流产布鲁氏菌ATP/GTP结合蛋白基因缺失株保护力及安全性研究

为筛选具有诊断标记的布鲁氏菌病疫苗菌株,本研究利用同源重组和负筛选技术,构建了流产布鲁氏菌株2 308的ATP/GTP结合蛋白基因缺失株BDA14,并通过菌落染色和凝集特性,培养传代,小鼠接种试验及怀孕羊攻毒试验对其生物学特性、安全性和免疫效果进行了研究.结果表明:1)缺失菌株BDA14为粗糙型菌株,体外培养传代表型不发生改变;2)缺失菌株BDA14在小鼠体内的毒力与亲本菌株2308相比显著降低,且不产生针对OPS(O-antigen)的抗体;3)缺失菌株BDA14可提供与疫苗株RB51相当的攻毒保护力;4)缺失菌株BDA14对怀孕靶动物的安全性显著提高,接种怀孕羊不引起流产.说明ATP/GTP结合蛋白基因缺失株BDA14作为安全、有效且能鉴别诊断的疫苗菌株有明显优势.     

两株益生菌的部分生物学特性研究

为了探明2株植物源芽孢杆菌K,F（暂定名）的抗逆性与抑菌特性,对其进行了耐酸,耐胆盐与抑菌试验。用pH 1.5、2.0、3.5的人工胃液模拟胃液环境;用0.3%胆盐及0.1%CuSO4.5H2O的人工肠液模拟肠液环境。分别测定K,F的培养上清与菌液抑制大肠杆菌的能力。采用传统的表型鉴定及生理生化鉴定方法及16SrDNA方法对K,F进行鉴定。结果：经过pH 1.5、2.0、3.5的胃液处理,K,F均有较高的存活率,随着pH的上升,存活率有上升的趋势;耐胆盐试验,处理组细菌存活率有所下降,但均高于90%;K的培养上清液和菌液对大肠杆菌的抑菌环直径为14.33,18.57 mm,F的为14.11,15.68 mm。所以人工胃液,人工肠液对K,F的活菌数几乎不产生影响。K,F的培养上清和菌液对大肠杆菌有很好的抑制作用。综合鉴定结果K为枯草芽孢杆菌,F为地衣芽孢杆菌。     

小麦赤霉病菌生物学特性研究

小麦赤霉病菌菌丝生长的最适温度为 2 5℃ ;湿度越大菌丝生长越快 ;2 4h黑暗或 12h黑暗 +12h光照较有利于菌丝生长。小麦赤霉病菌在小麦、燕麦、玉米、绿豆等煎汁中培养不产生分生孢子 ,在该试验选用的合成培养基中产孢且孢子量大 ;在各类预防性杀菌剂中 ,多菌灵效果最佳。     

猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

 【目的】探讨2003～2006年间支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）在中国湖北等十余省市猪群中的流行病学分布和协同感染特性并对部分菌株进行生物学特性研究。【方法】采用病原菌的形态学观察、生化鉴定和PCR鉴定,从2 057份有肺炎或萎缩性鼻炎症状猪的肺脏等病料组织中分离出190株Bb和不同数量的其它共感染菌。经生化鉴定,药敏试验、血凝试验及动物试验等方法进行检测和分析。【结果】在中国湖北等十余省市的猪群中,不同省份Bb的总分离率介于7.3%～14.1%之间;不同年份Bb的总分离率介于7.3%～11.8%之间;2003～2006年间的Bb总分离率为9.2%;Bb的分离率与猪日龄有一定的关系。Bb最常见的共感染菌依次是链球菌（55.9%）、副猪嗜血杆菌（50.0%）、大肠杆菌（43.1%）、巴氏杆菌（25.5%）、绿脓杆菌（17.6%）和沙门氏菌（11.8%）。在43份有典型萎缩性鼻炎症状猪的病料中,分离出22株Bb、7株产毒素巴氏杆菌和6株绿脓杆菌;在分离出产毒素巴氏杆菌的7份病料中均同时分离出了Bb,而其中6份又同时分离出了绿脓杆菌。对2003年分离的31株Bb进行药敏试验、红细胞凝集试验和乳鼠皮肤坏死试验。结果表明：各菌株对15种药物的耐药谱不同,但对卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素B、环丙沙星和舒普深高度敏感;各菌株均可凝集猪和羊的红细胞且能不同程度导致乳鼠皮肤坏死。【结论】在中国湖北等十余省市的猪群中,Bb与其它病原菌的共感染情况非常严重,且在萎缩性鼻炎的病猪中检出率最高。     

