牛病毒性腹泻BVDV2/JZ05-1活疫苗最小免疫剂量及攻毒保护试验

本试验对牛病毒性腹泻病毒BVDV2/JZ05-1活疫苗对犊牛最小免疫剂量及攻毒保护效果进行了研究。对BVDV2/JZ05-1活疫苗进行倍比稀释后免疫犊牛,在免疫后第28天用BVDV/JL-1强毒株进行攻毒保护试验研究。结果表明,牛病毒性腹泻病毒BVDV2/JZ05-1活疫苗对犊牛的最小免疫剂量是105.0TCID50/mL。     

牛传染性鼻气管炎IBRV/JZ06-3基础毒株的安全性和免疫原性研究

本试验旨在对牛传染性鼻气管炎病毒IBRV/JZ06-3基础毒株犊牛免疫的安全性和免疫原性进行评价。通过犊牛颈部肌肉接种IBRV/JZ06-3弱毒活疫苗,考察该毒株的单剂量、超剂量、单剂量重复安全试验和免疫原性试验效果。结果证实,在安全性试验中用IBRV/JZ06-3基础毒株接种犊牛后未出现典型临床感染症状,证明对犊牛免疫是安全的;免疫原性研究中,血清抗体检测接种病毒含量分别为106.0TCID50/m L、105.0TCID50/m L的疫苗时,免疫后28d血清抗体能达到1∶512以上,用强毒株攻毒后,保护率均为100%,对犊牛有很好的免疫原性。     

牛病毒性腹泻病活疫苗BVDV2/JZ05-1株毒力返强试验

研究了BVDV2/JZ05-1株免疫犊牛后是否会出现毒力返强现象.以病毒含量为10-7.26 TCID50/mL的BVDV2/JZ05-1活疫苗滴鼻免疫犊牛(4mL/头),通过疫苗回滴,连续临床观察,采集抗凝血和鼻拭子,对淋巴细胞数量变化进行分析,并从淋巴细胞和鼻拭子中分离病毒.结果表明,BVDV活疫苗BVDV2/JZ05-1株免疫犊牛没有出现BVDV感染的临床症状,淋巴细胞数量正常,鼻拭子和淋巴细胞病毒分离阴性.可见,该毒株对犊牛免疫没有出现毒力返强的现象.     

牛病毒性腹泻病二价弱毒活疫苗制备工艺研究

研究了BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3二价弱毒活疫苗的制备工艺。通过对BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3疫苗毒传代培养测定毒价后,试制出5批毒价分别是105.4TCID50/mL和105.6TCID50/mL的BVDV二价弱毒活疫苗,经检验符合试验设计要求。     

牛传染性鼻气管炎IBRV/JZ06-3基础毒株毒力返强试验

对IBRV/JZ06-3基础毒株免疫犊牛后是否会出现毒力返强现象进行了研究。以4m L/头病毒含量为107.4TCID50/m L的IBRV/JZ06-3弱毒活疫苗滴鼻免疫犊牛,通过疫苗回滴毒力测定、连续临床观察、采集鼻拭子分离病毒进行分析结果表明,IBRV/JZ06-3基础毒株免疫犊牛后没有出现传染性鼻气管炎病毒感染的临床症状,从鼻拭子中未分离出病毒,可见该毒株对犊牛免疫后没有出现毒力返强现象。     

仔猪大肠埃希氏菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的效力和安全试验

将带有K88、K99和987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株(C83549、C83644和C83710)和免疫原性良好的C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C)菌株(C59-2、C59-37和C59-38)第10代基础种子制备的原液进行浓缩、甲醛溶液灭活和脱毒后,按抗原含量,加氢氧化铝胶制成3批二联灭活疫苗。经过对免疫怀孕母猪所产仔猪的攻毒测定,得到疫苗最小的免疫剂量为每头2mL,确定使用剂量为每头4mL。疫苗的免疫攻毒试验结果表明,疫苗在怀孕母猪中采用颈部肌肉注射进行免疫,二次免疫才能使仔猪通过吮吸初乳获得80%以上的被动免疫保护能力,与单苗具有相似的免疫保护力;单剂量、单剂量重复和超剂量的安全性试验结果显示,3批二联灭活疫苗不会引起母猪的全身不良反应和明显的局部反应,无流产,胎儿发育完全正常。     

