菲菜氏温扬球虫18S rDNA基因的扩增与克隆分析

菲莱氏温扬球虫是鸭球虫病的重要病原之一,为了寻找种特异性的遗传标记,本研究采集广东省某鸭场的新鲜鸭粪,通过Sheather's蔗糖漂浮法收集球虫卵囊,经形态学鉴定为菲莱氏温扬球虫;提取该球虫DNA样品,经过PCR扩增,首次获得了该虫的18S rDNA基因部分片段;对该基因进行了克隆和测序,比较了该虫株与其他原虫的亲缘关系.结果显示,对菲莱氏温扬球虫序列与艾美耳科其他球虫关系较近,系统进化树分析属于艾美耳科的另一分支.表明18S rDNA基因在鸭菲莱氏温扬球虫的分类鉴定上是一种有效的分子标记.     

菲莱氏温扬球虫裂体生殖的发育过程及超微结构

菲莱氏温扬球虫（ＷｅｎｙｏｎｅｌａｐｈｉｌｉｐｌｅｖｉｎｅｉＬｅｉｂｏｖｉｔｚ，１９６８）的裂体生殖过程是在具皱褶膜的纳虫空泡中进行的。发育早期的滋养体外被单层界膜，胞质中含一些退化的运动期虫体特有的细胞器（如微线体等），以及丰富的内质网、线粒体、高尔基体等。裂殖子以外出芽方式形成于裂殖体表面。裂殖子外被３层单位膜，中层和内层组成内膜复合体。裂殖子中部表膜上有１～２个微孔。类锥体由５～６圈微管组成，内有１对棒状体颈部，２根锥体内微管和若干微线体。类锥体前为Ｒ１、Ｒ２。棒状体起于顶孔，止于虫体中部，分细的颈部和膨大的体部，虫体前部有大量微线体。膜下微管为２２根。核位于虫体后部，每代成熟裂殖子均有数个致密体和大量支链淀粉粒。     

牛源环孢子虫18 S rDNA部分序列的扩增与克隆分析

将采自广东省的牛源环孢子虫样品经套式PCR扩增,获得了18SrDNA基因中大小为296bp的目的片段,对该序列进行了克隆和测序,比较了该虫株与其他原虫的亲缘关系。结果显示,该虫序列与已报道的广州牛源环孢子虫虫株完全一致,与其他艾美耳球虫的亲缘关系较近,在广东首次发现的牛源环孢子虫属于艾美耳科环孢子虫属的一新种。表明18SrDNA基因在环孢子虫进化和分类鉴定研究上是一种有效的分子标记。     

2种鹅球虫18S rDNA基因克隆测序与系统发育分析

在分析了多种艾美耳球虫18S rDNA序列的基础上,设计1对艾美耳属球虫的通用引物,分别对鹅艾美耳球虫(E.anseris)和赫尔曼艾美耳球虫(E.hermani)18S rDNA部分序列进行PCR扩增、克隆和测序,并用DNAstar软件对这2种鹅球虫与15种艾美耳球虫的18S rDNA序列进行同源性分析,最后以火鸡组织滴虫为外类群,采用邻接法构建了2种鹅球虫与29种艾美耳亚目原虫的18S rDNA序列系统进化树。结果显示:鹅艾美耳球虫和赫尔曼艾美耳球虫的18S rDNA部分序列长度分别为1 695和1 696 bp。虫种间的相似性以2种鹅球虫最高,其次为鹅球虫与鹤球虫。在系统发育树中,艾美耳属球虫与成囊类球虫各形成一个单系分支;锦鲤的艾美耳球虫与其他动物的艾美耳球虫形成姊妹群关系;湿地鸟类的艾美耳球虫聚合为一分支,鸡形目和哺乳类动物的艾美耳球虫形成另一分支。本研究提示18S rDNA序列可用于鹅球虫的分类鉴定。     

3种兔球虫18S rDNA部分序列测定与系统发育分析

采用单卵囊分离法从河北某兔场分离大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫,接种无球虫兔后获得大量纯种卵囊,CTAB法提取孢子化卵囊基因组DNA。利用艾美耳属球虫18S rDNA保守引物,PCR扩增3种兔球虫18S rDNA片段,产物纯化后测序。将3种球虫18S rDNA测序结果与GenBank中发布的兔球虫18S rDNA序列用DNAStar软件进行比对。使用MEGA4.0软件对兔球虫18S rDNA进行同源性比较,并绘制遗传进化树。结果表明,大型艾美耳球虫扩增出大小为1 521bp的18S rDNA片段;黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫均扩增出大小为1 520bp的18S rDNA片段。序列比对结果显示,3种河北株兔球虫与GenBank中相应的3种兔球虫18S rD-NA(EF694016、EF694011、EF694012)相似性分别为99.6%、99.6%和100%。3种河北株兔球虫序列和GenBank中兔球虫18S rDNA序列(EF694007-EF694017)位于一个单系集群。     

