西瓜噬酸菌吡哆醛磷酸(VB6)营养缺陷型与致病性相关

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起的一种病害,严重为害西瓜、甜瓜的叶片和果实,造成大量减产.迄今,对该病害的研究主要集中在病原菌鉴定、病原菌检测技术、病害防治方法、品种抗病性鉴定等方面,而对病原菌的致病机理仍然知之甚少.本实验以西瓜噬酸菌xjl12菌株为背景构建转座子(mini-Tn5)插入的突变体文库,以哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)为实验材料,通过对哈密瓜种子浸种处理和子叶注射接种的方法筛选突变体,而后利用同源重组的方法获得插入突变体,并对所得的突变株及野生型、互补等各个菌株进行致病性、游动性等相关表型进行测定.研究结果表明,通过文库筛选得到的1株致病力明显下降的突变体,亚克隆鉴定可知该突变体△xj-25的Mini-Tn5插入位点为吡哆醛磷酸生物合成蛋白基因(pdxJ基因),其功能主要与吡哆醛磷酸(俗称VB6)生物合成蛋白相关.突变菌株△Pdx.J致病性显著下降,生长能力、游动性明显降低,无法正常形成鞭毛和产生生物膜.通过外源添加VB6可恢复其致病性和生长能力等主要表型.本研究证明VB6生物合成在致病性、生长能力以及鞭毛的合成等方面发挥着重要作用,为降低病原菌侵害提供了一个新的思路.     

西瓜嗜酸菌双精氨酸转运系统基因(tatB)功能分析

细菌双精氨酸转运系统(twin-arginine translocation system,Tat)可严重影响动植物病原细菌的致病性,为了研究Tat与西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)致病性的关系,本研究通过同源重组的方法构建了西瓜嗜酸菌的tatB基因缺失菌株(ΔtatB)以及互补菌株(CtatB),并从西瓜嗜酸菌致病能力、游动能力、生长能力、胞外多糖与胞外纤维素酶产生能力以及生物膜形成等方面阐明Tat系统对西瓜嗜酸菌的影响。实时荧光定量PCR探究tatB基因与Ⅲ型分泌系统相关基因(hrcN)和(hrpE)、Tat转运系统相关基因(Aave_1810)和(Aave_0034)以及细胞毒性相关基因(TrbC)的关系。结果表明,ΔtatB能够引起非寄主植物烟草(Nicotiana tabacum)的过敏性反应;tatB基因的缺失导致了嗜酸菌的致病力、游动能力和对数生长初期的生长能力下降;不影响西瓜嗜酸菌胞外多糖、胞外纤维素酶的产生以及生物膜的形成;导致了TrbC和hrcN基因表达量显著升高,Aave_1810、Aave_0034和hrpE基因的表达量显著降低。研究结果表明,Tat系统相关基因tatB的缺失会影响西瓜嗜酸菌一些生物学特性,并导致病菌致病能力降低。本研究为西瓜嗜酸菌Ⅲ型分泌系统外的其他分泌系统与致病性的关系研究提供了基础资料。     

应用抑制性差减杂交法筛选植物青枯菌致病相关基因

植物青枯菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化菌株 Po82 兼具 2 号小种和 NPB(非香蕉致病)菌株的致病特征。为了研究该菌株致病力分化机理,本实验以 Po82 为待测菌株,构建了抑制性差减杂交文库。建库质量分析结果表明,具有较高的接头连接以及文库构建效率,插入片段平均长度为 300 bp,文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序,共筛选出 44 个 Po82 菌株差异基因。生物信息学分析结果表明,所得差异基因主要涉及新陈代谢、转座酶、膜结构、分泌蛋白、毒力、转录因子以及未知功能等。利用基因敲除技术对其中的 c00283 基因功能进行了研究,结果表明,该基因在 Po82 菌株致病过程中起重要作用。半定量 RT-PCR 结果表明,c00283 基因在 hrp 诱导培养基中的表达情况与 hrpB 基因一致,初步确定其为Ⅲ型分泌系统效应子。基础生物学实验结果表明,该基因对 Po82 菌株的生长、生物膜形成及运动性没有影响。青枯菌 Po82 菌株抑制性差减杂交文库的构建及致病相关基因的功能分析,为后续致病力分化的分子机理研究提供基础材料。     

