欧洲鳗鲡MyD88基因的克隆及其免疫功能分析

髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,My D88)是TLR(toll-like receptor)信号通路的关键接头蛋白,在先天性免疫中发挥重要作用。实验首次克隆了欧洲鳗鲡My D88基因c DNA全长序列,命名为Aa My D88,其全长为1 539 bp,开放阅读框为846 bp,编码282个氨基酸。该蛋白三维丝带空间结构图与人类的My D88十分相似,具有My D88家族典型的死亡结构域和TIR(toll-like/IL-1 receptor)结构域,其中TIR结构域中含有3个序列高度保守的box1、box2和box3。同源性分析显示,欧洲鳗鲡My D88氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为76.3%,与其他鱼类相似性为67.5%~73.2%,与哺乳动物相似性较低,为61.6%~62.6%。欧洲鳗鲡My D88在系统进化树中与其他鱼类My D88聚为一支,哺乳类以及两栖类My D88分别聚为一支。实时荧光定量PCR检测发现,Aa My D88基因在欧洲鳗鲡各组织器官中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,心脏、肠、脾脏以及肾脏中也有较高的表达,而肌肉和鳃中的表达水平较低;欧洲鳗鲡经山羊Ig G肌肉注射后,肾脏Aa My D88基因在第7天表达量有显著性提高,14 d后恢复至正常水平,而脾脏Aa My D88基因表达水平从第7~21天持续显著上调,于第7天达到峰值,其表达量为肾脏的1.7倍;欧洲鳗鲡鳍细胞系经poly I:C处理后,Aa My D88基因表达水平在3 h显著降低,6~48 h均有显著升高,于12 h达到峰值。LPS处理后的欧洲鳗鲡鳍细胞系Aa My D88基因表达水平在3 h显著降低,6和12 h显著升高,于12 h达到峰值,24 h后恢复至正常水平。poly I:C处理组My D88基因表达水平在12~48 h均显著高于LPS处理组。研究表明,My D88在欧洲鳗鲡抵御外源微生物的免疫应答反应中发挥重要作用。     

半滑舌鳎TLR5S 三种剪切型基因的克隆与表达分析

Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)是TLRs家族成员之一,可分为跨膜型TLR5M和鱼类特有的可溶型TLR5S,它们可以识别致病菌表面的鞭毛蛋白并协同作用激活免疫反应。为了研究半滑舌鳎受到病原感染后TLR5S参与免疫反应的作用,本研究使用RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)TLR5S全长c DNA序列。TLR5S c DNA有3种剪切型:Cs.TLR5S x1,Cs.TLR5S x2和Cs.TLR5S x3。这3种剪切型的相同区域为308 bp 5′非编码区(5′UTR)和1701 bp开放阅读框(ORF),不同的3′UTR分别为138 bp、364 bp和637 bp。Cs.TLR5S共编码567个氨基酸,预测编码蛋白质分子量为64.03 k D,等电点为8.49。氨基酸多重序列比对结果显示,Cs.TLR5S氨基酸序列与其他脊椎动物TLR5S氨基酸序列具有较高的相似性,其中与牙鲆相似度高达61%,表明Cs.TLR5S在进化上的具有一定的保守性。Real-time PCR结果表明该基因在半滑舌鳎的不同组织均有表达,其中在肝的表达量最高,在脾的表达量最低。此外,检测Cs.TLR5S 3′端的不同剪切型在肝、脾、头肾、小肠中的表达,结果显示Cs.TLR5S x3只在肝中高表达,而Cs.TLR5S x1则在肝和小肠中都有中等程度表达。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎实验表明,注射菌液6 h后,Cs.TLR5S基因在肾、小肠、肝和脾4个组织中的表达量都有显著上升;注射鳗弧菌48 h后,以上4种组织中表达量均呈现降低的变化。上述实验结果说明,Cs.TLR5S基因可能参与了半滑舌鳎抗弧菌感染的免疫反应。     

Immunostimulatory effect of salmon prolactin on expression of Toll-like receptors in <Emphasis Type="Italic">Oncorhynchus mykiss</Emphasis> infected with <Emphasis Type="Italic">Piscirickettsia salmonis</Emphasis>

In aquaculture, antibiotics are the traditional treatment used against bacterial infections. However, their use has increasingly come into question given their effects on fish and, possibly, on human health. Consequently, there is interest in developing alternative treatments aimed at stimulating the innate immune response of fish, which is the first line of defense against pathogens. In relation to this, the Toll-like receptors (TLR) aid in the selective identification of pathogens. The present study evaluated immunostimulatory activity of prolactin (PRL) hormone on expression levels of TLR1, 9, and 22, MyD88, and IL-1β during in vitro infection with the fish pathogen Piscirickettsia salmonis, in primary cultures of Oncorhynchus mykiss head kidney cells. Results indicated that PRL increased expression of TLRs and MyD88 during the first hours of bacterial infection, while a constant increase in expression was found for IL-1β. These findings suggest that PRL indirectly modulates expression of TLRs by activating expression of suppressors of cytokine signaling, thereby regulating immune response over long periods of time during bacterial infection.     