鸡艾美耳球虫18SrDNA序列与系统进化分析

为了确定鸡艾美耳球虫（Eimeria）不同种以及来自不同地区同种不同株之间的亲缘关系,研究其分类地位,对实验室保藏的柔嫩艾美耳球虫（Etenella）、毒害艾美耳球虫（Eneeatrix）、巨型艾美耳球虫（Emaxima）、堆形艾美耳球虫（Eaaervulina）等4种15株鸡球虫孢子化卵囊的18SrDNA基因进行克隆、测序,并与从GenBank下载的鸡球虫18SrDNA序列一起,使用软件DNAstar 5．0 MegAlign进行系统发育分析。结果显示,4种艾美耳球虫种间同源性在94．6％～99．4％之间,7株柔嫩艾美耳球虫的株间同源性在99．0％-99．9％之间,5株巨型艾美耳球虫的株间同源性在96．9％～99．8％之间。用该4种鸡球虫的18SrDNA序列与GenBank下载的另外4种鸡球虫18SrDNA序列构建系统发育树,显示这8种鸡艾美耳球虫形成2个分支,即堆形艾美耳球虫（EASH）、巨型艾美耳球虫（EMSH）、变位艾美耳球虫（Emivati）、和缓艾美耳球虫（Emitis）、布氏艾美耳球虫（Ebrunetti）、早熟艾美耳球虫（Epraecox）构成1个分支,柔嫩艾美耳球虫（ENSH）、毒害艾美耳球虫（ETAS）构成另1分支。巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫各株的系统发育树均根据地域关系产生2个分支。柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫的亲缘关系较近,不同地理区域的同种不同株的亲缘关系相对较远,种间和种内的鉴定结果与普通生物学结果一致。本研究提示18SrDNA基因可用于鸡球虫不同种／株的分类鉴定,为艾美耳球虫分子遗传学鉴定提供了理论基础。     

火鸡隐孢子虫18S核糖体DNA部分序列测定与系统发育分析

从长春地区鸭的粪便中分离纯化了火鸡隐孢子虫（Cryptosporidium meleagridis）卵囊，根据隐孢子虫18S rDNA基因序列设计合成引物，用PCR扩增了卵囊基因组DNA大小586bp的片段，PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化，纯化后PCR产物直接测序，将测得的序列用Dnastar软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较，并绘制了系统发育进化树。结果初步建立了火鸡隐孢子虫的PCR检测方法，序列分析显示长春外国语源火鸡隐孢子虫与国外9株隐孢子虫相应序旬同源性在82.7%-99.8%之间，其中与国外火鸡源火允隐孢子虫相应序列同源性为85.3%；与C.felis同源性最低，与C.muris同源性最高。本研究为火鸡隐孢子虫病诊断及该病分子流行病学研究打下了良好基础。     

柔嫩艾美球虫地克珠利和马杜拉霉素抗药株与敏感株孢子化卵囊18SrDNA基因的差异

为探讨抗球虫药物地克珠利和马杜拉霉素对柔嫩艾美球虫18SrDNA的影响，分别对人工诱导的柔嫩艾美球虫地克珠利抗药株（ETAD）、马杜拉霉素抗药株（ETAM）和药物敏感株（ETDS）孢子化卵囊的18SrDNA基因进行了克隆测序，并通过生物信息软件进行对比差异分析。结果显示，ETAM株有3个碱基发生突变（T170突变为C，T646突变为C，G694突变为C）；ETAD株有1个碱基发生突变（T646突变为C）。经进一步分析比较，发现ETAM株18SrRNA的二级结构与ETDS株的差异很大，而ETAD株18SrRNA的二级结构则与ETDS株的完全相同。这些碱基的突变有可能是导致E．tenella产生抗药性的原因之一。     