梨火疫菌(Erwinia amylovora)环腺苷酸受体蛋白基因(crp)的功能分析

梨火疫菌(Erwinia amylovora)可引起梨、苹果等蔷薇科(Rosaceae)植物的火疫病.在菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)中,由crp基因编码的环腺苷酸受体蛋白(cyclic adenosine monphosphate(cAMP)receptor protein,CRP)对果胶酶基因的表达调控和菌株致病性起着重要的作用.本研究首次鉴定并克隆出梨火疫菌中的crp同源基因,命名为Eacrp,并通过同源重组的方法,构建了梨火疫菌的crp基因突变体Ea△crp以及互补子,进行了致病性、过敏性反应、胞外多糖、鞭毛运动等一系列相关表型的鉴定.结果表明,crp基因影响着梨火疫菌的致病性、胞外多糖、游动性、生长情况等多种生物学特性,然而,Ea△crp仍能引起烟草过敏性反应,并且在过氧化氢敏感度以及沉降性、生物膜和AI-2信号分子的生成方面与野生型菌株相比差异明显.本研究结果说明,梨火疫菌crp基因对病菌的胞外多糖分泌、生长、游动性以及致病性方面具有关键作用.     

青枯菌Ⅱ型分泌系统编码基因的克隆

植物青枯菌Ⅱ型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关.编码青枯菌(Ralstonia solanacearum)Ⅱ型分泌系统的gsp基因簇由12个基因组成,通过设计适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系,成功克隆了编码青枯菌Ⅱ型分泌系统的全部12个gsp基因.分别将gsp基因连接到酵母双杂交系统的诱饵及捕获载体上,构建了gsp基因诱饵库和捕获库.经序列测定证明12个gsp基因读框正确,保障了其在酵母系统中的表达.     

F18菌毛粘附素F基因(fedF)在大肠杆菌中的表达及对小鼠的免疫保护效果

引起早期仔猪断奶腹泻(PWED)的主要致病菌是产肠毒素型大肠杆菌(ETEC),免疫预防是防治腹泻最主要的手段。本研究采用通过大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组F18菌毛粘附素F(FedF)作为抗原,在小鼠(Mus musculus)中探索以此为靶标免疫防治仔猪腹泻的可能性。根据相应F18菌毛粘附素基因(fedF)设计了一对添加EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以E.coli F18为模板扩增出全长908bp含20个信号肽序列的fedF片段,并与原核表达载体pET-30a(+)连接,导入大肠杆菌BL21,得到基因工程菌E.coli[pET-fedF],后经IPTG诱导及菌液蛋白电泳分析,结果表明,大小约为32.9kD的重组蛋白FedF可成功诱导表达;将重组工程菌口服免疫BALB/c小鼠,可有效地诱导小鼠血清中FedF特异性IgG的产生(P/N值>2.0)及小鼠肠粘膜sIgA显著增加了2.07倍(与空载体组pET-30比较)(P<0.05);攻毒试验表明,口服基因工程菌E.coli[pET-fedF]可显著地有效保护小鼠免予攻毒死亡,免疫保护率可达62.5%。研究结果提示,FedF黏附蛋白基因工程菌可通过口服诱导小鼠特异的体液和粘膜免疫反应,以此保护小鼠免受产肠毒素型大肠杆菌的进攻,因而有望作为一种口服疫苗防治产肠毒素型大肠杆菌引起的仔猪腹泻。     

