马鹿生长素Ghrelin全长cDNA的克隆及序列分析

为获得马鹿(Cervus elaphus)Ghrelin全长cDNA序列并进行序列比较和分析,本试验以马鹿皱胃黏膜组织内提取的总RNA为模板,通过RT-PCR、RACE和基因克隆等技术进行克隆。结果表明:获得长度为539bp的马鹿cDNA全序列(GenBank accession no.KX857494),其中包括46bp的5′非编码区(5′UTR),351bp的开放阅读框(ORF),编码116个氨基酸残基的前原Ghrelin(preproghrelin),128bp的3′非编码区(3′UTR)和poly(A)14;Ghrelin的氨基酸同源性分析表明,马鹿Ghrelin cDNA全序列与驯鹿、梅花鹿、山羊、绵羊、牛等物种间的同源性较高,进化树分析与其亲缘关系远近一致。     

香蕉果实expansin cDNA克隆及序列分析

提取成熟香蕉果肉的RNA并分离mRNA，以mRNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，设计expansin的简并引物，进行RT-PCR(退火温度为50℃)，得到的扩增产物纯化后与pGEM-T-Easy载体连接，转化大肠杆菌，任意挑选2个阳性克隆，进行序列分析，结果得到2个序列相同的expansin的cDNA基因片段，命名为MA-Exp3(以示与已登录的香蕉MA-Expl和MA-Exp2的区别)，MA-Exp3中存在expansin基因的保守区域，即8个半胱氨酸残基和3个色氨酸残基，它编码177个氨基酸，与MA-Exp1的核苷酸同源性为74．2％，氨基酸同源性为86．4％。     

梅花鹿鹿茸组织PDGFA基因cDNA克隆及序列分析

为了探讨PDGFA基因的结构和功能,采用RT-PCR方法获得梅花鹿PDGFA基因,并运用生物信息学软件对其序列进行了分析。结果表明:梅花鹿PDGFA基因开放阅读框大小为591 bp,共编码196个氨基酸,蛋白的分子质量约为22 ku,理论等电点(pI)为8.53,是亲水性蛋白,具有信号肽。二级结构分析显示,含有47.45%无规则卷曲、39.29%α-螺旋、13.27%扩展链。进化分析显示,PDGFA蛋白与白尾鹿(Odocoileus virginianus texanus)、家牛(Bos taurus)、山羊(Capra hircus)、野猪(Sus scrofa)、白犀牛(Ceratotherium simum)、小鼠(Mus musculus)、密西西比鳄(Alligator mississippiensis)、原鸡(Gallus gallus)、绒啄木鸟(Picoides pubescens)的蛋白质序列相似度分别为98%、97%、96%、94%、93%、89%、81%、79%、78%。     

大口黑鲈胰岛素基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

胰岛素在鱼体内是一种重要的内分泌激素,其主要的生理功能是调控鱼体的代谢和血糖稳定。用RTPCR和cDNA末端快速扩增法（RACE）技术克隆了大口黑鲈（Micropterus salmoides）胰岛素基因cDNA全序列,并对其编码的氨基酸序列和蛋白结构进行了分析。结果显示,该基因cDNA序列全长665 bp,其中包括5′端非翻译区101 bp、3′端非翻译区213 bp和开放阅读框351 bp。该开放阅读框编码包括信号肽、B链、C肽和A链的116个氨基酸,其分子量约为12.7 ku,理论等电点为5.44。在线分析表明：推测的大口黑鲈前胰岛素原氨基酸序列存在一段跨膜区;并存在信号肽序列,信号肽分裂位点在Ala24Phe25处。大口黑鲈与其他硬骨鱼类及脊椎动物的前胰岛素原氨基酸序列的比对结果显示,大口黑鲈前胰岛素原A链和B链氨基酸序列均高度保守,与其他硬骨鱼类的前胰岛素原氨基酸序列相似度较高,为75%~94%,但与其他脊椎动物的相似度较低,为59%~62%。用邻接法构建的系统进化树显示,大口黑鲈前胰岛素原与同为鲈形目的岩钝鲈、红甘鲹和尼罗罗非鱼的亲缘关系较近。     