红托竹荪的生物学特性研究

对红托竹荪(Dictyophora rubrovalvata M.Zang)的生物学特性进行了研究,描述了子实体、双核菌丝和担孢子的形态及芽殖;证明了其能利用葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉等作碳源,能利用无机氮和有机氮作氮源。菌丝生长的最适碳氮比为30:1,最适温度为23～25℃,适宜的酸碱度为pH5.0～6.0,最适为pH5.5;菌丝生长的最适宜空气相对湿度为81％,最适宜的料水比为1:2.2,光照对菌丝生长具有抑制作用,且蓝光对生长抑制作用最大,橙光最小。菌丝在CO_2浓度为0.03～0.33％的范围内均能生长,以浓度0.13％时生长最好。菌丝体生长时分泌的纤维素酶的活力极弱,几乎不能崩解滤纸。喷施0.1％和0.5％的葡萄糖以及0.15％的亚油酸可促进子实体原基的形成。     

布鲁氏菌外膜脂蛋白OMP10基因的克隆表达、蛋白纯化及免疫原性研究

根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌OMP10序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增OMP10基因,将目的基因克隆入pEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a/OMP10,转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白pET-32a/OMP10,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白,并免疫小鼠。结果表明,成功构建了含OMP10的表达载体,经多次对表达条件的优化,获得了纯度较高的目的蛋白,为进一步动物免疫试验及研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。     

狗牙根的生物学特性及其防治研究

上海地区狗牙根自４月上旬始苗，４月中旬～５月达高峰，１１月后地上部分陆续枯死。地下根茎发芽温度在１０～４６℃，以３０～４０℃为适宜，土壤含水量为１５％～２０％、土深０～３ｃｍ时生长最快，耐旱、耐涝性强，对光有敏感性。可与麦轮作或用１５％稳杀得乳油于狗牙根株高０～５ｃｍ时进行化学防治，均能取得良好效果     

猪种布鲁氏菌2号苗在猪体上免疫实验的研究

猪种布鲁氏菌2号苗（S#-2）是中国兽药监察所培育出的一株弱毒疫苗株。目前在世界上还没有好的疫苗预防猪的布鲁氏菌病的情况下,应用S#-2进行了实验性研究。结果表明,给怀孕猪皮下接种500亿S#-2活菌,给性成熟公猪肌肉内接种700-1500亿活菌,分别在猪体内连续通过5代,毒力没有增强,也不会造成怀孕猪流产。怀孕猪免疫接种S#-2第70天,攻击强毒,在对照猪70-87.5%感染的情况下,免疫组80-90%猪获得保护。公猪皮下接种186亿活菌,经测定,S#-2在猪体内停留时间小于60天。猪皮下接种S#-2后有轻微全身反应,1-2天后恢复正常。口服S#-2几乎没有任何副作用。无论采用注射或口服途径给猪接种,大约在35天补体结合反应转阴而凝集反应仍为阳性,据此,可以对免疫猪和感染猪进行鉴别诊断。布鲁氏菌2号苗毒力稳定,对各种动物都具有良好的免疫原性,用口服方法接种不会造成怀孕动物流产。本文综述了猪种布鲁氏菌2号苗在猪体上进行的免疫实验研究。     

