胞内聚-β-羟基丁酸酯对苏云金芽胞杆菌营养细胞耐受性的影响

以苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）BMB171及其聚-β-羟基丁酸酯（Poly-3-hydroxybutyrate,PHB）合成基因簇（phaRBC）强化菌株BMB171＋p和PHB合成酶基因（phaC）阻断突变株BMB171-p为研究对象,系统比较BMB171及其PHB基因强化和阻断菌株之间对逆环境耐受能力（包括耐热、抗冻、抗紫外和耐饥饿）的差别。结果表明：胞内PHB能增强苏云金芽胞杆菌菌体对逆环境的耐受能力。     

实时定量PCR测定苏云金芽胞杆菌质粒pBMB67的拷贝数

根据苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520的全基因组测序结果,在内生质粒p BMB67和染色体上分别选取单拷贝片段,利用实时荧光定量PCR法测得质粒p BMB67的拷贝数为21。此外,在内生质粒p BMB67的3个不同位点设计引物,分别以不同的靶片段作为实时荧光定量PCR的检测对象,测得p BMB67质粒的拷贝数分别为20.1、21.0和21.3,表明单拷贝靶片段的选择对测定质粒的拷贝数没有影响,进一步证明了实时荧光定量PCR测定质粒拷贝数的可行性。     

在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白

 【目的】摸索提高AiiA蛋白对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力的方法。【方法】苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白，能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子。本文采用两种方式来提高AiiA蛋白的活性，即利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白在细胞表面表达该蛋白以及利用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来提高aiiA基因的表达量。为此构建该蛋白基因与细胞表面S-层蛋白的锚定区结合而成的融合蛋白基因slh-aiiA以及带有基因cry3Aa启动子的融合基因pro3A-aiiA。为了提高表达的稳定性以及去掉重组菌中非苏云金芽胞杆菌片段，本文构建了解离载体pBMB5401，并将上述两个融合基因单独或同时装入解离载体pBMB5401，分别得到重组质粒pBMBcaiiA，pBMB3aiiA和pBMB3439。转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171，随后导入温度敏感型辅助质粒pEG922，重组质粒在整合酶的作用下发生体内重组，消除了抗性基因等非必需片段。【结果】得到3个重组菌BMBcaiiAR，BMB3aiiAR和BMB3439R，在无抗性选择压力下的稳定性均在90%以上。融合蛋白SLH-AiiA及pro3A-AiiA在解离后的重组菌中得到表达，具有对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力。【结论】在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白,可增强其对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力，当同时结合两种方式来表达AiiA蛋白时效果最好。     

苏云金芽胞杆菌CT-43内生质粒pBMB0558上virD4基因的功能

苏云金芽胞杆菌CT-43高产苏云金素,其内生质粒pBMB0558上virD4基因编码的VirD4蛋白与Ⅳ型分泌系统中结合底物的偶合蛋白(T4CPs)高度同源.本研究利用插入缺失突变方法,构建同源双交换载体,敲除CT-43中的virD4基因,得到1株突变株BMB1122.HPLC检测结果显示,突变株BMB1122发酵上清...     

产生伴胞晶体的芽胞杆菌CTC菌株的16S-23SrRNA间隔区分析

根据能形成伴胞晶体的特征，芽胞杆菌CTC菌株被鉴定为苏云金芽胞杆菌幕虫亚种。但该菌株明显不同于典型的苏云金芽胞杆菌，因为其伴胞晶体蛋白并不是由杀虫晶体蛋白基因编码，而是编码细胞表面S-层蛋白基因的产物，且伴胞晶体蛋白没有检测到对昆虫的毒性。本研究基于对CTC菌株及参照菌的16S-23S rRNA间隔区、编码S-层蛋白的基因进行扩增并测序，从系统发育水平检测到CTC菌株明显与苏云金芽胞杆菌幕虫亚种典型菌株T02存在差异，表明芽胞杆菌CTC菌株更接近蜡状芽胞杆菌。     

cry1Ac基因启动子表达Vip3Aa蛋白特性分析

苏云金芽胞杆菌cry基因启动子常用于构建蛋白表达载体。为探讨苏云金芽胞杆菌cry基因启动子指导Vip3Aa蛋白表达情况及杀虫活性,以p UC19载体为基础,运用重叠引物PCR方法构建Vip3Aa11表达载体,并与由T7启动子指导的Vip3Aa11表达蛋白杀虫活性、抗胰蛋白酶稳定性比较,初步探索发酵条件。结果表明,cry1Ac启动子与T7启动子均在上清液中表达大小为88 ku Vip3Aa11蛋白,对甜菜夜蛾、棉铃虫杀虫活性差异不显著,cry1Ac基因启动子在37℃、48 h更适合Vip3Aa11蛋白的表达,为vip基因表达、功能验证及杀虫机理等研究提供新思路。     