玉米HMG全长cDNA的克隆及其分析

ＨＭＧ蛋白质是染色质中一种高度丰富的非组蛋白 ,其分子量比较小。这类蛋白质往往与活性染色质结合在一起 ,而且能优先与单链ＤＮＡ相结合 ,由于ＨＭＧ蛋白质在细胞核内含量极为丰富 ,因而推测它们在染色质的结构与功能中可能起着重要的作用[1 ] 。ＨＭＧ蛋白质结构分为 3部分 :Ｎ -末端、ＨＭＧ -ｂｏｘ中心片段和酸性Ｃ -末端。其中Ｃ-末端可与组蛋白相互作用 ,在调节染色体结构或调节ＨＭＧ与ＤＮＡ之间的亲合力方面起一定功能[2 ] 。有实验结果显示ＨＭＧ1的ＨＭＧ -ｂｏｘ可以通过成环、浓缩及拓扑构象的改变来操纵ＤＮＡ。而酸性末端…     

大口黑鲈胰岛素基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

胰岛素在鱼体内是一种重要的内分泌激素,其主要的生理功能是调控鱼体的代谢和血糖稳定。用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)技术克隆了大口黑鲈(Micropterus salmoides)胰岛素基因cDNA全序列,并对其编码的氨基酸序列和蛋白结构进行了分析。结果显示,该基因cDNA序列全长665 bp,其中包括5'端非翻译区101 bp、3'端非翻译区213 bp和开放阅读框351 bp。该开放阅读框编码包括信号肽、B链、C肽和A链的116个氨基酸,其分子量约为12.7 ku,理论等电点为5.44。在线分析表明:推测的大口黑鲈前胰岛素原氨基酸序列存在一段跨膜区;并存在信号肽序列,信号肽分裂位点在Ala24-Phe25处。大口黑鲈与其他硬骨鱼类及脊椎动物的前胰岛素原氨基酸序列的比对结果显示,大口黑鲈前胰岛素原A链和B链氨基酸序列均高度保守,与其他硬骨鱼类的前胰岛素原氨基酸序列相似度较高,为75%～94%,但与其他脊椎动物的相似度较低,为59%～62%。用邻接法构建的系统进化树显示,大口黑鲈前胰岛素原与同为鲈形目的岩钝鲈、红甘鲹和尼罗罗非鱼的亲缘关系较近。研究亮点:采用RT-PCR和RACE技术首次克隆了...     

紫花苜蓿几丁质酶Class Ⅰ基因cDNA全长克隆及序列分析

依据NCBI中已登录的截形首蓿(Medicago truncatula)几丁质酶基因的一段EST序列(GenBank登录号:AF167323)设计引物,以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为试验材料,利用RACE技术进行cDNA全长克隆.利用生物信息学软件对该序列进行分析得知:该基因全长1 132bp,其...     

水貂生长激素cDNA的克隆与序列分析

从水貂脑垂体中分离提取总RNA，经过RT—PCR分别扩增出水貂生长激素前体肽和成熟肽cDNA。PCR产物经凝胶回收纯化，克隆到栽体pGEM—T，然后转化感受态细胞DH5α。在含X—gal、IPTG的LB(Amp^ )平板上筛选阳性克隆，提取质粒作限制性酶切鉴定后，对目的片段进行测序。结果表明，RT—PCR扩增出的2个cDNA片段碱基数分别为713bp和780bp，用DNAsis2．5软件进行分析表明，此扩增序列与GenBank中发表的水貂生长激素cDNA100％相同。前体肽编码区由651bp组成，编码216个氨基酸，包括长度为29个氨基酸的信号肽；成熟肽的开放阅读框全长564bp，编码187个氨基酸，分子量约为21kDa。通过Blast比对，分析了与人、马、牛、猪、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠生长激素核苷酸序列的同源性。     

