甘蓝型油菜响应干旱胁迫的转录组分析

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国主要油料作物之一,为国家粮油安全提供了重要保障。干旱严重限制了油菜种植规模扩大、产量与品质提升。为挖掘甘蓝型油菜抗旱的关键基因,阐明油菜耐旱机制,本研究以甘蓝型油菜湘油15为对象,通过实验室模拟干旱处理后的叶片为材料进行转录组测序(RNA-Seq)、生物信息分析并qRT-PCR验证。发现转录组样本平均Clean baseas约为9.6 G,且各样品碱基百分比(Q30)大于93.21%,比对到参考基因组上的Reads在89%以上。干旱处理4 h后,湘油15出现了440个差异表达基因(DEGs),其中148个基因上调,292个基因下调。随机选取10个基因(上调与下调各5个)进行qRT-PCR验证,其中9个基因的qRT-PCR结果与RNA-Seq结果相符,仅1个基因表达趋势相反,相似度可达90%,证实转录组测序结果的可靠性。结果表明甘蓝型油菜湘油15主要通过光合作用、碳代谢和渗透调节等途径调节抗旱能力,为进一步阐明油菜耐旱机制奠定了基础。     

利用RNA-Seq鉴定甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因

【目的】利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技术比较2种不同生长条件下甘蓝型油菜苗期叶片转录组,鉴定油菜叶片干旱胁迫应答相关基因,从转录组水平揭示油菜适应干旱胁迫环境的分子机制。【方法】提取正常生长（ZY）和自然失水处理（ZY8D）的六叶期甘蓝型油菜中油821的叶片总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。利用NGSQCTookit v2.3.3去除低质量和包含模糊碱基的reads。以甘蓝型油菜亲本物种白菜染色体v1.5和甘蓝Scaffold v1.0为参考序列,采用TopHat2-Cufflinks-Cuffmerge-Cuffdiff标准流程进行差异表达基因（differential expressed genes,DEGs）筛选。对上调和下调DEGs分别采用Cytoscape v3.1.0中的BiNGO和KOBAS2.0进行基因本体（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）代谢途径富集分析。选择上调和下调DEGs各3个,以实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】过滤低质量reads后,ZY和ZY8D分别保留了26 192 312和28 378 899对高质量reads用于DEGs筛选,其中86.6%和85.8%的reads能准确比对到参考序列上,说明RNA-Seq结果和参考序列可靠。DEGs鉴定结果表明3 657个基因受干旱胁迫诱导差异表达,其中上调表达基因1 431个,下调表达基因2 226个。GO富集分析发现上调表达基因主要与非生物胁迫响应和化学刺激响应相关,其中,参与水分胁迫响应和脱落酸（abscisic acid,ABA）刺激响应的基因分别有127和141个,而下调表达基因与植物病原菌防御、蛋白激酶活性和水杨酸（salicylic acid,SA）刺激相关。KEGG富集分析表明上调表达基因主要富集于苯丙烷和类胡萝卜素的生物合成及淀粉与蔗糖代谢途径,而下调表达基因主要富集于植物-病原菌互作和植物激素ABA、SA和茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号转导途径。qRT-PCR检测6个DEGs的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】RNA-Seq分析鉴定出3 657个甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因。GO和KEGG代谢途径分析明确了差异表达基因富集的分子功能与代谢途径。     

干旱胁迫下甘蓝型油菜幼苗萌发特性及生理指标分析

为鉴定筛选甘蓝型油菜抗旱种质材料,采用高渗透液干旱法,在甘蓝型油菜核心种质XY1、XY2、XY3、XY4、XY5、XY6的萌发期模拟干旱胁迫,测定其萌发特性及生理指标。结果表明,随着干旱程度的加剧,6个油菜材料的成苗率、苗高、含水率显著降低;主根长先升后降,差异显著;发芽率降幅较小,差异不显著。脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性呈升高趋势,其中Pro、CAT在重度胁迫下增加幅度较大,其余指标变化相对较小,但仍达到显著水平。干旱胁迫下XY3的Pro含量在6个材料中增幅最大,表明其渗透调节能力强;XY2的SOD、POD活性增幅较大,XY5的CAT活性增幅较大,活性氧清除能力高;XY1的MDA含量增幅较大,膜脂过氧化严重,抗旱能力较弱。隶属函数法分析表明,6个油菜材料抗旱性结果为:XY2XY5XY6XY3XY4XY1,XY2和XY5的抗旱性较好,可作为选育抗旱品种的骨干亲本,本研究为甘蓝型油菜抗旱种质评价及抗旱育种提供理论依据。     