重庆缙云山3种典型林分对酸沉降的作用机理

以缙云山3种典型林分为研究对象,分别收集大气降水、穿透水、枯落物层滤液和壤中流,研究3种典型林分不同层次对酸沉降的缓冲作用。结果表明:(1)缙云山降水酸性较强,pH=4.57,SO24-/NO3-=9.78,酸雨类型为典型的硫酸型酸雨。(2)酸雨对于盐基离子的淋溶以Ca2+淋溶量最大,Na+、K+分别在林冠层和土壤层表现为吸附现象,NH4+在林冠层表现为淋溶,在枯落物层和土壤层表现为吸附。(3)森林生态系统主要通过盐基离子与降水中H+发生交换作用,从而降低降水的酸度,3种林分的酸缓冲能力大小顺序为毛竹林>针阔混交林>阔叶林。同一林分,不同层次的缓冲能力大小为土壤层>枯落物层>林冠层。(4)淋滤液的pH值与酸根离子与盐基离子比值(k)呈显著负相关关系(r=-0.918,p<0.01),k值越大,说明酸雨状况越严重。     

沼液处理对土壤微生物性状及西瓜枯萎病发生的影响

采用室内盆栽模拟的方法,研究了沼液保湿和淹水处理对马肝土和潮土微生物性状的影响以及对西瓜枯萎病的防效。结果表明,沼液处理土壤21 d对西瓜枯萎病的防效和病原菌的消减效果较好。两种土壤中,铵强化沼液淹水处理西瓜枯萎病发病率均最低。沼液保湿处理发病率平均比对照降低15%。马肝土中,铵强化沼液淹水处理尖孢镰刀菌数量最少;潮土中秸秆沼液淹水处理对病原菌数量的消减效果最好。沼液处理提高了土壤可溶性有机碳、氮含量以及荧光素二乙酸酯酶活性,其中沼液淹水处理提高幅度更大。对各处理Biolog-ECO板孔平均颜色变化的主成分分析表明,沼液淹水处理、沼液保湿处理的微生物群落结构与水保湿对照处理有明显差异。沼液淹水和铵强化沼液淹水处理能提高土壤微生物功能多样性指数,秸秆沼液淹水处理则显著降低土壤微生物功能多样性指数。     

瓜类细菌性果斑病菌过敏性反应和致病性(hrp)基因簇部分基因的克隆及功能分析

过敏性反应和致病性(hrp)基因存在于革兰氏阴性植物病原细菌中,决定病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病植物过敏性反应(hypersensitive response,HR)。本研究从果斑菌(Acidovorax avenaesub sp.citrulli)的hrp基因簇中克隆了hpaA、hrcT、hrcC和hrpG基因,通过同源重组的方法,分别构建了其突变体。电镜观察发现,hpaA和hrpG基因突变体的鞭毛缺失且细胞形态发生显著变化,而hrcT和hrcC基因突变体的鞭毛和细胞形态未发生明显变化。在烟草(Nicotiana tabacam)和哈密瓜(Hami cantaloupe)叶片上的测定结果显示,hpaA、hrcT和hrcC的突变体均失去在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜叶片上的致病性;hrpG在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜上的致病性则显著减弱;进一步的生长曲线测定结果表明,hpaA、hrcT、hrcC和hrpG的突变体的定殖能力均显著下降。相应地,功能互补后突变体基本恢复至野生表型。证明瓜类细菌性果斑病菌hrp基因作为Ⅲ型分泌系统关键组份影响病原细菌对寄主植物的致病性和对非寄主及抗病植物的过敏性...     

洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19嗜铁素合成相关基因cepR的克隆及生物信息分析

本研究采用PCR方法克隆了洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19嗜铁素合成相关基因cepR,并对cepR基因编码蛋白的结构和功能进行生物信息学分析和预测。同源性分析表明,CAS19的cepR核苷酸序列与Burkholderiacepacia LMG1222cepR基因的同源性为99％;cepR基因全长768bp,包含一个完整的231bp的开放阅读框架,编码239个氨基酸;该基因编码蛋白分子量为26．59kD,理论的等电点为5．55,含有一个LuxR型HTH结构域,在氨基酸残基的不同区域分布有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点和N-糖基化位点,还有一个明显的跨膜结构。本研究结果将为洋葱伯克霍尔德氏菌嗜铁素合成相关研究提供调控基因信息和参考依据,并为其进一步开发和利用奠定基础。     

一株根际解磷菌的筛选鉴定及促生作用研究

磷在植物生长发育过程中起着重要的作用。为获得优质的解磷促生菌,以北京平谷桃园根际土壤为原料,从中筛选具有较高解磷促生能力的菌株。通过平板试验初筛可产解磷圈的菌株,再进行液态培养,采用钼锑抗比色法测定其最大的解磷能力,并探索菌株解磷能力与pH变化的关系,同时借助盆栽试验研究其促生特性。从桃树根际土共分离筛选出3株解磷菌,编号分别为JP01、JP03和PG62,初步鉴定分别为黑曲霉、杰氏假单胞菌和苍白杆菌。其中,黑曲霉JP01解磷能力优异,其溶解磷酸三钙的能力为112.52 mg/L,对卵磷脂的转化量为145.50 mg/L,最大解磷矿粉能力为95.74 mg/L,在培养过程中,该解磷菌对应的培养液pH显著下降。盆栽试验表明,黑曲霉能增加玉米幼苗株高、茎粗和地下部干重,还可使植株全磷含量增加。本研究结果可为开发解磷微生物菌剂提供优良的菌株资源。     

小麦生理型雄性不育花药中能量相关基因的表达

为揭示小麦(Triticum aestivum L.)生理型雄性不育机理,以化学杂交剂SQ-1为诱导剂,构建了普通小麦西农1376不育和可育生理系,用RT-PCR技术分析了3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和NFUDP4基因在不同发育时期的不育和可育花药中的表达差异.结果表明,与同期对照相比,GAPDH和NFUDP4基因在不育花药单核期到三核期均下调表达,其中在大量花粉粒败育的单核期,GAPDH下调表达尤为显著.因此,小麦生理型雄性不育花药败育过程中,一方面由于GAPDH基因表达受抑制,使糖酵解受阻导致能量供应不足;另一方面,NFUDP4基因下调表达,可能引起线粒体某一Fe-S族蛋白装配需要的分子骨架减少而使其数量不足,从而可能引起Fe-S族蛋白参与的生化反应减弱,如呼吸链电子传递受阻引起能量供应不足,与小麦生理型雄性不育具有一定关系.     

菌槺对土壤含水量、土壤微生物及马铃薯产量的影响

菌糠是食用菌生产后的废弃物,含有较多的有机物质和一定数量的养分,用于农作物栽培不仅能够改良和培肥土壤、也会提高作物产量。本文于2016年采用随机区组设计、以田间微区试验的方法,研究了添加不同数量的栽培黑木耳后的菌糠对马铃薯不同生育期0～20 cm土层土壤含水量、微生物数量及有机质、全氮含量和马铃薯产量的影响。试验设不施氮肥(CK)、施纯氮120 kg hm-2(T1)、菌糠替代氮肥用量20%(T2)、菌糠替代氮肥用量40%(T3)、菌糠替代氮肥用量60%(T4) 5个处理;菌糠与0～20 cm土层土壤充分混匀,其它田间管理方法相同。结果表明,添加菌糠处理的土壤有机质及全氮含量随菌糠添加量增加表现出增加趋势;土壤的持水能力提高、5～20 cm土层含水量随菌糠添加量增加而增加,各添加菌糠处理与CK差异显著(P<0.05);马铃薯不同生育期各处理土壤微生物总数(平板计数法)均高于CK;施肥和添加菌糠各处理马铃薯产量较CK增加,T1、T2、T3、T4处理较CK分别增产4.61%、0.60%、5.13%和4.53%。由此可以认为替代氮肥氮素40%、60%的菌糠用量是适当的。     