梅花鹿LHβ基因的克隆及序列分析

【目的】克隆梅花鹿LHβ基因CDS区并进行序列分析。【方法】采用PCR克隆测序的方法获得梅花鹿LHβ基因CDS区全序列,采用ProtParam tool等分子生物学工具对梅花鹿LHβ蛋白的分子量、等电点、二级结构、蛋白功能等进行预测,并采用MEGA 6.0软件构建进化树以确定其系统发育地位。【结果】梅花鹿LHβ基因CDS区全长462bp(GenBank序列号为KT199365),包含了ATG起始密码子和TAA终止密码子,共编码141个氨基酸,蛋白质分子量为15.17kDa,等电点为8.00。梅花鹿LHβ蛋白均位于膜外,无跨膜结构,平均疏水性(GRAVY)为0.391,蛋白功能预测显示,该蛋白最有可能为激素,这与本研究的目的基因相符。进化树分析结果表明,梅花鹿LHβ基因与山羊、绵羊和牛等反刍动物较近,其中与绵羊最近。【结论】梅花鹿LHβ基因CDS区序列与绵羊LHβ基因最近。     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT－PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV－PE）全长RNA3。经核苷酸序列测定，明确PE分离物RNA3全长2216nt，含有2个开放阅读框（ORDF），其中5'端的ORF（121－963nt)编码279aa的3a蛋白，3'端ORF（1260－1916nt)编码218aa的CP蛋白。5'端非编码区（NR）长120nt，基因间隔区（IP）长296nt，3'端NR区含301个碱.PE分离物编码的3a蛋白最明显的特征是在136－141位有一个独特的VWCLSS区域，将CMV－PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码 区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关。     

鹿血的酶解工艺优化及其抗运动疲劳活性评价

对鹿血酶解工艺进行优化,并对鹿血酶解液进行液相色谱分析及抗运动疲劳活性评价.以氨基酸态氮含量、干燥失重为指标,研究动物蛋白酶的添加量、酶解时间和酶解温度对鹿血酶解效果的影响;以小鼠负重游泳时间、血尿氮含量、肝糖原含量为指标,研究鹿血及酶解液的抗运动疲劳活性.结果表明,动物蛋白酶的添加量为4g·L-1,酶解时间为6h,酶解温度为55℃为较优条件,此时氨基酸态氮含量为0.63 g·100mL-1,干燥失重为60.0％.高效液相色谱图显示鹿血酶解液色谱峰明显,而鹿血粉在该色谱条件下色谱峰较少.与空白组相比,鹿血酶解液给药可极显著(P＜0.01)提高小鼠负重游泳时间、肝糖原含量和降低小鼠血尿氮含量;鹿血粉给药可极显著(P＜0.01)提高小鼠负重游泳时间,显著(P＜0.05)降低小鼠血尿氮含量,但对肝糖原含量影响较小.鹿血具有较强的抗运动疲劳活性,鹿血酶解液的抗运动疲劳活性优于鹿血粉.     

疣粒野生稻半胱氨酸蛋白酶基因ME085的cDNA全长克隆及序列分析

为了发掘疣粒野生稻抗性基因,从受白叶枯菌诱导的疣粒野生稻叶片抑制差减文库(SSH文库)中选择抗病相关的EST序列,运用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得一个基因全长,命名为ME085。通过生物信息学分析表明该基因全长1 171bp,具有一个750bp的开放阅读框,编码249个氨基酸,其理论等电点为5.76,相对分子质量为27 580.1,存在一个明显的半胱氨酸蛋白酶结构域。推测该基因是一个半胱氨酸蛋白酶基因。     