利用细胞壁锚定蛋白MbA构建新型苏云金芽胞杆菌表面展示系统

从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)野生型菌株YBT-9602基因组中通过PCR扩增到编码一种具有细胞壁锚定活性的芽胞皮层水解酶的编码基因mbA。序列测定和编码产物结构域预测分析显示,mbA编码产物在结构上由1个具有肽聚糖结合性能的N-末端结构域和1个具细胞壁水解酶活性的C-末端结构域组成,具有作为细胞表面展示系统的运载蛋白的潜力。通过体外构建mbA与绿色荧光蛋白基因gfp的融合基因(mbA-gfp)并导入苏云金芽胞杆菌受体菌中进行表达,经对重组菌全细胞免疫荧光显微镜观测、蛋白酶pronase消化试验和SDS处理,证实GFP被成功展示于受体菌细胞表面;经流式细胞仪测定,以细菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶为靶蛋白的表面展示系统有42.97%的重组菌细胞可展示融合酶,重组菌具有13.5U/mL的全细胞酶活性。结果表明,MbA作为一种细胞壁锚定蛋白可用于构建新的苏云金芽胞杆菌细胞表面展示系统。     

苏云金芽胞杆菌及其杀虫晶体蛋白基因资源的研究进展

介绍了苏云金芽胞杆菌的一般特性、分类鉴定与分布以及其杀虫晶体蛋白基因的分类、在苏云金芽胞杆菌中的定位及鉴定方法,并对苏云金芽胞杆菌及其基因资源的应用前景作了展望.     

利用鱼粉生产中的废水培养苏云金芽胞杆菌的可行性研究

用正交试验L9(43)设计方法,对用鱼粉生产中的废水培养苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis进行了可行性试验和初步优化试验。结果表明:用鱼粉生产中的废水培养苏云金芽胞杆菌是可行的,在(28±1)℃条件下,在含有50%的鱼粉废水中添加10 g/L的水淀粉、1 g/L CaCO3、0.25 g/L MgSO4、0.25 g/LKH2PO4作为培养基培养苏云金芽胞杆菌,其数量可达2.72×109cell/mL,且芽胞脱落时间一致,脱落率为99%。     

苏云金芽胞杆菌LSZ9408菌株基因型的鉴定

利用聚合酶链式反应(PCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术鉴定苏云金芽胞杆菌LSZ9408菌株的杀虫晶体蛋白及其基因组成.PCR结果表明:苏云金芽胞杆菌LSZ 9408菌株中含有cry1和cry2两种基因型.采用5对通用引物-Un1、Un2、Un3、Un4、Un7/8进行PCR扩增,结果显示:Un1和Un2引物扩增的DNA片段大小分别为270 bp和700 bp左右,其他引物无PCR扩增产物.SDS-PAGE结果也表明:苏云金芽胞杆菌LSZ 9408菌株中含有cry1和cry2两种基因,它们编码的杀虫晶体蛋白分子量约为130 kD和65 kD.     

广西猪瘟病毒E2基因克隆及序列分析

[目的]了解广西猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的变异规律及其与疫苗株的基因差异,为正确选择猪瘟疫苗和防制广西猪瘟提供参考依据.[方法]以广西本地的阳性猪瘟病料为研究对象,应用RT-PCR扩增CSFV的E2基因,经克隆、测序后用DNASTAR软件对其序列进行比对分析,并绘制遗传进化树.[结果]从41份疑似猪瘟病料中共扩增出4个阳性样品的E2基因(1140 bp),经序列比对分析发现,扩增获得的4株CSFV毒株(GXGG1、GXLC1、GXLC2和GXNN1)与兔化弱毒株(HCLV)、Shimen强毒株的核苷酸同源性为82.1%~82.3%和82.9%~83.4%、其推导氨基酸同源性为88.4%~89.2%和88.9%~90.0%,4株毒株间的E2基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为90.8%~99.6%和94.2%~99.5%,且均属于基因群Ⅱ;E2基因推导的氨基酸表明,E2蛋白空间结构及抗原结构的氨基酸位点693Cys、737Cys、792Cys、818Cys、828Cys、856Cys、833Pro、834Thr、837Arg均未发生变异,但其单抗识别位点G713E、N729D、K734R发生变异.[结论]近年来广西CSFV流行毒株的变异未出现较大差异.与HCLV株、Shimen强毒株亲缘关系较远,但与Paderborn株、GXWZ02株亲缘关系较近.     