Molecular cloning of sea perch (Lateolabrax japonicus) TLR1 and analysis of its expression pattern after stimulation with various bacteria

Toll‐like receptors (TLRs) play an indispensable role in fish immunity, being involved in pathogen recognition and the triggering of immune reactions. Here, a member of the TLR family, TLR1, from Lateolabrax japonicus was characterized and its expression pattern and intracellular localization were analysed. The full‐length LjTLR1 cDNA (2,755 bp) was found to encode a polypeptide of 827 amino acids. The deduced amino acid sequence contained three main structural domains: an extracellular leucine‐rich repeat domain, a transmembrane domain and a Toll/IL‐1 receptor domain. Tissue distribution analysis indicated that LjTLR1 was expressed in all of the examined tissues to varying degrees, with the highest levels being measured in the head kidney. In order to assess the antibacterial functions of LjTLR1 during infection, the pathogenic bacteria Vibrio harveyi and Streptococcus agalactiae were used. LjTLR1 was significantly upregulated in the three immune organs (the head kidney, spleen and liver) following bacterial stimulation, and its expression was detected 6 hr after initial exposure. In mRNA in situ hybridization experiments, positive signals were more numerous in the treatment group than the control group, verifying the expression patterns observed. Assessment of the intracellular localization of LjTLR1 revealed it to be present in the cytoplasm. These results indicate the potential role of LjTLR1 in immune responses to bacterial infection. This study enriches our knowledge of L. japonicus immune genes and provides a theoretical basis for further research concerning the antibacterial functions of fish TLRs during infection.     

剑尾鱼IgZ基因的克隆及疫苗免疫对其在组织中表达的影响

为研究剑尾鱼Ig Z基因序列及其在疫苗免疫后的表达规律,本实验根据已知的EST库设计引物,利用RT-PCR等方法,获得剑尾鱼Ig Z基因c DNA全长序列,并进行生物信息学分析和疫苗免疫后组织表达分析。结果显示,剑尾鱼Ig Z基因全长序列为5 420 bp,包含4个外显子和3个内含子;c DNA序列全长1 527 bp,包含一个1 299 bp的完整ORF框,该基因编码432个氨基酸,预测其编码蛋白的分子量大小为47.48 ku,并具有Ig Z的基本结构,与其他硬骨鱼类Ig Z氨基酸序列一致性为28%~54%。荧光定量PCR分析结果显示,Ig Z基因主要在剑尾鱼的头肾、脾脏和肠中分布,且疫苗免疫后11天内,Ig Z基因在头肾、脾脏和肠组织中均表现为先上升后下降的趋势。头肾中Ig Z基因的表达量在第4天时最高,为对照组的2.12倍;脾脏中Ig Z基因在第4天时呈现最高峰,为对照组的4.65倍;肠组织中Ig Z基因的表达量在12 h时有一个小高峰,第2天时最高,为对照组的11.41倍。本研究获得了剑尾鱼Ig Z基因c DNA全长序列,并对其表达规律进行了初步研究,发现Ig Z在肠道黏膜免疫中具有重要作用,这将为进一步验证其在黏膜免疫中的作用以及剑尾鱼作为疾病研究模式动物和疫苗免疫评价模型奠定基础。     

三角帆蚌HcCUBDC基因cDNA的全长克隆与表达分析

利用cDNA末端快速扩增（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）方法,获得了三角帆蚌HcCUBDC基因的全长cDNA序列,共5158bp,开放阅读框（ORF）1920bp,编码639个氨基酸,5′端非编码区576bp,3′端非编码区2662bp,GeneBank登陆号为KP067952。生物信息学分析表明,三角帆蚌HcCUBDC蛋白含有一个由19个氨基酸组成的信号肽和4个CUB结构域,但未能比对上已知的蛋白。经荧光定量PCR检测,HcCUBDC基因在紫色和白色蚌前端缘膜、后端缘膜、中央膜、鳃、斧足、肝胰腺、肠和肾8个组织中均有表达,并且都是肝胰腺表达量最低。在紫色蚌中,后端缘膜表达量极显著高于前端缘膜;在白色蚌中,前端和后端缘膜之间表达差异不显著。HcCUBDC基因在紫色蚌后端缘膜中的表达量极显著高于白色蚌,在紫色和白色蚌前端缘膜中的表达量差异不显著。外套膜原位杂交结果显示,HcCUBDC基因主要在缘膜外上皮细胞中表达。研究表明,HcCUBDC基因在三角帆蚌内壳色形成中发挥作用,可为进一步深入研究该基因在珍珠颜色形成过程中的功能及其调控机理提供基础资料。     