西方角蝇和截脉角蝇18S rDNA的克隆及其分子系统学研究

为了弄清双翅目昆虫西方角蝇(Haematobia.irritans)和截脉角蝇(Haematobia.titillans)18S rDNA基因序列及其分子进化。本研究测定了两种角蝇的18S rDNA基因序列,将其在NCBI中Blast,并将序列与GenBank中已知9种双翅目昆虫的18S rDNA基因序列进行比较分析,找出它们的同源区和多变区,利用全序列和最保守同源区分别构建系统发育树。结果表明,西方角蝇和截脉角蝇18S rDNA基因序列长度均为1 984 bp,二者同源性为96.4%,存在73个识别位点。两种角蝇与GenBank中已登陆西方角蝇的同源性分别为99.1%和95.7%。11种双翅目昆虫18S rDNA基因序列中均有三段保守程度较高的同源区,分别相当于西方角蝇18S rDNA基因序列中320 bp~693 bp,848 bp~1 181 bp和1 606 bp~1 849 bp,其中第一段同源区最为保守。本文在国内外首次报道截脉角蝇18S rDNA基因序列,并证明了西方角蝇18S rDNA基因序列高度保守。利用18S rDNA基因序列中最保守同源区构建的系统发育树,对11种双翅目昆虫分类更符合传统形态学分类结果。     

肠艾美尔球虫纯种分离及18S rDNA部分序列测定

采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫。根据GenBank中发表的肠艾美尔球虫18SrDNA序列,设计一对引物,建立PCR方法对其基因片段扩增并测序、比对。结果成功分离肠艾美尔球虫,PCR扩增出清晰条带,大小为528bp,最低能检出27个孢子化卵囊。该序列测定结果与Genebank发表的肠艾美尔球虫18SrDNA比对,相似性达98.5%。     

基于16S/18S rRNA/rDNA的分子技术在定量瘤胃微生物中的研究进展

瘤胃微生物是反刍动物与日粮间的纽带。用传统或经典的亨氏滚管法和最大似然法测定瘤胃内微生物总数的结果可能偏低。采用培养方法培养的已知菌种可能不完全适合或进入了未培养状态。由于缺少可行的方法,未知菌种从未培养过。由于任何一个细胞都含核糖体,rRNA/rDNA有进化守恒的特性,建立在16S/18S rRNA/rDNA的现代分子技术在不需要培养微生物的条件下,不仅能用于描述分子特性,而且能检测数量和提供用于预测自然进化关系的分类方法。基于不同的16S/18S rRNA/rDNA的守恒区能设计出通用、属、种甚至株特异性探针或引物,通过分子杂交能检测、量化细胞含量和测定细胞活性。杂交可得到某个序列或微生物的相对或绝对量。然而,杂交的灵敏度较低,它仅能检测出超过106个细菌/m l瘤胃液。竞争PCR和实时PCR已开发并用于检测瘤胃微生物,其灵敏度达到检测单个细菌。16S/18S rRNA/rDNA方法已成功用于瘤胃环境研究而且很快获得认可。但是基于16S/18S rRNA/rDNA的现代分子技术不能排斥经典传统微生物方法,但它将成为一项便利技术用于瘤胃微生物研究。     

18S rRNA／rDNA序列分析技术在瘤胃原虫分类学研究中的应用

作者指出了反刍动物瘤胃原虫分类学研究中的难点，介绍了原虫分类学中新兴的分子生物学指标(18S rRNA／rDNA序列同源性)，综述了18S rRNA／rDNA序列分析技术在瘤胃原虫分类研究中的应用。     

3株柔嫩艾美耳球虫28SrRNA基因部分序列的扩增与分析

本研究应用PCR技术扩增来自广东的3株柔嫩艾美耳球虫的28S rRNA基因部分序列,并与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫和刚地弓形虫虫株的相应序列进行比对分析。试验结果显示,柔嫩艾美耳球虫3个样品均获得1172 bp的28S rRNA基因部分有效序列,不同虫株序列没有差异,与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫相应序列只有一个碱基差异,显示种内序列高度保守,而与堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫、刚地弓形虫相应的序列存在不同程度的差异。结果表明,28S rRNA基因部分序列可作为研究艾美耳球虫种间及其他顶复门原虫遗传变异的标记。     

狍18S rRNA基因的克隆测序

为了研究狍与鹿种其它动物之间的系统关系和进化历史 ,用所查文献引物 ,对鹿科动物狍的 18SrRNA基因序列进行基因克隆、测序 ,序列测定测得的序列长度为 115 4bp ,并与其它鹿科动物的相应序列进行比较。同时将该序列发送到Genebank上 ,其登录号是AY6 2 6 16 1。     

牛瑟氏泰勒虫吉林株18S rRNA基因的扩增及系统发育研究

本研究根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,对寄生于牛体内的瑟氏泰勒虫基因组DNA进行扩增,得到1 356 bp的18S rRNA基因片段,测序后blast分析表明该虫种属牛瑟氏泰勒虫。将该基因片段序列与GenBank中8种已知泰勒虫的相应序列进行比较分析,建立系统发育树。结果表明,牛瑟氏泰勒虫吉林分离株与水牛泰勒虫亲缘关系最近,与小泰勒虫亲缘关系较远。这一结果说明宿主因素对泰勒虫的基因型影响较大。     