甘蓝型油菜WOX基因家族的鉴定与表达分析

对甘蓝型油菜WOX基因家族进行研究，利用生物信息学方法鉴定到58个家族成员，对其理化性质、系统发育树、基因结构、保守结构域、染色体位置、顺式作用元件和表达模式等进行分析，结果表明：氨基酸长度为121~397，分子质量为13 962.77~44 157.46 u，等电点为5.23~9.63，亲水性均小于0，不稳定系数为42.12~75.63，亚细胞定位在细胞核和叶绿体；系统进化树将WOX基因分为3大类和9个亚支；相同亚支的成员motif和基因结构相似或相同；除 BnWOX1、 BnWOX3、 BnWOX4、 BnWOX15、 BnWOX32、 BnWOX42、 BnWOX43、 BnWOX51、 BnWOX53 基因外，其余 49 个BnWOX基因不均匀分布在19条染色体中的18条染色体上(ChrC06 除外)，有38对串联重复基因；基因上游序列中包含转录因子结合位点、逆境响应、光响应、激素响应、分生组织调控等顺式作用元件等；各组织器官表达分析表明，BnWOX基因在根、茎尖、种子、角果中表达量较高；对WOX基因进行定量分析发现，在冷胁迫和干旱胁迫下基因表达量有显著变化，表明BnWOX基因可能在油菜响应冷/旱胁迫的调控机制中发挥着重要作用。     

外源水杨酸对干旱胁迫下甘蓝型油菜幼苗生理特性的影响

以甘蓝型油菜幼苗为材料,采用聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫的方法,研究了外源水杨酸(SA)对甘蓝型油菜幼苗在干旱胁迫下生理特性的影响。结果表明,在干旱胁迫条件下,甘蓝型油菜幼苗叶片的相对含水量逐渐下降,过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性呈先升高再降低的趋势,脯氨酸含量、电导率和丙二醛(MDA)含量随干旱胁迫程度的加深一直呈升高趋势,经SA预处理的甘蓝型油菜幼苗叶片相对含水量、抗氧化酶活性、脯氨酸含量均高于对照,其电导率和丙二醛含量则低于对照。因此,在干旱胁迫下,外源水杨酸能诱导并引起甘蓝型油菜幼苗抗氧化酶活性和脯氨酸含量的提高,使其电导率和丙二醛含量降低,从而减缓干旱胁迫对植物造成的伤害。     

甘蓝型油菜及其亲本苗期对干旱胁迫的生理响应

以香港尖叶中花芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra,CC,2n=18)和矮抗青(B.rapa,AA,2n=20)通过种间杂交形成的人工合成甘蓝型油菜(B.napus,AACC,2n=38)为试验材料,对早期不同世代和亲本幼苗采用控水方式进行15d的干旱胁迫处理,测定叶片相对含水量、相对电导率、丙二醛等与植物耐旱能力相关的生理生化指标以及抗氧化酶活性的变化,研究亲本与合成种早期世代幼苗对干旱的生理响应。结果表明:15d的干旱胁迫对油菜幼苗叶片相对电导率和丙二醛的影响与对照相比不升反降,油菜幼苗超氧化物歧化酶活性略有增加,而过氧化物酶和过氧化氢酶活性均呈下降的趋势,说明人工合成甘蓝型油菜新材料在干旱胁迫下具有一定清除活性氧的能力。     