BVDV/IBRV主要抗原表位E2/gD基因串联表达及免疫原性

为开发研制牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV)及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的联合亚单位疫苗,开展了BVDV E2蛋白、IBRV gD蛋白主要抗原表位串联表达及免疫原性研究。利用2步PCR法获得E2-gD基因,构建原核表达载体pET28a-E2-gD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达,BCA工作盒测定纯化蛋白浓度为2.69 mg/mL;Western-blot结果显示其具有作为免疫原的特异性;免疫家兔制备抗血清,血清中和试验结果表明,中和抗体效价为44.7(IBRV)/22(BVDV)。这说明E2-gD蛋白免疫原性较好,可诱导产生较高效价的中和抗体。     

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株动物回归试验

【目的】自流产奶牛粪便及血液中分离得到的非细胞病变型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV),为了解分离毒株的特性,进行回归动物试验;【方法】将此分离毒回归2月龄健康犊牛,接毒25天后扑杀剖检,观察临床症状及病理变化。自犊牛体内采取脾、骨髓、肠淋巴结及血液接种MDBK细胞进行培养,分离病毒,进行细胞传代,将此细胞毒进行RT-PCR检测;【结果】犊牛表现为典型的急性病毒性腹泻症状和病变。自病料分离病毒经MDBK细胞盲传至第9代,均未出现细胞病变。将此细胞毒进行RT-PCR检测,扩增出相应的665bp的片段;【结论】将分离株接种易感犊牛以复制出BVD-MD病症,并从试验牛体内分离得到BVDV,从而进一步确证分离到的毒株属BVDV。     

我国3种犊牛腹泻病原体调查汇总分析

为了解和掌握我国犊牛腹泻的病因,文章对2017—2022年涉及BVDV、BRV、BCo V 3种病原体引起犊牛腹泻的国内调查文献数据进行汇总分析,旨在找出这3种病原体在腹泻犊牛中的流行规律,用以指导犊牛腹泻的临床防治工作。结果表明,（1）犊牛BVDV的病原学阳性率为0～34.58%,平均阳性率为14.61%;血清学阳性率为18.75%～65.00%,平均阳性率为47.28%;分别累计不同类别样品（粪便或肛拭子、血液）、腹泻牛与非腹泻牛样品的BVDV病原学检测数据,免疫牛与非免疫牛的BVDV病原学与血清学检测数据,发现上述各组的检测数据均存在极显著差异。（2）犊牛BRV的病原学阳性率为0～56.74%,平均阳性率为10.42%;腹泻牛与非腹泻牛样品的累计检测数据存在极显著差异;犊牛BRV的血清学阳性率为0～25.00%,平均阳性率为15.15%(5/33);各组犊牛的BRV病原学和血清学累计的检测数据无显著差异。（3）犊牛BCoV的病原学阳性率为0～33.33%,平均阳性率为12.87%;血清学阳性率为0～25.00%,平均阳性率为9.09%;各组腹泻牛与非腹泻牛样品的BCoV病原学和血...     

新城疫病毒JZ05株F基因重组pGAPZα的构建

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株,基因F1片段和F2片段,以核酸内切酶κpnI和XbaI对目的基因片段及质粒pGAPZαA进行酶切,连接酶切产物,转化Eacterium coli DH5α.以PCR方法确定JZ05 F1的阳性重组子为2个,JZ05 F2的阳性重组子为4个.对阳性重组子进行酶切鉴定及序列分析,结果发现,重组质粒pGAPZαA-F1、pGAPZαA-F2及质粒pGAPZαA的酶切电泳条带与试验设计大小相符;基因测序得到的重组子中F1和F2序列长度分别为1198bp、269bp,与新域疫病毒JZ05株F基因序列比对,其序列长度和核苷酸排列完全一致.这表明重组质粒中目的基因片段的核苷酸序列、大小和插入位置是正确的,为以酵母表达系统表达F1和F2、研究强毒株与弱毒株F蛋白的抗原性差异程度及研制重组亚单位疫苗打下了基础.     

牛病毒性腹泻病毒反转录及3'-末端克隆测序方法研究

牛病毒性腹泻病毒为黄病毒科瘟病毒属代表种,其基因组为单股正链RNA,无Poly(A)尾。传统的3'-末端快速扩增方法不适用于牛病毒性腹泻病毒的3'-末端克隆测序。本研究根据牛病毒性腹泻病毒基因组3'-末端共有特征碱基,设计回文锚定引物CGend。以BVDVJZ05-1毒株为研究对象,进行了反转录及3'-末端克隆测序。结果表明,CGend的反转录效果优于随机引物和一般特异性下游引物,并且扩增得到了JZ05-1的3'-末端完整序列。本研究为瘟病毒属病毒反转录和3'-末端克隆测序提供了新思路。     