产色素温和气单胞菌的特性及其外膜蛋白型研究

[目的]研究产色素温和气单胞菌的致病机理。[方法]从不同来源的病鳖和病鳗体内分离到4株产生棕色色素温和气单胞菌,并采用平板法进行检测。[结果]对鲫鱼胸基部注射9×108cfu/ml菌悬液0.4ml后,BA10、BA15和BA16株对鲫鱼的致死率在33.3%以上,M1株对鲫鱼无致死性。采用超声波破碎-SI法提取外膜蛋白(OMPs),SDS-PAGE电泳结果显示,4株温和气单胞菌的外膜蛋白相对分子质量范围在20.1～66.2kDa,其中1个鳗鱼分离株M1株属OMP1型,由8条主要蛋白带组成;其余3个鳖源分离株BA10、BA15和BA16株属OMP2型,由9条主要蛋白带组成。[结论]产色素与致病性无相关;4株产色素温和气单胞菌之间存在共同抗原;产色素温和气单胞菌的OMP型可能与菌株来源有关。     

毛叶枣炭疽菌部分生物学特性研究

毛叶枣炭疽病病原菌 [Colletotrichumcoccodes (Wallr .)Hughes]在 2 5～ 30℃ ,pH 5～ 6时最适宜生长 ;PDA、PSA培养基最适宜病原菌丝生长 ,而OMA培养基最适宜病原菌产孢 ;麦芽糖是病菌生长的最适碳源 ,蛋白胨是最佳氮源 ;光照对病菌的生长无明显的影响     

流产布鲁氏菌2308株磷酸甘露糖变位酶pmm基因缺失株构建及鉴定

旨在构建流产布鲁氏菌2308株pmm基因缺失株。PCR扩增流产布鲁氏菌2308株pmm基因的上、下游同源臂片段,并与枯草芽孢杆菌上SacB基因片段融合。连接至自杀载体PGEM-7Zf+,构建自杀载体PGEM-7Zf+Δpmm-SacB。电转化至流产布鲁氏菌2308株感受态细胞内,通过氨苄抗性和蔗糖敏感性筛选,获得基因缺失株2308Δpmm,对其进行PCR鉴定和稳定性检测。成功构建可稳定遗传的2308Δpmm基因缺失株,并在15代内未发生回复。在此基础上可以对2308Δpmm进行深入研究。     

猪种、牛种、羊种、绵羊种布鲁菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立在临床样本能够同时检测猪种、牛种、羊种、绵羊种布鲁菌的多重PCR方法,根据NCBI已收录的布鲁菌全基因,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立能够同时检测4种布鲁菌的多重PCR诊断方法。特异性试验结果表明,可以从4种布鲁菌以及4种细菌混合物中扩增出大小分别为276、494、733和976bp的特异性条带,对照组的检测结果为阴性;敏感性试验结果表明,对4种病原菌基因组DNA的检出量为猪种32.2pg、牛种21.3pg、羊种27.5pg、绵羊种43.2pg;人工模拟感染样本检测结果表明,能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。应用该方法对200份临床奶山羊乳样进行检测,结果检出4份阳性。建立的多重PCR方法具有特异性强、敏感度高、稳定性好的特点,可以有效地检测4种布鲁菌的感染。     

染色质免疫共沉淀技术对羊种布鲁氏菌转录调控因子MucR靶基因的筛选

为研究羊种布鲁氏菌转录调控因子MucR蛋白的毒力相关机制,对染色质免疫共沉淀技术进行了优化。构建了表达MucRFlag融合蛋白的羊种布鲁氏菌菌株,并用商品化抗Flag标签抗体对MucRFlag蛋白进行富集,从而替代MucR蛋白抗体的制备过程。通过该染色质免疫共沉淀方法对羊种布鲁氏菌MucR蛋白的结合靶点基因进行了鉴定,结果显示:通过使用该方法鉴定出羊种布鲁氏菌MucR蛋白可以结合到BMEI0430和BMEI1364(mucR基因)的启动子序列上。结果表明优化的染色质免疫共沉淀技术适用布鲁氏菌转录调控因子结合靶点的研究。     

