奶牛小肠上皮细胞的原代培养和鉴定

为研究小肽转运蛋白对小肽转运和吸收机制提供细胞模型,在体外建立原代奶牛小肠上皮细胞分离的方法,采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶混合消化液对奶牛小肠组织进行消化,通过2%山梨醇进行密度梯度离心以去除单核细胞、淋巴细胞和肌细胞;用刮除法、相差消化法和96孔板单克隆方法来纯化奶牛小肠上皮细胞,从细胞形态学、细胞角蛋白18免疫荧光染色和小肠上皮细胞特异性标志蛋白来鉴定奶牛肠上皮细胞。结果表明:1)采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶联合消化奶牛小肠组织,通过2%山梨醇密度梯度离心可以获得大量的细胞团且48h发生贴壁,但是细胞贴壁不牢。2)48h之后细胞团进一步向外辐射生长出细胞,细胞形态呈现典型的上皮细胞和铺路石形态。5~7d细胞处于对数生长期,细胞大量增值,一部分成纤维细胞与小肠上皮细胞夹杂生长。3)通过96孔板能够单克隆奶牛小肠上皮细胞,细胞呈现均一的铺路石形态。4)奶牛小肠上皮细胞角蛋白18鉴定为阳性,荧光显微镜下能够发出绿色荧光。5)通过RT-PCR能够检测到奶牛小肠上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白、碱性磷酸酶和肠肽酶的表达,成功建立了奶牛小肠上皮细胞的分离和培养方法。     

奶牛瘤胃上皮细胞分离培养与鉴定

在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传至第5代,β-半乳糖苷酶被染成蓝色,同时,细胞出现衰老和停滞生长;5)染色体核型分析表明奶牛瘤胃上皮细胞的染色体数为60条。研究发现通过酶消化奶牛瘤胃组织能够获得奶牛瘤胃上皮细胞,但只能传至5代。     

麦洼牦牛乳腺上皮细胞系的建立及其生物学特性

为建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞的体外培养方法,采用组织块贴壁法及Ⅰ型胶原酶消化法,从麦洼牦牛乳腺组织中成功分离并获得纯化的乳腺上皮细胞,并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力等生物学特性的检测,建立并鉴定麦洼牦牛乳腺上皮细胞系。结果显示,乳腺细胞形态良好,细胞接种存活率达91%,群体倍增时间26.97h,细胞生长曲线呈典型"S"型,细胞传至25代以上仍保持旺盛的增殖活力。可见,通过对细胞传代及反复冻存和复苏已成功建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞系,获得大量的乳腺上皮细胞,使麦洼牦牛物种在细胞水平上得以保存,为建立牦牛乳腺生物反应器及泌乳调控机制研究提供基础。     

组织块种植法体外培养奶牛乳腺上皮细胞

为建立成熟的奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系,以组织块种植法培养荷斯坦泌乳期成年母牛乳腺组织,观测长出的上皮细胞在各生长时期的形态变化,绘制生长曲线并计算群体倍增时间,用免疫组化技术鉴定乳腺上皮细胞角蛋白18的表达,用SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析技术检测乳腺细胞的酪蛋白分泌情况。试验结果表明,此培养体系可获得良好的奶牛乳腺上皮细胞,原代以及传代培养,细胞增殖旺盛,长势良好;细胞骨架蛋白——角蛋白18表达为阳性,且培养的细胞具有分泌牛乳酪蛋白的功能。     

组织工程化人工角膜上皮的构建

在去除上皮细胞的人羊膜基底膜上,分别接种关中奶山羊角膜缘组织块和传至第3代的关中奶山羊角膜缘上皮细胞,体外构建组织工程化人工角膜上皮,并对其进行组织形态学和超微结构观察及免疫组化检测。结果表明,角膜缘组织块和角膜上皮细胞在羊膜上培养15 d均可形成6～7层上皮细胞结构,细胞内含丰富的细胞器和糖原颗粒,细胞间有大量的桥粒连接,细胞与羊膜间形成半桥粒连接,构建的复合角膜上皮P63染色阳性,与正常的角膜相似。说明羊膜可负载培养山羊角膜缘细胞体外构建组织工程化人工角膜上皮,构建的复合角膜上皮含角膜缘干细胞。     

奶山羊乳腺上皮细胞系的建立

乳腺上皮细胞系的建立为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺表达载体的检测提供有利条件。本研究建立了正常培养的奶山羊乳腺上皮细胞系。利用胶原酶和透明质酸消化法从奶山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力检测等生物学性状的检测建立并鉴定了奶山羊乳腺上皮细胞系。结果表明,奶山羊乳腺上皮细胞在添加表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、转铁蛋白-硒钠、10%胎牛血清的DF12培养液中生长状态良好,细胞传至30代时仍保持旺盛的增殖活力。通过细胞传代及反复冻存和复苏实现了细胞系的长期保存,建立了乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。从而为开展奶山羊、奶牛等产奶动物乳腺生物反应器及泌乳机制的研究提供了便利条件。     