芽孢杆菌复合菌群的构建及其对野燕麦除草活性研究

【目的】构建芽孢杆菌复合菌群,优化菌群组合并研究其杀草谱、作物安全性及对野燕麦的除草活性,为开发新型生物除草菌剂提供新思路和理论依据。【方法】以课题组前期筛选到的芽孢杆菌D30202、JZ1-1-9、JZ2-4-15和JZ2-2-1为材料,采用皿内对峙试验测定菌株间的相容性,并结合分光光度法测定菌株生长曲线,确定构建复合菌群的菌株和组合时期;通过种子萌发袋法测定复合菌群对杂草种子萌发的根长、芽长抑制率和干重、鲜重抑制率以优化菌株组合类型;采用盆栽试验对最优组合菌群进行杀草谱及作物安全性评价,测定作物叶片丙二醛（MDA）含量,超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）3种防御酶活性作为对野燕麦除草活性反应的指标。【结果】待选菌株两两之间无拮抗关系且生长周期一致,由菌株D30202、JZ1-1-9和JZ2-4-15构建的复合菌群2-9-15为最优组合。菌群2-9-15抑制野燕麦种子萌发和幼苗生长的综合效果最明显,根长和芽长抑制率分别为39.17%和73.49%,幼苗鲜重和干重抑制率分别为25.11%和21.26%。盆栽试验结果显示,菌群2-9-15的除草广谱性及作...     

抑制马铃薯干腐病菌的活性酒糟菌筛选、鉴定及抑菌活性测定

【目的】明确来源于青稞酒糟的菌株对马铃薯干腐病病原菌的抑菌活性,为马铃薯保鲜菌剂及生防制剂的开发和利用提供科学依据。【方法】采用平板对峙法对分离自青稞酒糟的40株菌株进行抑制马铃薯干腐病病原菌（青9A-7-5、青9A-8-8、青9A-5-3和青9A-6-2）活性测定,从中筛选活性菌株并进行活性菌株稳定性评价;采用牛津杯法对活性菌株发酵液萃取物进行抑制马铃薯干腐病病原菌活性测定及稳定性评价;通过形态学、生理生化特征及分子生物学方法对活性菌株进行鉴定。【结果】通过平板对峙法从40株青稞酒糟菌株中筛选出8株（菌株JZ2c24、JZ3d09、JZ3c08、JZ2b13、JZ1-4-10、JZ1-1-1、JZ1-1-9和JZ1-4-1）对马铃薯干腐病病原菌具有较高抑菌活性的菌株,其中,菌株JZ1-1-1对病原菌青9A-7-5的抑菌活性稳定,其抑菌带缩小率为25.42%,菌株JZ1-1-9对病原菌青9A-6-2的抑菌活性稳定,其抑菌带缩小率为26.20%;在浓度为50.00 mg/mL时,菌株JZ1-1-1的发酵液水相萃取物溶液对马铃薯干腐病病原菌青9A-7-5的抑菌活性较高,其抑制中浓度（EC₅₀）为19.16 mg/mL,菌株JZ1-1-9的发酵液水相萃取物溶液对马铃薯干腐病病原菌青9A-6-2的抑菌活性较高,其EC₅₀为20.80 mg/mL,且菌株JZ1-1-1的发酵液水相萃取物溶液最稳定。结合菌落形态、生理生化特征及分子生物学鉴定结果,将菌株JZ1-1-1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。【结论】来源于青稞酒糟的贝莱斯芽孢杆菌菌株JZ1-1-1具有作为马铃薯保鲜菌剂及生防菌剂的潜力。     

补饲对放牧西门塔尔犊牛生长性能及血液指标的影响

为研究放牧加补饲对西门塔尔犊牛生长性能和血液指标的影响,选取内蒙古赤峰草原的放牧犊牛16头,分为放牧组和放牧加补饲组,测量体重、体尺等生长性能指标,用酶联免疫法测定血清中总蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、葡萄糖(GLU)、白介素1(IL-1)和白介素2(IL-2)等血液指标。结果表明:1)在正试期的0~30 d 2组犊牛的日增重无显著差异(P>0.05),但在31~60 d放牧加补饲组犊牛日增重显著高于放牧组(P<0.05);在整个试验阶段,放牧加补饲犊牛体尺指标除胸围外,均高于放牧组,但差异不显著(P>0.05)。2)放牧加补饲使犊牛血清中尿素氮(BUN)和葡萄糖(GLU)含量显著提高(P<0.05);而总蛋白(TP)和甘油三酯(TG)含量差异不显著(P>0.05)。3)放牧加补饲犊牛免疫球蛋白G(IgG)和白介素1(IL-1)含量显著升高(P<0.05);而三碘甲状腺原氨酸(T₃)、甲状腺素(T₄)、生长激素(GH)和白介素2(IL-2)含量有高于放牧组的趋势,但差异不显著(P>0.05)。综上,补饲可提高放牧西门塔尔犊牛的生长性能,改善血液生化指标和血清激素水平,并可改善西门塔尔犊牛整体免疫水平。     