梅花鹿茸生长过程中顶端不同组织COL1A1基因启动子DNA甲基化模式及差异分析

为探究COL1A1基因表达的Ⅰ型胶原蛋白α1链在组成生物体结构和骨发育中的重要作用,以梅花鹿茸生长过程的小鞍子（前期）、二杠（中期）和三杈茸（后期）3个典型时期鹿茸顶端组织及其茸皮、间充质、前软骨和软骨4个组织层为试验材料,采用亚硫酸氢盐测序法（BSP技术）,从时空角度研究鹿茸生长过程中顶端不同组织COL1A1基因启动子区DNA甲基化模式及其相互间DNA甲基化差异。结果显示：1)COL1A1基因在前、中、后期的茸皮组织中的甲基化率分别为（9.73±0.92）%、（7.60±0.69）%和（3.73±0.23）%;间充质组织中的甲基化率分别为（3.20±0.40）%、（1.33±0.23）%和（1.60±0.69）%;前软骨组织中的甲基化率分别为（4.67±0.83）%、（2.53±0.46）%和（2.67±0.23）%;软骨组织中的甲基化率分别为（5.60±0.40）%、（2.80±0.40）%和（2.27±0.61）%。2)COL1A1基因启动子区的甲基化区域共有25个CG位点,在17个CG位点上均发生了不同程度的甲基化。3）对COL1A1基因启动子区DNA甲基化差异分析发现,相同时...     

建鲤催乳素基因全长cDNA的克隆及序列分析和组织表达

为了解催乳素(prolactin,PRL)的基因序列以及在建鲤渗透调节组织中的表达情况,采用同源克隆和末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,RACE)的方法分离克隆了建鲤(Cyprinus carpiovar.Jian) PRL基因全长cDNA,得到1 028 bp的全长cDNA,包括633 bp的开放阅读框(ORF),51 bp 的5′末端非编码区(UTR)以及344 bp的3′末端非编码区(UTR)。对该基因序列和推测的氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示：建鲤与其它硬骨鱼类该基因的氨基酸序列相似度为55.02%~94.76%,与草鱼(Ctenopharyngodon idella)相似度最高(94.76%),与齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)、斑马鱼(Danio rerio)相似度稍低,与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的相似度较低(55.02%),表明不同物种间PRL的氨基酸序列具有较高的保守性。用实时定量PCR (RT PCR)检测该基因在建鲤脑垂体、脑、肠、鳃、性腺、肝、脾、肾中PRL的相对表达量,其中脑垂体最高,其次是肝、鳃、脾、脑、肠、肾,在性腺中也有较低的表达量,表明脑垂体是建鲤PRL基因的主要表达场所,在性腺、肝、脾的表达说明其在鱼体内除了渗透调控可能还存在多种生理功能。     

罗氏沼虾Doublesex基因的cDNA克隆及性别二态性表达分析

克隆了罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)含DM结构域的Dsx基因(MroDsx)部分序列,DM结构域包含5个保守的半胱氨酸(Cysteine)和2个组氨酸(Histidine), 且与中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) Dsx基因DM结构域具有73%的相似性。荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,qPCR)结果显示:MroDsx基因仅在性腺中特异性表达,且在精巢中的表达量显著高于卵巢;在精巢发育早期(主要是精原细胞)高表达,随着精巢的发育MroDsx基因的表达量逐渐降低。原位杂交(In situ hybridization,ISH)结果进一步显示:MroDsx转录本在精原细胞表达量高,在精母细胞以及精细胞中较弱,在成熟的精子中不表达,与荧光定量的结果一致。基于对MroDsx转录本的表达分析,推测MroDsx可能参与罗氏沼虾精巢的发育过程。     

梅花鹿IGF-1的原核表达与纯化

【目的】克隆梅花鹿（Cervus nippon）胰岛素样生长因子1（Insulin-like growth factor 1,IGF-1）的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列（登录号：HQ890468）设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Rosetta大肠杆菌进行诱导表达（0.6 mmol/L IPTG,37 ℃,4 h）后,对其表达产物进行SDSPAGE和Western blotting检测。用Ni-Agarose柱亲和层析试剂盒分离、羟胺裂解纯化目标蛋白,并利用四唑盐比色法（MTT法）和流式细胞仪检测目标蛋白对NIH3T3细胞增殖及不同细胞周期下NIH3T3细胞比例的影响。【结果】获得了梅花鹿IGF1成熟肽基因序列（234 bp）;经鉴定,原核表达载体pET-32a-IGF-1构建成功;SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,在Rosetta中成功诱导表达了融合蛋白,且羟胺裂解纯化后的目的蛋白纯度较高;MTT法和细胞周期检测结果表明,复性后的IGF-1重组蛋白能促进细胞增殖。【结论】 成功克隆了梅花鹿IGF-1成熟肽基因序列,获得了具有生物学活性的IGF-1蛋白。     