猪流产嗜性衣原体MOMP基因的克隆及原核表达

【目的】克隆猪流产嗜性衣原体青海株主要外膜蛋白(Major outer membrane protein,MOMP)基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的猪流产嗜性衣原体MOMP基因的核苷酸序列,设计并合成4条特异性引物,用套式PCR方法扩增猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,将其克隆入pMD18-T载体中,进行测序及序列分析。然后将MOMP基因亚克隆入原核表达载体pGEX4T-1中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测。【结果】扩增到猪流产嗜性衣原体青海株1170bp的MOMP全长基因。序列分析结果表明,该基因与已发表的猪流产嗜性衣原体B11001株和CP/12株核苷酸同源性均为99.7%。SDS-PAGE电泳可检测到分子质量约为66ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在。Western-blot分析表明,重组蛋白可被猪流产嗜性衣原体抗体识别。【结论】成功克隆了猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,并进行了原核表达,表达的蛋白具有抗原活性。     

蜡蚧轮枝菌生物学特性及其与榕母管蓟马毒力的相关性

【目的】探讨蜡蚧轮枝菌生物学特性与菌株对榕母管蓟马毒力的相关性,为榕母管蓟马优质高效生防菌株的初步筛选提供参考。【方法】室内观察蜡蚧轮枝菌V07、V16063、V3450和Vp28 4株菌株的生物学特性,测定其对榕母管蓟马成虫的毒力,通过逐步回归分析探讨两者间的相关性。【结果】4株蜡蚧轮枝菌菌株的生物学特性存在异同,产孢量和孢子萌发率均很高,但V3450菌株生长速度最快,孢子GT50最短;V16063和Vp28菌株生长速度较快,孢子GT50较短;V07菌株生长速度最慢,孢子GT50最长。榕母管蓟马成虫受供试菌株侵染后的死亡趋势均随菌剂浓度升高和侵染时间延长而上升,但不同菌剂中的变幅则明显不同,侵染致死效果依次为V3450V16063Vp28V07,LT50依次为V3450V16063Vp28V07。逐步回归分析表明,菌株生长速度和孢子GT50对累计校正死亡率和LT50的作用均达显著水平。【结论】在供试菌株产孢量和孢子萌发率均很高时,菌株生长速度和孢子GT50可作为评判蜡蚧轮枝菌对榕母管蓟马毒力大小的初筛指标。     

肺炎克雷伯氏菌毒力因子及其基因组学研究进展

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）属于肠杆菌科、克雷伯菌属,在人和动物肠道、呼吸道以及水、土壤、林产品和农产品中广泛存在,肺炎克雷伯氏菌作为一种机会致病菌,是目前公认的导致人和动物发病的重要革兰阴性菌。该菌可引起宿主感染肺炎、肝脓肿、脑膜炎、肠炎、子宫炎、乳腺炎及败血症。此外,随着测序技术的发展,全基因组序列分析已经广泛应用于探究肺炎克雷伯氏菌入侵以及抵抗宿主免疫系统引起致病的研究。对肺炎克雷伯氏菌毒力因子荚膜（Capsule）、脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）、菌毛（Fimbriae）、外膜蛋白（Outer membrane proteins）、铁载体（Siderophores）、尿囊素（Allantoin）代谢相关因子及其基因组学研究进展进行综述,并对肺炎克雷伯氏菌研究中的一些问题进行探讨。     

