无乳链球菌GD201008-001二元调控系统RscSR的鉴定及其对细菌应激适应性和毒力特性的影响

为鉴定鱼源无乳链球菌GD201008-001二元调控系统(two-component system, TCS)RscSR并探究其功能,实验利用生物信息学方法预测到可能的RscSR,对其组成成分RscS和RscR的三维结构和保守结构域进行分析;构建基因缺失株ΔrscSR与互补株CΔrscSR,测定细菌的生长曲线,检测其耐酸应激、耐氧化应激、抗巨噬细胞吞噬和胞内存活能力,同时测定其对巨噬细胞的毒性和对小鼠的毒力。结果显示,RscSR具有典型的TCS结构特点,其中RscS具有组氨酸激酶结构域,RscR具有反应调节子结构;其编码基因缺失后,菌株耐酸、耐氧化、抗巨噬细胞吞噬和胞内存活能力及对巨噬细胞毒性均显著降低,而将该基因回补后各项能力均有所恢复;动物实验结果显示,野生株感染小鼠19 h内全部死亡,而ΔrscSR缺失株感染小鼠全部死亡时间为48 h。研究表明,RscSR在无乳链球菌应激适应性以及毒力方面发挥重要作用。     

鲁氏耶尔森菌invF基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性

鲁氏耶尔森菌是一种具有广泛致病性的条件致病肠杆菌。三型分泌系统(T3SS)是该菌的重要毒力系统,其中invF基因是T3SS功能表达的重要调控因子。为探讨invF和T3SS对Y.ruckeri致病作用的影响,本研究构建了Y.ruckeri SC09株invF基因的无痕缺失株,并对其生物学特性进行研究。通过融合PCR方法,将invF基因的上、下游片段A、C融合,构建同源臂AC;将获得的同源臂AC连接入自杀质粒pLP12,构建pLP12-invF同源重组载体;pLP12-invF电转化进入供体菌株大肠杆菌β2163,并利用接合转移方法转入受体菌株Y.ruckeri SC09,利用抗生素正向筛选和vmt反向筛选分别对插入突变株和缺失突变株进行筛选,并利用PCR技术和序列测定对Y.ruckeri invF缺失株进行鉴定;对突变株和野生株进行菌体菌落形态观察、生化特性鉴定和生长曲线测定。结果显示,融合PCR、AC片段经氯霉素抗性正向筛选和vmt反向筛选,PCR鉴定和测序鉴定后,成功获得了Y.ruckeri SC09 invF基因的无痕缺失突变株,突变株和野生株菌体菌落形态和生化特性基本一致,突变株菌落较野生株小,各个时期突变株的生长浓度较野生株低。研究表明,采用自杀质粒pLP12和大肠杆菌β2163接合转移系统,利用抗生素正向筛选和vmt反向筛选技术,在对其基本生物学特性无显著影响的情况下,可简捷高效地获得invF基因的无痕缺失突变株。     

网箱养殖大黄鱼内脏白点病病原菌分离鉴定及致病性研究

为探究宁德市网箱养殖大黄鱼内脏白点病及其病原菌的致病性,通过宏基因组分析及对比,初步判定内脏白点病病原菌为假单胞菌属细菌.将分离纯化后的菌株ND2018对健康大黄鱼进行腹腔注射回归感染试验,证实菌株ND2018为大黄鱼内脏白点病病原菌.结合菌株ND2018的全基因测序结果,最终确定菌株ND2018为变形假单胞菌.试验结...     