基因宏阵列和荧光定量PCR方法对西瓜枯萎病害土壤中尖孢镰刀菌的快速检测和定量

采用基因宏阵列(Macroarray)和荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法,对引起西瓜枯萎病害的病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)进行了快速监测和快速绝对定量,并且对实验条件进行了优化和摸索。结果显示,在西瓜枯萎病害发病较为严重的处理N-+P-和N-+P+的根际土壤中,Macroarray检测到强烈的阳性信号,表明尖孢镰刀菌的大量存在,同时荧光定量PCR的结果也表明在这两个处理的根际土壤中尖孢镰刀菌数量最多,分别为每g土壤8.89×105和2.24×105个拷贝数;而在未发生枯萎病害的处理N++P-和N++P+中,Macroarray未检测到阳性信号,根际土壤中尖孢镰刀菌数量分别为每g土壤6.23×103和3.28×103个拷贝数;而四个处理的土体土壤中尖孢镰刀菌的数量均维持在每g土壤102～103个拷贝数,Macroarray未检测到阳性信号。与传统检测方法如病原菌的分离培养、平板稀释计数等相比,上述分子生物学方法对病原真菌的检测和定量更为准确快速、省时省力。     

不同温度下尿素对水稻土甲烷产生及相关古菌群落的影响

水稻田是大气甲烷的重要排放源。尿素氮肥施用是提升水稻产量和品质的重要措施,但其对稻田土壤中产甲烷古菌的影响规律仍不清楚。通过模拟水稻生长季节可能的田间温度变化,本文对水稻土进行施加尿素（400 mg N/kgdry soil）与未施加尿素（0 mg N/kgdry soil）两个处理,并在15℃、25℃、37℃以及50℃四个温度下进行为期100d的厌氧培养,定期测定了培养过程中产甲烷累积量以及土壤理化因子pH、铵氮以及有机碳的变化。并运用基于16S rRNA基因的T-RFLP（末端限制性片段多态性分析）技术分析了产甲烷过程中古菌群落结构随时间的变化情况。结果表明,在中低温范围内（15℃-37℃）,尿素对水稻土产甲烷有抑制作用,但在50℃高温下尿素对水稻土产甲烷量没有显著影响。尿素可能通过改变产甲烷古菌群落结构来影响产甲烷,在15℃-37℃范围内,尿素降低了水稻土产甲烷古菌群落的稳定性,增大了其在不同时间的差异性;而在50℃高温时,尿素对水稻土产甲烷古菌稳定性和差异性的影响不明显。不同温度下,尿素均降低了甲烷八叠球菌（Methanosarcinaceae）的丰度,且随着温度的变化,尿素对水稻土产甲烷机制的改变可能没有影响。     

不同温度下尿素对水稻土甲烷产生及相关古菌群落的影响

水稻田是大气甲烷的重要排放源。尿素氮肥施用是提升水稻产量和品质的重要措施,但其对稻田土壤中产甲烷古菌的影响规律仍不清楚。通过模拟水稻生长季节可能的田间温度变化,本研究设置水稻土施加尿素(N,400 mg/kg干土)与未施加尿素两个处理,在15℃、25℃、37℃以及50℃下进行为期100天的厌氧培养,定期测定了培养过程中甲烷累积量以及土壤理化因子如p H、NH_4~+-N以及有机碳的变化,并运用基于16S r RNA基因的T-RFLP(末端限制性片段多态性分析)技术分析了产甲烷过程中古菌群落结构随时间的变化情况。结果表明:在中低温范围内(15~37℃),尿素对水稻土产甲烷有抑制作用,但在50℃高温下尿素对水稻土产甲烷量没有显著影响。尿素可能通过改变产甲烷古菌群落结构来影响甲烷的产生,在15~37℃范围内,尿素降低了水稻土产甲烷古菌群落的稳定性,增大了其在不同时间的差异性;而在50℃高温时,尿素对水稻土产甲烷古菌稳定性和差异性的影响不明显。不同温度下,尿素均降低了甲烷八叠球菌(Methanosarcinaceae)的丰度,且随着温度的变化,尿素对水稻土产甲烷机制的改变可能没有影响。     