鳙鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及其毒力基因检测

从患病鳙鱼中分离纯化得到一株优势菌株AH-YS,通过革兰氏染色、氧化酶试验、生化鉴定以及16S r RNA基因扩增、测序和系统进化分析等操作,结果显示,分离到的细菌为维氏气单胞菌。药敏试验显示,在使用的11种抗菌药物中,该菌株对氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星等9种药物敏感,对甲氧苄氨嘧啶和氨苄西林耐药。对9种毒力基因的扩增结果显示,可以检测到气溶素、细胞毒性肠毒素、鞭毛、弹性蛋白酶和酯酶5种。     

土沉香对黄野螟的抗性研究

【目的】黄野螟Heortia vitessoides是珍贵树种土沉香Aquilaria sinensis的重要食叶害虫,通过大面积林间调查土沉香受害情况,筛选可能存在的抗虫植株,为黄野螟的科学预防和土沉香抗虫品种的选育奠定基础。【方法】在黄野螟危害盛期,对野外土沉香林定期进行大面积调查,在严重受害的土沉香林中,观察不同受害水平土沉香的外观形态和叶片物理结构,同时采集具有不同抗虫性植株的叶片饲养黄野螟幼虫,观察初孵幼虫对不同抗性植株叶片的选择和拒食情况,取食不同抗性土沉香叶片后,测定黄野螟幼虫存活率、生长发育、化蛹和羽化的差异。【结果】在土沉香严重受害的林分中发现了2株未受害的土沉香植株,其表现出较好的抗虫性(抗1和抗2)。抗性植株(抗1和抗2)与感虫植株在叶片长度和厚度上差异显著(P0.05),而叶片长宽比无显著差异。在叶片物理结构上,抗2土沉香叶片的上表皮角质层厚度显著高于感虫叶片。抗2土沉香植株对幼虫取食抑制率高于抗1土沉香植株,两者均达44.81%以上。强迫取食抗性土沉香试验的幼虫存活率、成虫羽化率、蛹质量、成虫寿命均显著低于取食感虫土沉香叶片幼虫的相应指标,而取食抗性土沉香的幼虫、蛹发育历期均显著长于取食感虫土沉香叶片的害虫。【结论】叶片嫩绿的土沉香植株较易受黄野螟的为害,而叶片厚的或叶片颜色偏黄、墨绿的土沉香植株对黄野螟具有较强的抗性。抗性土沉香植株对黄野螟幼虫取食活性具有较强的抑制作用,对幼虫的发育有阻碍作用。     

hipA对禽致病性大肠杆菌生物学特性和致病性的影响

【目的】探究毒素-抗毒素（TA）系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌（APEC）生物学特性和致病性的影响,为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE81ΔhipA及回复株C-AE81ΔhipA,测定其生长曲线、运动性、环境耐受能力、细胞黏附能力,并采用实时荧光定量PCR检测环境耐受相关基因（hdeA、hdeB）、黏附相关基因（fimF、fimH）、毒力相关基因（hcp、ompR、ompC）的转录水平,探究毒素蛋白hipA对APEC的生物学功能及致病性的影响。【结果】成功构建hipA基因的缺失株和回复株。野生株AE81、缺失株AE81ΔhipA和回复株C-AE81ΔhipA的生长情况无明显差异。与野生株AE81相比,hipA基因缺失株AE81ΔhipA的运动能力降低,对酸性、碱性、高渗和氧化应激环境的耐受能力减弱,鞭毛和菌毛的数量和长度明显减小,对鸡胚成纤维细胞（DF-1）的黏附能力极显著减弱（P＜0.01）,回复株C-AE81ΔhipA各指标基本恢复到野生株水平。实时荧光定量PCR结果显示,与野生株AE81相比,AE81ΔhipA菌株的hdeA、hdeB、fimF、ompR、ompC基因转录水平显著降低（P＜0.05）,hcp基因转录水平差异不显著,但fimH转录水平显著升高（P＜0.05）。【结论】TA系统毒素蛋白hipA影响APEC的运动性、环境耐受能力和对细胞的黏附能力,参与APEC的致病过程。