迟缓爱德华氏菌对大菱鲆巨噬细胞相关生物效应分子产生的影响

作为兼性胞内寄生菌,迟缓爱德华氏菌能够在鱼类巨噬细胞内存活繁殖。巨噬细胞与迟缓爱德华氏菌的相互作用是迟缓爱德华氏菌致病的重要环节。探讨不同毒力迟缓爱德华氏菌对巨噬细胞相关生物效应分子产生的影响,将为明晰该菌的致病机理和胞内寄生机制奠定基础。用31%/45% Percoll密度梯度离心分离大菱鲆头肾巨噬细胞,在L-15细胞培养基上20℃培养24h,Giemsa染色显示培养的细胞符合巨噬细胞典型的形态特点;体外培养的巨噬细胞以感染复数50∶1进行迟缓爱德华氏菌的侵染试验。采用比色法,荧光探针DCFH-DA和Griess法动态分析不同毒力迟缓爱德华氏菌感染对巨噬细胞Caspase-3活性、活性氧和一氧化氮分泌的影响。试验结果表明,迟缓爱德华氏菌感染的巨噬细胞能够检测到较高的Caspase-3活性,明显的活性氧和一氧化氮的分泌(P0.05),但强毒株能够显著抑制巨噬细胞Caspase-3的活性(P0.05);同时,与弱毒株相比,强毒株也表现出对巨噬细胞分泌活性氧和一氧化氮明显的抑制作用(P0.05)。研究结果提示,迟缓爱德华氏菌可能通过抑制巨噬细胞凋亡,减少活化巨噬细胞产生活性氧和一氧化氮等杀菌效应分子来达到其胞内寄生和繁殖的目的。     

大黄鱼致病嗜水气单胞菌的分离鉴定及其多克隆抗体制备

为探究引起网箱养殖大黄鱼肠炎病的病原及其特性,自患病大黄鱼肝脏组织分离到1株优势菌NDLc-P,经回归感染试验确认该菌为大黄鱼致病菌.人工感染7 d后,该菌对体质量(46.4±3.5)g的健康大黄鱼的半数致死密度为3.98×107 cf u/m L,表明该菌株对大黄鱼有一定的致病性.利用梅里埃微量多项鉴定系统对病原菌N...     

福州地区大黄鱼变形假单胞菌的分离与鉴定

为研究2013年春夏之际罗源湾海区网箱养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏出现白点症状的病原,从具有临床症状的大黄鱼内脏中分离到优势菌,经回接感染试验证实该菌为病原菌;分析该病原菌的形态特征、理化特性、分类地位及药物敏感性等特性,结合16S r DNA序列构建的进化树与假单胞菌属恶臭群中的变形假单胞菌同源性最高,在99%以上,并通过看家基因gyr B序列分析进一步验证该菌为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida);该菌对强力霉素、诺氟沙星、恩诺沙星3种抗生素敏感,对奥氟沙星、左氟沙星、四环素3种抗生素中度敏感。     

黄颡鱼甘露糖受体基因的克隆和功能分析

甘露糖受体(MR)隶属凝集素超家族,主要表达于巨噬细胞和未成熟的树突状细胞表面。MR不仅在先天免疫防御中发挥重要作用,还通过参与抗原呈递,激活T淋巴细胞,启动获得性免疫应答过程。本研究采用同源克隆技术获得黄颡鱼甘露糖受体(pf MR)基因,采用荧光定量PCR技术检测MR在正常黄颡鱼体内的分布情况,采用鲖爱德华菌感染黄颡鱼头肾巨噬细胞和甘露聚糖封闭MR方法研究黄颡鱼MR在抗细菌感染中的作用。结果显示,pf MR同团头鲂、草鱼、斑马鱼和尼罗罗非鱼的MR聚为一支。pf MR在所检测的12个组织中均有分布,其在肾脏、脾脏和肌肉组织中表达量较高,在血液中表达量较少。鲖爱德华菌感染黄颡鱼头肾巨噬细胞后,pf MR、IL-1β和TNF-a均被细菌诱导表达,超氧阴离子和一氧化氮的含量也上升,超氧阴离子在感染30 min后即显著上升,一氧化氮在感染12 h后才显著上升。甘露聚糖竞争结合MR,显著抑制巨噬细胞内化GFP标签的鲖爱德华菌,加入EDTA减少内化的荧光强度,加入Ca~(2+)使内化的荧光强度回升。研究表明,黄颡鱼头肾巨噬细胞MR参与鲖爱德华菌的识别和内吞过程,而且依赖Ca~(2+)。     