东方巴贝斯虫的18S rRNA基因的扩增及系统发育研究

利用真核生物18S rRNA基因的PCR通用引物对寄生于中国水牛的巴贝斯虫（已命名为东方巴贝斯虫-BnbPsia orientalis）基因组DNA进行扩增，得到其18S rRNA全基因片段，测序后blast分析表明该虫种属巴贝斯虫无疑。将该基因1700bp长片段序列与GenBank中15种已知巴贝斯虫的相应序列进行比较分析，建立系统发育树。结果表明，东方巴贝斯虫与南非未定种的巴贝斯虫亲缘关系最近，与羊巴贝斯虫亲缘关系较近，与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的亲缘关系较远。这一结果说明水牛东方巴贝斯虫是一独立种。     

家蚕核糖体18S RNA基因的序列分析及分子系统学研究

为研究家蚕18S DNA基因的特点及分子进化,以家蚕丝腺为材料提取家蚕基因组DNA,通过PCR扩增、测序鳞翅目家蚕(Bombyx mori)核糖体小亚基18S RNA基因(18S rDNA)的全序列,将该序列与等翅目、直翅目、衤责翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目、捻翅目、弹尾目、蜉蝣目各一种昆虫的18S rDNA进行了比较。用DNAstav软件分析并进行序列比对,结果表明,昆虫18S rDNA有4段序列较为保守,以18S rDNA比对的第2保守区段构建的分子系统发育树表明鳞翅目和双翅目、膜翅目、鞘翅目进化关系最近,等翅目、直翅目、衤责翅目进化上较为接近,捻翅目昆虫与弹尾目昆虫的亲缘关系较为接近,捻翅目在分类上应是一种古老的昆虫。     

基于16S rDNA测序分析柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠菌群的影响

为探究柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠菌群的影响,采集对照组和球虫感染组雏鸡盲肠内容物,提取DNA,16S rDNA测序分析鸡盲肠菌群丰度、多样性的变化,采用粪菌移植验证正常鸡肠道菌群对柔嫩艾美耳球虫感染的保护作用。16S rDNA测序结果显示,柔嫩艾美耳球虫感染后盲肠内菌群丰度、多样性显著降低。在门水平上,感染前,两组雏鸡盲肠的优势菌门均为厚壁菌、变形菌、放线菌;感染后厚壁菌门丰度下降,变形菌门、放线菌门的丰度上升,差异显著(P<0.05),感染组出现了拟杆菌门。在属水平上,与对照组相比,感染组鸡盲肠微生物菌群中乳杆菌属、埃希菌-志贺菌属、拟杆菌属、罗姆布茨菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、变形杆菌属丰度增加但差异不显著(P>0.05),毛螺菌科未定属、瘤胃球菌属、梭菌UCG-014、瘤胃球菌科未定属丰度显著下降(P<0.05),GCA-900066575丰度降低但差异不显著(P>0.05)。粪菌移植结果显示,与生理盐水移植组相比,盲肠内容物移植组和粪便菌移植组能显著减轻柔嫩艾美耳球虫感染后鸡增重降低的影响,减轻盲肠损伤,卵囊产量显著下降(P<0.05)。盲肠内容物...     

羊泰勒虫吉林省分离株18S rRNA基因的克隆和序列分析

为分析羊泰勒虫吉林省分离株的18S rRNA基因序列,根据羊泰勒虫18S rRNA基因的保守区序列设计1对引物,对吉林省的绵羊血液基因组DNA进行PCR扩增,结果扩增出长度为459 bp的基因片段,并成功地将该基因克隆到pMD18-T载体。将经纯化、筛选及酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,与已发表的羊泰勒虫基因序列进行比较。序列分析显示,羊泰勒虫吉林省分离株与羊泰勒虫China 1的同源性为100%。     

黄艾美耳球虫河北株18SrDNA部分序列测定及系统发育分析

为了进一步确定黄艾美耳球虫河北株虫种,试验根据GenBank中发表的黄艾美耳球虫18SrDNA基因序列设计引物,建立PCR方法对黄艾美耳球虫河北株基因片段扩增、测序,并进行系统发育分析.结果表明:扩增出大小为1 465bp的清晰条带;黄艾美耳球虫河北株18S rDNA序列测定结果与GenBank中的黄艾美耳球虫EF69...