兔泪腺上皮细胞的培养与鉴定

用剪切及剪切加胰蛋白酶法消化兔泪腺组织。获取兔泪腺上皮细胞，设计相应的培养基，进行组织块原代培养或混合消化原代培养，用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果表明。组织块在体外培养10d，可见上皮样细胞从植块边缘长出，2周后泪腺上皮细胞在培养瓶底部铺成单层，经传代3次，角蛋白染色阳性细胞纯度达90％以上；用混合消化法接种的细胞生长相对较慢。结果提示：用剪切组织块进行培养的方法简便易行，易获得符合要求的兔泪腺上皮细胞。     

牛乳腺上皮细胞体外分离、培养和鉴定的研究

建立可用于基因打靶的乳腺上皮细胞系是乳腺生物反应器研制的重要环节,分别采用胰蛋白酶、胶原酶及其两者的混合消化液分离获得了包括少量成纤维细胞在内的原代牛乳腺上皮细胞,比较了不同消化方法的优缺点。利用Trypsin-EDTA阶段消化法在体外培养牛乳腺上皮细胞,观察了此细胞培养到第5代、10代、15代和20代时的细胞形态特征和生长特性,比较了该细胞在胶原基质和混合型基质包被培养皿中的培养效果。以乳腺腺泡上皮细胞中的细胞特征蛋白角蛋白18为标志,利用角蛋白18单克隆抗体进行了细胞免疫组化鉴定,证明分离培养细胞的上皮特性。     

鸽小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

本试验旨在建立鸽小肠上皮细胞体外分离培养和鉴定的方法体系,为研究鸽小肠上皮细胞的营养转运吸收、细胞增殖代谢等机制提供原代细胞模型.采用胶原酶消化法和组织块贴壁法分离鸽小肠上皮细胞,并通过相差消化法对其纯化,最后运用免疫荧光分析和基因表达分析鉴定鸽小肠上皮细胞.结果表明,2种方法均可成功分离培养鸽小肠上皮细胞,细胞呈铺路...     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

【目的】探索一种简单且高效的原代奶牛乳腺上皮细胞的培养方法。【方法】采用组织块培养法、酶消化法培养奶牛乳腺上皮细胞;通过MTT法检测吸光度绘制细胞生长曲线;通过免疫组化法鉴定角蛋白-18的表达。【结果】酶消化法相比组织块培养法获得的细胞具有耗时短,获得量高等优点,MTT法绘制的生长曲线符合一般生物学特性,呈"S"型,奶牛乳腺上皮细胞中角蛋白-18阳性表达。【结论】酶消化法是一种简单且高效的培养原代奶牛乳腺上皮细胞的方法。     

鸽骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

【目的】探讨白羽王鸽Columba livia骨骼肌卫星细胞的分离、培养和鉴定的方法,建立完整的家鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系。【方法】选择孵化16 d的鸽胚作为试验材料,采用组织块贴壁法和胶原酶消化法分离胸肌的骨骼肌卫星细胞并绘制其生长曲线。待卫星细胞分化出肌管后,采用免疫荧光法检测肌球蛋白重链(MyHC)的表达;在细胞分化出肌管前、后分别提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测Desmin、Pax7、MyoG和MyoD1基因在细胞分化出肌管前、后的相对表达量。【结果】组织块贴壁法和胶原酶法均能成功地分离出骨骼肌卫星细胞,其生长曲线呈"S"型;该细胞经含体积分数为20%FBS的DMEM高糖培养液培养7 d后视野中出现大量明显可见的肌管,成肌特异性标志MyHC表达呈阳性。RT-qPCR结果表明,Desmin和MyoG基因分化后的相对表达量分别是分化前的5.68和10.38倍,而Pax7和MyoD1基因分化前的相对表达量分别是分化后的7.01和5.51倍。【结论】建立了鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系,为今后进行家鸽肌肉发育的研究提供细胞模型。     

消化法培养山羊乳腺上皮细胞

为了寻找更加有效的山羊乳腺上皮细胞分离纯化方法。用2 g/L胶原酶和0.5 g/L胰蛋白酶相结合的消化法培养山羊乳腺上皮细胞,2~3 d细胞铺满单层,形态如铺路石。所得细胞再经0.5 g/L胰蛋白酶/0.2 g/L EDTA纯化3~4次,得到比较纯净的山羊乳腺上皮细胞。细胞鉴定结果表明,所得到的细胞角蛋白染色呈阳性,阳性率大于90%,波形蛋白染色呈阴性,具有典型的上皮细胞特性。消化法适用于山羊乳腺上皮细胞的体外培养。     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