碳氮源对复合木质素降解菌木质素降解能力及相关酶活的影响

白腐真菌所具有的降解木质素能力源于其所产生的酶系统,碳源和氮源是其降解木质素和产酶的一个极为重要的影响因素。通过室内小麦秸秆固态发酵试验,研究了不同的碳、氮源对两株侧耳属真菌Tf1（P.pulmonarius）和JG1（P.cornucopiae）产酶活力、木质素降解和粗蛋白含量的影响。结果表明,Lip和MnP是参与复合木质素降解菌Tf1＋JG1降解小麦秸秆重要的木质素降解酶。以葡萄糖为碳源,酒石酸铵为氮源能显著提高复合木质素降解菌对木质素的降解能力,发酵9 d后小麦秸秆的失重率为14.87%,木质素含量为8.68%,木质素降解率为22.95%;粗蛋白含量为7.28%,比未发酵麦秸提高了36.84%（P〈0.05）;Lip和MnP活力分别为629.11 U.g-1和622.22 U.g-1。     

嗜热子囊菌光孢变种cbh1基因的cDNA克隆及在毕赤酵母的高效表达

以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。     

棉花莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶基因(GhHCT)的克隆、生物信息学分析及表达特性

莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase,HCT)是木质素生物合成途径中影响木质素G/S-单体生物合成的关键酶之一,棉纤维中木质素含量与纤维品质密切相关。本研究以开花后16 d(16 DPA)的棕色棉(Gossypium hirsutum L.)品种新彩棉6号纤维为材料,克隆了1个木质素代谢相关HCT类似基因,命名为GhHCT(GenBank登录号:KF749428)。并通过实时荧光定量PCR技术检测了该基因在棉花不同器官及组织中的相对表达量。序列分析结果表明,该基因的开放读框(open reading frame,ORF)为1 500 bp,编码499个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的GhHCT蛋白质相对分子质量为55.2 kD,等电点为5.69。该蛋白氨基酸序列同其他物种HCT蛋白显示出很高同源性(82%～95%)。GhHCT氨基酸序列包含一个HHAAD酰基转移酶功能结构域以及一个BAHD酰基转移酶基因家族的DFGWG区。系统进化树分析显示,GhHCT与槿麻(Hibiscus cannabinus)HcHCT基因有最近的亲缘关系(94.9%)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示,GhHCT在新彩棉6号不同组织中都有表达,但在16 DPA的胚珠中表达最高,其次在花和茎中也有较高表达,在叶片中的表达量最低。本研究为进一步研究GhHCT基因的生物学功能及棉纤维中木质素生物合成代谢的作用机制研究提供前期基础资料,同时也为利用基因工程技术对天然彩色棉纤维品质进行遗传改良提供一定的线索及理论依据。     

玉米颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS )基因cDNA的克隆及植物表达载体的构建

根据已发表的玉米颗粒结合型淀粉合成酶GBSS（granule-bound starch synthase）基因序列,设计两对引物,其中一对为定点突变的过度引物。从授粉后15d的玉米胚乳中提取总RNA,以反转录合成的cDNA第一链为模板,首次用定点突变、RT-PCR、融合PCR的方法克隆了GBSS 基因的全长cDNA（1818bp）片段。序列测定表明,该片段与文献报道的序列具有99.72％的同源性。并构建了以胚乳特异表达性的Gt1为启动子,以NOS-ter为终止子的植物表达载体pBI-Gt1-GBSS,其含有NPT‖选择标记基因。以期实现特定时期GBSS基因在玉米胚乳中的大量表达。