牛病毒性腹泻病毒地方株的分离与鉴定

从河南省不同地区规模化肉牛场牛病毒性腹泻 (BVD)疑似病例中采集病料 ,将处理好的 6份病料接种MDBK细胞 ,并盲传 4代 ,得到了 2株可产生细胞病变的病毒。 2株病毒的TCID50 分别为 10 - 5.59和 10 - 5.51;琼脂扩散试验表明 ,2株病毒均能与牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)OregonC2 4 标准阳性血清反应 ,出现沉淀线 ;中和试验表明 ,2株病毒均能被BVDV标准阳性血清中和 ,中和指数分别为 10 3.30 和 10 3.16 ;电镜观察到圆形 ,直径为 4 0～ 6 0nm ,有囊膜 ,囊膜表面有突起的病毒粒子 ,与BVDV颗粒基本一致。因此 ,确定分离的 2株病毒均为BVDV ,分别将其命名为HN - 1株和HN - 2株。     

一株新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以PCR扩增新域疫病毒JZ05株的F基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株,基因与另外18个NDV毒株F基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明.NDV JZ05株F基因产物F0蛋白酶裂解位点(111~117位)的氨基酸序列为GRRQKRF.与18个NDV毒株F蛋白的氨基酸序7,1对比,半胱氨酸残基数目和位置完全一致;仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有5处;而其F蛋白细胞融合活性位点中的一些保守氨基酸残基都没有发生变更.10个毒株(Ch98、Ch2000、YN、JZ05、JS01、GD05、SCL03、SSX03、Lye01、TW)之间全长氨基酸序列的同源性均在96%以上,这10个毒株与3个疫苗毒株(LaSota、B1、Clone30)的同源性在88.07%～89.51%.     

一株牦牛源牛病毒性腹泻病毒毒株的分离鉴定及其遗传特性分析

通过病毒分离培养技术,从牦牛血清中分离获得一株致细胞病变的牛病毒性腹泻病毒(BVDV),命名为GSTZ毒株。经电镜观察,GSTZ毒株的直径在50～60 nm。按Karber法测算,该病毒滴度为5.0×10^6.5 mL^-1[以组织半数感染量(TCID₅₀)计]。利用反转录PCR(RT-PCR)测定GSTZ毒株的完整开放阅读框(ORF),全长11 691 nt,将其与参考毒株ORF在核酸序列和同义密码子使用模式等方面进行分析,确定GSTZ毒株在遗传学特性上属于基因1型家族成员。在GSTZ毒株的完整ORF中,A+U的出现频率要高于G+C,而且,病毒同义密码子的使用模式体现出对U/A结尾同义密码子使用偏嗜性高的遗传学特征。GSTZ毒株明显降低了使用含有CpG二联核苷酸的同义密码子的频率。这有助于降低病毒对宿主细胞免疫系统的刺激强度,从而促进病毒的复制增殖。研究成果可为进一步研究BVDV的相关分子机制提供试验材料,并为BVDV不同基因型的抗原关系分析与BVDV疫苗的研制奠定基础。     

牛病毒性腹泻病毒Core蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的Core蛋白及其多克隆抗体,根据Core蛋白的编码基因序列,设计合成一对特异性引物,利用RT-PCR扩增BVDV Core基因并定向插入Pet30a载体中,构建重组质粒Pet30a-Core,经酶切鉴定后转化大肠埃希菌TOP 10感受态细胞,筛选获得阳性重组菌,以IPTG进行诱导后成功表达出分子质量为20 ku的重组Core蛋白。将诱导表达的蛋白产物经融合蛋白的Ni柱亲和法进行纯化,利用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA法测出多克隆抗体效价达到1∶512 000。蛋白质印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)证实,多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的免疫原性和特异性。本实验成功制备了BVDV重组Core蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV的检测及其Core蛋白功能研究奠定了基础。