转座子mini-Tn10介导的运动突变对溶藻弧菌毒力的影响

采用转座子mini-Tn10/Km构建了致病性溶藻弧菌的突变库,采用半固体双层平板初筛到73株运动缺陷突变株,初筛的突变株纯化及重复筛选后获得运动性缺陷表型稳定的突变株ND-01MM,Southern鉴定确定其为单位点插入。野生型菌株ND-01和运动缺陷突变株ND-01MM对致病性溶藻弧菌的天然宿主大黄鱼粘液的趋化、粘附以及在大黄鱼吞噬细胞内存活能力等生理功能的比较研究发现,溶藻弧菌运动缺陷后趋化及粘附能力均极显著下降(P<0.01),但在吞噬细胞内的存活能力则与野生型菌株差异不显著(P>0.05)。采用腹腔注射和浸泡两种方式感染大黄鱼,结果发现运动缺陷对浸泡感染的影响较为明显,但对腹腔注射的感染方式影响不大。     

溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗的构建及其免疫效果评价

为了研究溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗对鱼体的免疫保护作用,本研究采用Overlap PCR和同源重组技术,构建了kdpD/kdpE（kdpDE）基因无标记基因框内敲除突变株。对野生株和缺失突变株的生物学特性及致病性进行了比较研究,发现kdpDE的缺失对溶藻弧菌的生长速率和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力、生物被膜形成能力较野生株下降。斑马鱼致病性实验结果显示,突变株毒力下降78.5倍,表明减毒株构建成功,可以作为减毒活疫苗的候选菌株。突变株在鱼体内存活能力实验结果显示,注射免疫7 d后,鱼体内不能检测到该菌。以突变株ΔkdpDE为抗原,分别用注射和浸泡的方式免疫斑马鱼,免疫后第28天用溶藻弧菌和哈维氏弧菌攻毒,评估该减毒活疫苗及不同免疫方式对斑马鱼的保护效果。实验结果表明,免疫后的斑马鱼能够抵抗溶藻弧菌的感染,其中注射免疫组的免疫保护率达83.3%,浸泡免疫组次之（66.7%）;同时,该减毒活疫苗能刺激斑马鱼对哈维氏弧菌产生交叉保护效应,其中注射免疫组的免疫保护率为65.5%,浸泡免疫组为55.2%。以上结果表明,kdpDE基因敲除突变株可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的候选减毒活疫苗。     

养殖大黄鱼“白鳃病”一种新病毒病原的初步研究

运用组织病理学、电镜观察及PCR扩增等方法对近年来网箱养殖大黄鱼暴发的"白鳃病"进行了研究,以探讨引起养殖大黄鱼"白鳃"关联病毒的致病机理。临床解剖观察显示:患"白鳃病"的鱼表现出极度的贫血症状、鳃丝苍白色、血液稀薄且血细胞数显著减少;内脏组织病理观察结果显示:鱼的肝、脾、肾脏内脏组织发生严重的病理变化,组织内红细胞发生明显的退行性变化,同时鱼体的红细胞数量显著减少;采用针对真鲷虹彩病毒(red sea bream iridoviral virus,RSIV)的引物对病鱼内脏组织核酸样本进行PCR检测,结果显示,患"白鳃病"病鱼样本RSIV核酸呈阴性;组织超薄切片电镜观察结果显示:在患"白鳃病"病鱼脾脏和肾脏组织细胞的胞质中可见直径约40~45 nm的病毒粒子。由此初步判断,浙江地区网箱养殖大黄鱼的"白鳃病"不是由RSIV导致,而与一种直径为45~50 nm的病毒有直接关联,本研究为大黄鱼疾病的诊断与防治提供了参考依据。     