耐旱性甘蓝型油菜品种的筛选及其在干旱胁迫下生理生化特征的研究（英文）

[目的]筛选甘蓝型油菜耐旱种质资源,并分析其干旱胁迫下生理生化变化。[方法]以40个不同甘蓝型油菜品种(系)为材料,采用PEG-6000模拟生理干旱胁迫和盆栽极限干旱胁迫等方法进行耐旱种质资源的筛选,并对干旱胁迫下叶绿素含量、类胡萝卜素含量、脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性的变化进行了研究。[结果]筛选鉴定出一批耐旱性甘蓝型油菜品种:YAU200908、湘油15号、YAU200903、YAU200907、YAU200906、YAU200904。生理生化分析表明,在干旱胁迫下,油菜叶片中叶绿素、类胡萝卜素的含量随干旱程度的加剧而降低,脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA的含量及SOD、CAT、POD的酶活性则随着干旱程度的加剧而升高。[结论]在抗旱性强的材料中,其类胡萝卜素的含量显著地减少,脯氨酸、可溶性糖、MDA的含量及SOD、CAT的酶活性显著增加,可作为油菜抗旱性鉴定的生理生化指标。     

甘蓝型油菜光合基因的表达及其与含油量的关系

以双低油菜高含油品系855和低含油品系868为材料,对9个光合基因(Bna0391450、Bna0449040、Bna0104450、Bna0501620、Bna0197350、Bna0305890、Bna0087590、Bna0084310、Bna0280620)在叶片、花蕾和种子中的表达及其与油分积累的相关性进行研究。结果表明:除Bna0280620基因在高油品系855中、Bna0084310基因在低油品系868授粉后15 d的种子中基本不表达外,其他基因在叶片、花蕾和授粉后不同时期的种子中均有表达,且基因表达量均呈先上升后下降的趋势;高油品系855中的基因表达量峰值出现在授粉后20 d;低油品系868中的基因表达量峰值出现在授粉后25 d;2个品系中,光合基因表达差异集中在苗期叶片和授粉后20 d的种子中,油分积累差异主要集中在授粉后30～40 d种子中。品系855中,除Bna0197350和Bna0280620外,油分积累与光合基因表达量均呈负相关,且相关性不显著;品系868中,除Bna0501620基因外,油分积累与光合基因表达量也呈负相关,相关性不显著。说明油菜光合基因在种子中有表达,但不影响种子中的油分积累量。     

甘蓝型油菜种子发育过程中油脂合成基因的表达

以2个高油品系(扬36、扬3052)和一个低油品系(扬6002)发育过程中的甘蓝型油菜种子为材料,利用实时荧光定量PCR技术,比较9个参与脂肪酸合成的编码酶基因和3个相关转录因子在种子发育过程中的表达模式和表达水平差异,探讨不同含油量甘蓝型油菜油脂合成代谢的差异。结果表明:除ACCase、FAD3、LEC1外,不同高油品系之间多数基因的表达模式和表达量相近,说明这2个不同遗传来源的高油品系在油分形成过程中,其油脂合成的主要基因在表达上具有较好的一致性。但高油和低油品系之间多数基因的表达模式或表达水平则存在着明显差异,其中FatA、FAD3、L1L等基因的表达量与含油量密切相关,随种子的发育其在高油品系中表达量明显高于低油品系。     

CaCl2对干旱胁迫下甘蓝型油菜抗旱性相关的生理生化指标变化影响

分析了干旱诱导下抽薹期甘蓝型油菜的生化指标和蒸腾作用变化及Ca2 处理对其影响。结果表明,在干旱胁迫下,甘蓝型油菜叶片中的脯氨酸、可溶性糖以及丙二醛含量明显增加,经Ca2 预处理其脯氨酸和可溶性糖含量明显高于仅用双蒸水处理的材料,而丙二醛含量则是蒸馏水处理的材料高于Ca2 预处理的材料;气孔导度日变化分析以及气孔观察显示,Ca2 预处理可以明显促使干旱过程中叶片表皮气孔关闭,进而使叶片蒸腾速率和气孔导度降低,从而减少了干旱条件下水分的蒸发。     