中国明对虾MKK4基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达分析

为初步研究中国明对虾MKK4的生物学功能,采用RACE技术克隆获得中国明对虾MKK4基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾MKK4基因全长为2 064 bp,开放阅读框长1 221 bp,5'非编码区长214 bp,3'非翻译区长629 bp。将该基因命名为FcMKK4。推测该基因编码406个氨基酸,预测分子量为45.94 ku,理论等电点为8.50。同源性和系统进化分析发现FcMKK4与肩突硬蜱和印度跳蚁的同源性分别为80%和78%,与其他节肢动物MKK4聚为一支。荧光定量RT-PCR结果表明,FcMKK4基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为肝胰腺。氨氮胁迫后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的表达量均显著增加,并有不同的时空表达谱式,表明FcMKK4可能参与中国明对虾非生物胁迫的应答反应。     

褐牙鲆白细胞介素21基因克隆及表达分析

利用转录组测序数据信息和PCR技术克隆褐牙鲆白细胞介素21(IL-21)基因的编码区序列,并进行生物信息学分析及表达模式分析。试验结果显示,白细胞介素21基因开放阅读框429 bp,编码142个氨基酸,分子量16.0 ku,在N端具有19 bp信号肽序列。分子系统发育树分析表明,褐牙鲆白细胞介素21蛋白与尖吻鲈以及深裂眶锯雀鲷白细胞介素21蛋白亲缘关系最近。实时荧光PCR结果显示,白细胞介素21基因在所检测的褐牙鲆7种健康组织中均有表达,其中肝脏的表达量最高。用提取的迟钝爱德华氏菌脂多糖免疫刺激褐牙鲆后,白细胞介素21基因的表达在头肾和脾组织中产生不同程度上调,表明该基因参与了脂多糖诱导的免疫应答。利用RNA干扰技术沉默髓样分化因子(MyD88)基因后,白细胞介素21基因的表达出现下调,当再用提取的迟钝爱德华氏菌脂多糖免疫刺激后,MyD88和白细胞介素21基因的表达又均开始逐渐回升,暗示白细胞介素21与MyD88通路具有一定关联性。     

Cloning, characterization and expression of the LECT2 gene in grass carp

An expressed sequence tag of grass carp leukocyte cell–derived chemotaxin 2 (LECT2) gene was screened from an established intestinal cDNA library. Rapid amplification of cDNA ends gave rise to a full-length LECT2 cDNA (gcLECT2) with a complete open-reading frame of 474 bp, encoding 158 amino acids about 17.9 kDa. Homology search and sequence alignment showed that this deduced protein sequence shared a high identity with LECT2 from other vertebrates. Western blotting indicated immunological cross-reactivity occurs between grass carp and human LECT2 protein. This gcLECT2 genomic sequence is 1,868 bp in size, which consists of five exons and four introns. Real-time quantitative PCR analysis revealed that gcLECT2 gene is ubiquitously expressed in different tissues of healthy grass carp including brain, gut, liver, spleen, kidney, muscle and heart, while the expression levels were significantly increased in liver and spleen followed by Aeromonas salmonicida infection. 992 bp 5′-flanking region sequence was cloned and analyzed, where one CAAT box and one GC island were found. Our results showed that the LECT2 is suggested to be most possibly involved in the grass carp’s immune response.     

拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）基因的克隆与表达分析

采用qRT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因cDNA全长序列。该基因全长1 558 bp,开放阅读框长度为1 224 bp,编码407个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与昆虫的相似性高达70%,推测MAPKK基因在节肢动物具有较高的保守性。经荧光定量PCR检测,MAPKK基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑神经节和卵巢中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,MAPKK基因在卵巢发育期(Ⅲ期)表达量最高,发育期为卵母细胞快速生长期,推测MAPKK具有促进卵母细胞快速生长的作用。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道.本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因cDNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp.SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ).经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高.鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12h后表达量达到0h时的13.20倍.使用LPS、PGN、PolyI:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与PolyI:C均下调基因表达.以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用.     

Schizothorax prenanti corticotropin-releasing hormone (CRH): molecular cloning,tissue expression,and the function of feeding regulation

Corticotropin-releasing hormone (CRH) is a potent mediator of endocrine, autonomic, behavioral, and immune responses to stress. For a better understanding of the structure and function of the CRH gene and to study its effect on feeding regulation in cyprinid fish, the cDNA of the CRH gene from the brain of Schizothorax prenanti was cloned and sequenced. The full-length CRH cDNA consisted of 1,046 bp with an open reading frame of 489 bp encoding a protein of 162 amino acids. Real-time quantitative PCR analyses revealed that CRH was widely expressed in central and peripheral tissues. In particular, high expression level of CRH was detected in brain. Furthermore, CRH mRNA expression was examined in different brain regions, especially high in hypothalamus. In addition, there was no significant change in CRH mRNA expression in fed group compared with the fasted group in the S. prenanti hypothalamus during short-term fasting. However, CRH gene expression presented significant decrease in the hypothalamus in fasted group compared with the fed group (P < 0.05) on day 7; thereafter, re-feeding could lead to a significant increase in CRH mRNA expression in fasted group on day 9. The results suggest that the CRH may play a critical role in feeding regulation in S. prenanti.     