1株大黄鱼源肺炎克雷伯菌的分离鉴定与致病性分析

近年来由肺炎克雷伯菌感染水产动物引发的病害频繁发生,严重阻碍了水产养殖业的健康发展。采用细菌分离培养和形态学观察手段自人工饲养发病的大黄鱼肝脏内分离到1株疑似致病菌KPLYC2,并进行鉴定,通过回归感染试验发现,分离株KPLYC2可引起与自然发病大黄鱼相似的症状及致其死亡,分离株KPLYC2对大黄鱼的半数致死密度为6.8×10⁶ cfu/mL,而且可引起大黄鱼的肝脏、肾脏和脾脏发生明显组织病理性损伤。分离株KPLYC2还可感染小鼠引发全身多系统性病理损伤。经过生理生化特征检测及16S rRNA序列分析和构建进化树发现,分离株KPLYC2与肺炎克雷伯菌的基因相似度超过99%,因此将分离株KPLYC2鉴定为肺炎克雷伯菌。药敏试验结果显示,肺炎克雷伯菌KPLYC2对氨苄西林、青霉素G和四环素等不敏感。笔者首次自大黄鱼体内分离出1株肺炎克雷伯菌并研究其致病性和耐药性,获得的数据将对该病的防控提供参考和依据。     

抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体的制备及特性分析

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要致病菌,为制备能识别杀香鱼假单胞菌的特异性抗体,采用固相化抗原筛选方法,以杀香鱼假单胞菌重组溶血素共调节蛋白为抗原,从兔天然噬菌体scFv文库中筛选出特异性的单链抗体(scFv);通过构建含有针对杀香鱼假单胞菌单链抗体(scFv)的重组质粒,对筛选出的scFv进行原核诱导表达。通过4轮淘选,共获得16株针对杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白的单链抗体(scFv),通过亲和力分析,最终筛选出7株特异性较高的单链抗体(scFv)进行原核表达;成功构建了含有抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节单链抗体(scFv)的重组质粒pET-30a-Hcp-scFv,转化到大肠杆菌表达菌株中,其中6个重组质粒可稳定表达,经过蛋白质可溶性分析和Western Blot鉴定,目的蛋白主要以包涵体的形式存在。研究结果为快速制备大量抗杀香鱼假单胞菌抗体提供了一种简便的方法,为今后大黄鱼内脏白点病的临床快速诊断奠定了基础。     

植物精油对冷藏大黄鱼优势腐败菌的抑制作用及其机制

为探讨天然植物精油对冷藏大黄鱼贮藏过程中优势腐败菌的抑制作用及其机制,实验首先对冷藏大黄鱼的优势腐败菌进行分离纯化,并通过16S r DNA序列分析及生理生化实验进行菌株鉴定;采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法检测14种植物精油或其组分对腐败菌株的抑菌活性;在阐明植物精油抗菌活性的基础上,再对植物精油处理后的大黄鱼气味进行感官可接受度检验,以筛选出具有高效抗菌活性和良好感官接受性的精油保鲜剂;实验通过细菌形态扫描电镜观察、胞内乳酸脱氢酶及核酸释放研究山苍子精油对不同腐败菌株的膜损伤作用,以初步阐明其抗菌机制;最后,通过检测微生物数量、产硫菌数量、挥发性盐基氮(TVB-N)及组胺含量变化来考察山苍子精油对冷藏大黄鱼潜在的保鲜效果;从冷藏大黄鱼中分离得到6株优势腐败菌,分别为腐败希瓦氏菌4株,热杀索丝菌1株,温和气单胞菌1株;14种植物精油对腐败菌株具有不同抑制活性,其中肉桂醛抑菌活性最强,最低抑菌浓度为0.125μL/mL,其次为丁香酚、百里香酚、柠檬醛、柠檬草及山苍子精油,最低抑菌浓度均≤0.5μL/mL;丁香酚、百里香酚、柠檬醛、柠檬草及山苍子精油使用后未导致大黄鱼气味的感官劣化,且可矫正大黄鱼肉的腥味;山苍子精油可破坏腐败菌株的细胞膜,并导致胞内蛋白酶和核酸外泄。经4μL/mL山苍子精油处理后,冷藏过程中大黄鱼片的菌落总数、产硫菌数、TVB-N及组胺含量显著降低。研究表明,肉桂醛、丁香酚、百里香酚、柠檬醛、柠檬草及山苍子精油对大黄鱼特定腐败菌具有显著抑制作用,芳香酚和富含柠檬醛的精油使用后不影响大黄鱼的感官接受性,有望作为天然保鲜剂用于冷藏海产品的保鲜。     