黑龙江省水稻纹枯病菌菌丝融合群判定及遗传多样性分析

从黑龙江省27个县市采集分离到77个水稻纹枯病菌菌株,经显微镜观察全部为多核菌株。利用载玻片定位融合法,将分离纯化得到的77个菌株分别与AG1-1A、AG1-1C、AG3、AG5、AG-6和AG-8等6个标准菌株作对峙试验。结果表明,黑龙江省水稻纹枯病菌主要菌丝融合群为AG1-1A、AG1-1C和AG-5,出现频率分别是80.51%、12.99%、2.60%。营养亲合群判别结果表明,77个待测菌株分为23个营养亲和群,其中有11个亲和群由单个菌株独立组成,出现频率为47.83%。遗传变异分析中,当遗传距离为0.6667时,从不同菌丝融合群中选取的15个代表菌株可划分为5个类群,与菌丝融合群判定结果基本一致。     

刺芹侧耳菌株遗传差异与农艺性状的评价研究

对刺芹侧耳10个菌株的遗传差异ISSR分析和子实体生长特性评价结果表明,利用ISSR的6个引物的DNA图谱经聚类分析,获得了遗传关系树状图,在相似水平为0.879时,将10个刺芹侧耳菌株分为6个类群。刺芹侧耳10个菌株的子实体在13~16℃条件下都能正常生长,但在22~27℃范围内,只有3个菌株的子实体能正常生长;根据子实体形态特征可将10个刺芹侧耳菌株分为6个类型,与ISSR分子标记聚类分类结果一致。     

攀西地区葛藤根瘤菌的RFLP遗传多样性

利用16S rDNA PCR-RFLP和16-23S IGS PCR-RFLP技术对分离自四川攀枝花的43株葛藤根瘤菌进行了遗传多样性研究。供试菌株的16S rDNA用HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和TaqⅠ酶切后具有16种遗传图谱类型。16S-23S rDNA IGS PCR-RFLP分析结果表明,在53%的相似性水平上,供试菌株与参比菌株分为两个分支,在81%的相似水平上所有菌株分为13个群。     

高效苜蓿根瘤菌的筛选

旨在利用celB基因标记技术从土著根瘤菌中筛选出与盛世苜蓿品种相匹配的有效性高、竞争性强的高效苜蓿根瘤菌株。从四川雅安、重庆北碚、万州采集野生苜蓿根瘤,采用平板划线法分离纯化获得93株纯菌株,通过与盛世品种在无氮水培液中进行结瘤试验和有效性分析并结合菌株的地理来源,初筛出了与对照相比有效性较高的4株苜蓿根瘤菌,分别为Y6-1-1、BB1-8-1-1、BB2-2-1-1和WZ-6-2-2。进一步利用celB基因标记技术对这4株菌进行竞争性研究,通过供体大肠杆菌HAMBI2356与根瘤菌接合的方法成功地将celB基因导入4个菌株中,对标记基因可能会对标记菌株产生的影响进行检测,结果表明标记基因在标记菌株内能稳定传代,而且对标记菌株的生长、竞争性及有效性都没有显著影响,从而证明celB基因标记技术可以作为一种简便、直观而又有效的检测手段用于追踪根瘤菌株在土壤中的竞争性。进一步通过田间试验比较分析标记菌与土著菌的竞争结瘤能力和固氮有效性,结果表明Y6-1-1、BB2-2-1-1、WZ-6-2-2与对照相比在占瘤率、瘤重、总瘤数上差异显著,占瘤率都在72%以上,显著提高了植株的干重、叶绿素含量、全氮量和产量,其中WZ-6-2-2的有效性最高、竞争性最强,可以用于苜蓿盛世品种的接种。     