[目的]建立一种高效的水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分离培养方法,为胚胎着床和子宫内膜相关疾病的分子生物学机制研究奠定基础。[方法]采用酶消化、刮取、系列过滤和差速贴壁相结合的方法分离水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,用免疫细胞化学法和台盼兰染色法检测分离细胞的纯度和活率。[结果]成功分离培养出子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞;免疫荧光染色和细胞计数表明上皮细胞和基质细胞的纯度均达90％以上;台盼兰染色结果显示,上皮细胞的活率为91％,基质细胞的活率为78％。[结论]采用酶消化、刮取、过滤和差速贴壁相结合的方法可分离出高纯度的永牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

绵羊瘤胃上皮细胞的体外分离培养、冻存及复苏方法

本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织进行不同时间(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和消化液分别进行H.E染色分析和显微镜观察,以确定细胞开始收集及终止消化的时间,最后将收集的瘤胃上皮细胞进行原代培养。在传代培养时,运用差时消化法和差速贴壁法对ORECs进行纯化,并从细胞形态学、细胞生长曲线、角蛋白18(CK-18)免疫荧光染色和上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶基因表达等方面对ORECs进行鉴定。然后设置不同体积配方的冻存液,将传代细胞进行冻存,通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率确定最佳冻存液配方。结果表明:第4次消化后就基本消化到瘤胃组织的棘层,此时即可开始收集细胞;第7次消化完后瘤胃上皮的基底层细胞基本被消化掉,此时即可终止消化细胞。经纯化后传代的细胞呈现均一的"铺路石"形态,生长曲线明显呈"S"形,且经CK-18免疫荧光染色后鉴定为阳性,同时PCR检测到上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶均有表达。此外,ORECs经不同体积配方冻存液冻存复苏后发现,冻存液配方为V_(FBS)∶V_(DMEM)∶V_(DMSO)=9∶0∶1时ORECs的细胞活力及贴壁率最高,且传代后的细胞生长状况良好。因此本试验成功建立了ORECs的体外分离培养、冻存和复苏方法。     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

1材料与方法1．1材料1．1．1取材。孕早期成年水牛子宫由南宁某屠宰场提供。1．1．2试剂。一次性细胞培养皿地幻自美同BD公司;新生牛血清购A杭州四季青公司;雌二醇购自宁波市激素制品有限公司;离糖型DMEM细胞培养液粉剂、DPBS粉剂和胶原酶I购自美因GIBCO公司;细胞角蛋白单抗和：二抗购白广州深达生物制品公司。另外,青霉素、链霉素、胰蛋门酶、表皮生氐因子（EGF）、     

雄激素和氢化可的松对山羊附睾头上皮细胞增殖的影响

为研究雄激素和氢化可的松对山羊附睾上皮细胞生长的作用模式,本研究利用酶标仪检测附睾头部上皮细胞增殖情况,实时荧光定量PCR及ELISA检测雄激素受体(AR)的表达,检测睾酮与氢化可的松对山羊附睾上皮细胞体外增殖的作用以及对AR表达的影响。结果表明:100nmol/L睾酮对附睾头上皮细胞增殖的促进效应最高且与对照组差异极显著(P0.01),200nmol/L氢化可的松促进附睾头上皮细胞增殖效应最佳并与对照组差异显著(P0.05),前者的效应明显且可以被AR阻断剂阻断;睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞增殖表现为协同作用;100nmol/L睾酮与200nmol/L氢化可的松均使附睾头上皮细胞的AR mRNA和蛋白表达量上调,与对照组差异显著(P0.05),且二者共存时附睾头上皮细胞的AR mRNA和蛋白表达量极显著高于对照组(P0.01)。本研究表明睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞体外增殖均有促进作用,呈明显的浓度依赖性,且二者之间存在协同作用,这为进一步研究附睾上皮细胞增殖及功能的调节机理提供了基础。     

营养化学感应系统研究进展

人和动物消化器官的营养化学感应系统是胃肠上皮细胞受体对食物信息感受与内脏迷走神经元之间信息传递和互作的复杂信号传递系统。营养化学感应系统由独立化学感应细胞组成,具有形态学的多样性,在体内分布十分广泛,这为其功能作用的发挥奠定了基础。研究表明,营养化学感应系统在调控采食、消化与吸收、肠道生长与功能、肠道防御机制以及宿主与微生物的互作中起着重要作用,并且不同细胞型之间具有不同的功能。它们是营养物质消化吸收的重要调控途径,其功能研究有助于化学感应机制的营养学作用的理解。因此,为了更好的理解和研究营养化学感应系统,本文就营养化学感应系统的分布及其功能作用进行了简要综述。