中国明对虾caspase2基因克隆及其在抗白斑综合征病毒中的表达分析

采用RACE技术克隆获得中国明对虾caspase2基因cDNA序列全长,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾caspase2基因全长为1517 bp,开放阅读框长924 bp,5'非编码区长78 bp,3'非编码区长515 bp,命名为FcCasp2。推测该基因编码307个氨基酸,预测分子量为34.21 ku,理论等电点为7.62。同源性和系统进化分析发现,FcCasp2基因与凡纳滨对虾caspase2和斑节对虾caspase的相似性分别为88%和80%,与其他节肢动物caspase家族基因聚为一类。荧光定量RT-PCR结果显示,FcCasp2基因在肝胰腺中的相对表达量最高,在肌肉中表达量最低。WSSV感染后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺和鳃丝中的表达量有不同的时空表达趋势,表明FcCasp2基因可能参与中国明对虾生物胁迫的应答反应。     

低氧胁迫对瘤背石磺Toll样受体4、血细胞和免疫酶活性的影响

为探究瘤背石磺面临低氧环境时固有免疫的应激机制,以RACE法对瘤背石磺TLR4 基因进行全长克隆,并进行生物信息学分析,测定了低氧胁迫下瘤背石磺TLR4基因的表达变化,以及分析了血细胞活力和溶菌酶（LSZ）活性、肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）活性和碱性磷酸酶（ALP）活性。结果显示,瘤背石磺TLR4基因cDNA全长共3 605 bp,包括编码956 aa氨基酸的2 817 bp开放阅读框。系统进化树表明瘤背石磺TLR4基因与光滑双脐螺TLR4基因的进化地位较为接近。qRT-PCR结果显示TLR4基因在瘤背石磺7个组织中均有表达,其中表达量最高的是肝脏。低氧胁迫下,各组织中TLR4基因的表达量皆显著上升,其中神经节在4h时率先达到峰值。此外,血细胞活力、LSZ活性、ALP活性都是呈先下降后上升的趋势,而SOD活性呈先上升再下降再上升的趋势,波动幅度最为明显。研究结果初步说明了TLR4的生理功能,为探究潮间带生物免疫系统的低氧应激机制提供理论参考。     

半滑舌鳎StAR基因克隆及其在不同组织的时空表达分析

利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其他组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其他各组织(P0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示,StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至2龄时表达量最高,3龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示,StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在雌鱼的卵巢中不表达。研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用。     

凡纳滨对虾酚氧化酶原激活因子基因的克隆及表达分析

为研究酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase-activating factor,PPAF)在凡纳滨对虾感染传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)过程中所起的免疫作用,实验采用逆转录聚合酶链式反应和cDNA末端快速扩增技术克隆了凡纳滨对虾PPAF基因的全长cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR技术分析了该基因在正常凡纳滨对虾和感染IHHNV凡纳滨对虾不同组织的表达情况。结果显示,克隆获得了1 986 bp凡纳滨对虾PPAF基因cDNA全长序列(GenBank登录号JQ684529),其中含有一个1 629 bp开放阅读框(ORF),两翼分别存在21 bp(5'端)和336 bp(3'端)的非翻译区。该基因的开放阅读框共编码542个氨基酸,氨基酸序列269~517处存在功能结构域——丝氨酸蛋白酶结构域,氨基酸序列494~502区域存在一个ALPHA-2巨球型免疫蛋白功能位点,316~321区域有一个组氨酸酶活性位点;定量PCR分析发现,该基因无论在正常对虾还是感染IHHNV对虾的心脏、肝胰腺、肠、胃和肌肉中的表达量均较低,在血液和鳃腺中的表达量明显高于其他组织,但感染IHHNV对虾不同组织中PPAF基因的表达量均低于正常对虾相应组织中的表达量。定量检测PPAF基因在对虾鳃腺组织中的表达情况显示,对虾感染IHHNV后,PPAF基因的表达量急剧降低,3 h时至最低,之后表达量逐渐上升,48h时达最高值。研究表明,IHHNV可抑制PPAF基因的表达,因而抑制酚氧化酶原免疫系统的有效激活,或是其感染对虾并在对虾组织内增殖的原因之一。