牛Dmrt7基因cDNA的克隆和生物信息学分析

【目的】探讨牛Dmrt7基因的生物学功能,为进一步研究该基因对牛精液品质的影响奠定基础。【方法】以牛睾丸组织为材料,根据GenBank中发表的小鼠Dmrt7基因序列,结合生物信息学技术,设计并合成2对引物,采用RT-PCR方法克隆牛Dmrt7 cDNA,并运用DNAMAN软件及在线工具对所得到的序列进行了生物信息学分析。采集牛肾脏、肝脏、睾丸、肺、脾脏、瘤胃、子宫、小肠、心脏、卵巢和肌肉等11个组织,以牛-βactin基因为内参基因,对牛Dmrt7基因的组织表达谱进行分析。【结果】牛Dmrt7基因cDNA长度为1 378 bp(Genbank登录号为EF534775),包含由1 113个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF包含1个TAG终止密码子,编码370个氨基酸;在进化关系上,牛首先与狗聚为一类,亲缘关系最近,再与小鼠和大鼠聚为一类,最后与人和短尾猿聚为一类。Dmrt7蛋白含有一个DM结构域。牛Dmrt7基因在睾丸组织中高度表达,在其他组织中不表达。【结论】获得了牛Dmrt7基因的cDNA序列(Genband登录号为EF534775);牛Dmrt7蛋白可能对精液品质有影响。     

甘蓝型油菜BnaWRKY30-like基因cDNA序列克隆 及生物信息学分析

WRKY 转录因子是植物所特有的一个超级基因家族,能调控植物生长发育过程及逆境反应。根据转录组测序获得的 EST 序列设计引物, 利用 RT-PCR 及 RACE 技术克隆了甘蓝型油菜WRKY30 基因 cDNA 全长序列, 并运用生物信息学手段对序列进行了分析及预测。结果表明：BnaWRKY30-like 基因全长cDNA序列中包含102 bp 的5′-UTR序列,188 bp 的3′-UTR序列以及942 bp的完整ORF,编码313个氨基酸。该转录因子蛋白相对分子量为35 319.85D,等电点为 6.22,基本氨基酸中含量最高的丝氨酸（Ser）,313个氨基酸中含有41个酸性氨基酸,34个碱性氨基酸,在121～182区域含有一个典型的WRKY结构域。亚细胞定位预测发现该转录因子定位于细胞核的可能性最高。蛋白质的二级结构预测表明共有α-螺旋占26.20%,延伸链占10.54%,β-转角占4.47%,无规则卷曲占58.79%。BnaWRKY30-like基因编码的蛋白具有典型的WRKY转录因子特征,与拟南芥WRKY30基因亲缘关系近,可能在油菜早期生长发育过程及盐胁迫中的发挥调控作用。     

暗纹东方鲀sox9基因的克隆和组织表达分析

为初步探究暗纹东方鲀sox9基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过设计兼并引物、RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀sox9基因的cDNA全长序列,并分析其相应的生物信息学特征及其在雌雄个体的组织表达水平。结果表明:sox9a基因cDNA全长为1 248 bp(NCBI登录号:MH218818),包括684 bp的ORF,编码227个氨基酸,297 bp的5′UTR和267 bp的3′UTR。sox9b基因全长为1 941 bp(NCBI登录号:MH218819),包括1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,306 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR。同源性和系统发育分析结果表明暗纹东方鲀sox9基因与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示两个Sox9氨基酸序列的HMG box结构域在哺乳动物和鱼类中均高度保守。荧光定量PCR分析显示两个sox9基因普遍存在于雌鱼和雄鱼的各个组织中,且均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在精巢中有少量表达,卵巢中几乎不表达。总体来说,除少数组织外,两个sox9基因在雌鱼组织中的表达量普遍高于雄鱼。本研究为了解暗纹东方鲀sox9的遗传特性及相关的生理功能,探索性别分化与性腺发育的分子调控机制提供理论依据。