PBAT地膜降解菌的筛选及其降解特性研究

为了得到能够高效降解聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯(PBAT)地膜的菌种资源,以PBAT塑料地膜为主要研究对象,从长期存在塑料的环境中分离筛选塑料降解菌,共得到6株潜在PBAT塑料降解菌,通过对PBAT降解性能进行测定,筛选出两株高效的PBAT降解菌株Pseudomonas sp.RD1-3和Pseudomonas sp.N1-2。在28℃条件下降解8周后,菌株RD1-3和N1-2对PBAT的降解率分别为6.88%±0.06%和6.49%±0.01%。两株菌能使PBAT塑料膜片的表面粗糙程度增加并出现大量沟壑、坑洞及褶皱。此外,两菌株降低了PBAT塑料膜片表面的疏水性,同时向膜片稳定的化学结构中引入—C≡N、—C=C—以及—OH等新的极性官能团。研究初步认定菌株RD1-3以及N1-2对PBAT均具有较好的降解能力。     

gusA基因检测慢生花生根瘤菌竞争性的研究

采用大肠杆菌和根瘤菌接合的方法,将gusA标记基因分别导入了2株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中。结果表明,gusA基因在2株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中可以有效表达;对出发菌株和标记菌株的代时测定结果表明,二者之间没有显著差异;在标记菌株与出发菌株等量接种的前提下,比较了二者的竞争结瘤能力,结果表明,标记菌株形成的根瘤(蓝瘤)的占瘤率与出发菌株差异不显著;为了研究标记菌株与出发菌株的固氮有效性,测定了标记菌株与出发菌株各自共生植株的干重、全氮和叶绿素含量,结果表明,标记菌株与出发菌株的这3项指标之间没有显著差异。这说明利用gusA基因研究慢生根瘤菌的竞争结瘤能力是可行的。     

中早熟马铃薯品种(系)遗传多样性ISSR分析

【目的】采用ISSR分子标记研究中早熟马铃薯品种(系)的亲缘关系及遗传多样性,为南方冬作区中早熟马铃薯育种亲本选择提供参考。【方法】利用筛选的8条ISSR引物,对33份广西各地应用的马铃薯品种(系)进行遗传多样性分析。【结果】8条引物共扩增出46条条带,其中有29条呈多态性,平均多态性带比率为63.0%。33份马铃薯品种(系)的遗传相似系数在0.63045~1.00000,平均相似系数为0.80967。聚类分析结果表明,在相似系数0.79000附近,33份马铃薯品种(系)可分为四大类,第一大类有4个品种(系),分别是DE03-34-6、JL03-786、中薯19号和中薯18号;第二大类仅有中薯6号;第三大类包括龙脊1号和DE03-79-1两个品种(系);余下的26份品种(系)聚为第四大类。在分类中,部分亲缘关系较近的品种如中薯13号和中薯14号、中薯18号和中薯19号可聚为较近的一类,说明ISSR分子标记能够正确地按马铃薯的亲缘关系进行分类。【结论】供试马铃薯品种(系)间存在较丰富的遗传多样性,可根据聚类分析结果中的遗传距离选择亲本,为南方冬作区中早熟马铃薯育种亲本的选择和杂种优势利用提供参考。     

运用随机扩增多态性和质粒指纹图谱法进行大肠杆菌O157的分子多态性分析

为了解大肠杆菌O157分离菌株的分子特征,建立了随机扩增多态性和质粒指纹图谱2种分型方法,对10株从粪便和动物组织分离的大肠杆菌O157进行了分型研究,结合主要毒力基因的检测和药敏试验,以进一步验证分离菌株之间的亲缘关系.随机扩增多态性分析分别在遗传距离为0.89、0.973处将所有细菌分类:其中有2株菌株具有相似的扩增图谱,可以聚为同一类,亲缘关系较近,其余8株细菌类聚为两大类.质粒图谱分析在不同的进化距离处将所有细菌分类,形成具有复杂分枝的树状图.毒力因子检测结果显示:10株分离菌株均含有hly、eae、uid、flich7基因.药敏试验幸明:其中2株细菌具有不同于其他8株细菌的耐药谱,与随机扩增多态性分析和质粒图谱分析相一致.比较随机扩增多态性和质粒指纹图谱2种分型方法发现:它们虽具有相似的结果,但质粒图谱法分析更能反映出菌株之间的亲缘关系.     

山东省35个黑灰色平菇菌株的酯酶同工酶分析

对山东省大规模栽培的35个平菇商业菌株运用酯酶同工酶电泳技术进行分析。结果表明,35个菌株有30个酶谱类型,不同菌株有各自特有的酯酶同工酶酶谱。聚类分析表明,供试菌株在70%相似水平上分为4大类:第一类包括以黑丰268为代表的8个菌株;第二类包括以2002-4为代表的4个菌株;第三类包括以超级99为代表的7个菌株;第四类包括以庆丰518为代表的16个菌株,多为杂交菌株。