刺激隐核虫感染对大黄鱼生理生化指标及免疫指标的影响

刺激隐核虫感染能够导致海水鱼类感染“白点病”,而大黄鱼是受“白点病”影响最严重的海水养殖鱼类。为了探究刺激隐核虫感染对大黄鱼生理生化指标及免疫指标的影响,本研究利用刺激隐核虫人工感染大黄鱼,分别在感染后0、12、24、48和72 h采集血液、肝脏、脾脏、肠、鳃、头肾和皮肤组织,并检测血清皮质酮、皮质醇以及肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量等指标的变化。同时使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验检测肝脏、脾脏、肠、鳃、头肾和皮肤组织中TNF-α、IL-8和IL-1β基因的表达量。结果显示,在大黄鱼感染刺激隐核虫后的0~72 h内,实验组大黄鱼表现出刺激隐核虫病的发病症状;血清皮质醇和皮质酮含量显著增加;肝脏GSH-Px活性极显著降低;肝脏SOD活性极显著增加;肝脏MDA含量在0~12 h内急剧增加并达到峰值,随后含量缓慢降低;各组织中的TNF-α、IL-8和IL-1β的表达量均有不同程度的上调,在鳃、头肾、肝脏和皮肤中上调最为显著。研究表明,刺激隐核虫感染后有明显变化的皮质类激素含量和氧化应激指标能够反映大黄鱼的感染程度,有助于进一步辅助抗虫表型测量的优化。     

大黄鱼幼鱼虹彩病毒感染的电镜研究

目的:探索大黄鱼幼鱼夏季高温病流行的病毒性病原体。方法:应用电子显微镜观察大黄鱼幼鱼内脏组织超薄切片。结果:发现大黄鱼幼鱼脾脏细胞肿胀,细胞内存在大量虹彩病毒颗粒。病毒颗粒直径约120nm,呈六角形,有一层蛋白质外壳,核心为核酸。病毒感染主要位于细胞质内。结论:大黄鱼幼鱼脾细胞感染的病毒是虹彩病毒,虹彩病毒感染及环境因素可能是导致大黄鱼幼鱼夏季高温病暴发流行并致死的主要原因。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏白点病的组织病理和超微病理分析

利用组织切片及超薄切片电镜技术对患内脏白点病大黄鱼(Pseudosciaena crocea)的肝脏、脾脏和肾脏3种组织进行病理学分析,探讨该病的致病机理。结果显示,大黄鱼的临床症状为体表无明显病症,脾、肾、肝等内脏有大量白色结节;组织病理显示,肝、肾和脾是感染损伤的主要靶器官,出现组织变性坏死,空泡化严重,炎性细胞浸润;病变组织均出现病理性结节。超微病理显示,病鱼肝、肾、脾细胞超微结构受损严重,尤以线粒体和细胞核损伤明显。线粒体肿胀,嵴断裂消失,空泡化;细胞核核膜破裂,染色质浓缩边集;肾脏和脾脏均发现大量菌聚集成团的病原。研究表明,大黄鱼内脏白点病的组织细胞病理变化特征显示了病原菌的入侵和危害,造成鱼体生理代谢紊乱,免疫力和抵抗力下降,鱼体终因无法维持正常的生命活动而导致死亡。     

