；无血清培养基优于血清培养基。其最佳组合为无血清ＲＰＭＩ１６４０培养基加ＣｏｎＡ２．５μｇ／ｍｌ。