一株大黄鱼致病性溶藻弧菌的分离鉴定与毒力相关基因分析

2018年,宁德蕉城大湾渔排大黄鱼出现体表和鳍条溃疡、出血,鳃缺损等症状。为鉴定该菌株并评估其致病性,本研究从患病大黄鱼鳃部分离得到一株优势菌株,生理生化特征显示,该菌株可在TCBS培养基上生长,菌落颜色为黄色,为革兰阴性短杆菌,具有嗜盐性,生理生化指标与标准株17700一致。结合生理生化指标与16S rDNA分析,确定该菌为溶藻弧菌,命名为Val180620。攻毒结果显示,Val180620菌株对大黄鱼具有较强的致病力,在水温25℃腹腔注射感染时,对规格(20±2)g大黄鱼的LD_(50)为2.38×10~6 CFU。毒力相关基因分析结果表明,Val180620菌株携带有CollagenaseVA、ToxR、FlaA和TRH等毒力相关基因。此外,本研究未从菌株Val180620中检测出UreR基因,但菌株Val180620仍表现出较强的致病性,说明UreR不是决定溶藻弧菌毒力的主要因子。     

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种dly基因缺失株构建及其生物学特性研究

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae, PDD)是广泛分布于全球海洋环境中的一种致病菌。本研究以实验室保存的一株高致病性PDD菌株(PDD1608)作为对象,初步探究毒力基因dly对PDD菌株的生物学特性和致病力的影响。利用λRed重组技术成功构建毒力基因dly缺失株Δdly PDD1608::Cm,比较野生株和缺失株的生长、涌动性、药物敏感性、生理生化特性、生物被膜形成能力、菌株及胞外产物(extracellular products, ECP)的溶血性和磷脂酶活性等生物学特性。选用海水青鳉鱼(Oryzias melastigma)作为实验动物,通过人工感染实验测定野生株和缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性。结果显示,毒力基因dly缺失后导致PDD菌株生长变慢,涌动性、溶血性和磷脂酶活性均降低;野生株和缺失株的药物敏感性和生理生化特性未产生变化;与野生株相比,缺失株的生物被膜形成能力有显著差异(P<0.05);人工感染实验表明,缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性降低。毒力基因dly影响PDD菌株的生长、涌动性、溶血性和磷脂酶活性等多种生物学特性,并且与PDD菌株及其ECP的致病力强弱密切相关。     

cbpD基因对溶藻弧菌毒力及相关生物学特性的影响

为研究几丁质结合蛋白(Chitin-binding protein D,CbpD)对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力和相关生物学特性的影响,通过同源重组技术构建溶藻弧菌ZJ-T的cbpD基因缺失突变株ZJ-T-ΔcbpD,比较突变株与野生株对斑马鱼(Danio rerio)的毒性,以及毒力相关生理过程,包括生长能力、运动性、胞外蛋白酶分泌活性、溶血活性、抗生素敏感性、生物膜形成、过氧化氢(H₂O₂)和铜离子(Cu²⁺)抗性以及铁离子(Fe³⁺)吸收能力的差异。研究发现,cbpD缺失后,溶藻弧菌对斑马鱼的毒力显著减弱,且细菌游动能力、涌动能力和胞外蛋白酶活性均降低,突变株对Cu²⁺的抗性提高;cbpD的突变不影响溶藻弧菌在富营养培养基中的生长、生物膜的形成、溶血活性、对大部分抗生素敏感性、对H₂O₂的抗性和Fe³⁺的获取能力。结果表明,cbpD可能通过正调控溶藻弧菌的运动能力和胞外蛋白酶分泌...     

诺卡氏套餐治疗烂身,内脏白点(诺卡氏菌病)的使用心得

诺卡氏菌易引起加州鲈、乌鳢、大黄鱼、海鲈常发生的烂身、鳃、内脏白点,诺卡氏套餐专门针对此细菌引起的病害开发。近两年来,我国加州鲈、乌鳢、大黄鱼、海鲈养殖区的