甘蓝型油菜DGAT1重复基因的克隆与表达分析

二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT1)是十字花科植物种子三酰甘油积累主要的贡献者。甘蓝型油菜为异源四倍体,存在多个DGAT1重复基因,目前还缺乏对这些基因的系统研究。以甘蓝型油菜为试验材料,根据TAIR已公布的拟南芥DGAT1基因序列在BRAD数据库中进行BLAST比对,根据比对得到的2个白菜型油菜与2个甘蓝的DGAT1基因序列设计引物,利用RT-PCR技术获得4个甘蓝型油菜DGAT1包含完整编码区的基因片段,并对所得到片段进行测序和生物信息学分析。结果表明:克隆得到的基因片段分别为BnDGAT1-1,1 509bp;BnDGAT1-2,1 533bp;BnDGAT1-3,1 515bp;BnDGAT1-4,1 506bp。这4个基因具有极高的相似性,BnDGAT1-1与BnDGAT1-2、BnDGAT1-3与BnDGAT1-4的2个基因相似度均高达97%以上。跨膜结构分析表明BnDGAT1-1与BnDGAT1-2这1对基因所编码的蛋白质含有9个跨膜结构域,而BnDGAT1-3与BnDGAT1-4这对基因所编码的蛋白质含有8个跨膜结构域。包含有BnDGAT1-1与BnDGAT1-3的基因对BnDGAT1-a与包含有BnDGAT1-2与BnDGAT1-4的基因对BnDGAT1-b在含油量不同的各种甘蓝型油菜种子中表达无明显差异,表明这2对DGAT1基因的表达差异并不是影响所选材料种子含油量的决定因素。     

甘蓝型油菜HD-ZIP基因家族的鉴定和表达分析

为揭示HD-ZIP蛋白家族成员在甘蓝型油菜全基因组中的分布及相关特征,通过生物信息学方法共鉴定出74个HD-ZIP转录因子,分别被定位到甘蓝型油菜的19条染色体和8条随机序列;这74个HD-ZIP蛋白都含有高度保守的HD-ZIP结构域;系统发育进化树将该家族成员聚为4大类;共线性分析发现大部分基因不仅在A和C染色体组间存在共线性,而且在各自染色体组内也存在串联重复事件;基因表达分析发现,大部分HD-ZIP家族基因在根和叶中均有表达,并且在根中表达的基因多于叶片,受到盐胁迫处理时,大部分基因表达量会增加。初步明确了甘蓝型油菜HD-ZIP家族成员结构特点和相关功能,为进一步研究甘蓝型油菜HD-ZIP蛋白家族基因的生物学功能奠定了基础,为油菜抗性育种工作提供科学依据。     

GbCDPK83基因在干旱胁迫下的功能鉴定

为了探究 GbCDPK83基因在海岛棉响应干旱胁迫中的功能。利用PCR技术克隆 GbCDPK83基因,采用生物信息学方法分析GbCDPK83蛋白的理化性质、结构特征和在细胞中的位置,通过基因重组技术构建VIGS沉默载体并侵染棉花。本研究成功构建了沉默表达载体,沉默植株中 GbCDPK83的表达明显被抑制。干旱胁迫后, GbCDPK83沉默植株叶片比对照萎蔫更严重,相对含水量显著降低,相对电导率和丙二醛含量显著上升,脯氨酸含量升高但低于空载体及非转基因植株。沉默 GbCDPK83使海岛棉耐旱性减弱。     

敌草胺对油菜抗氧化酶活性及相关基因表达的影响

除草剂药害严重影响油菜产量,研究筛选预防药害发生的生物标记物,结合植物生长调节剂的药害缓解机制,可有效解决油菜田敌草胺的药害问题。以盆栽油菜为材料,研究敌草胺处理后抗氧化酶活性及相关基因表达的变化规律,探究赤·吲乙·芸苔的药害缓解机制。结果显示过氧化物酶（POD）反应最灵敏,1.2 g/L 敌草胺处理12 h酶活达到最高值;2.4 g/L敌草胺能够显著诱导油菜GST基因较对照6.4倍的高表达。4.8 g/L和6.0 g/L敌草胺处理48 h,叶片内SOD、POD、CAT活性和相关基因表达量显著低于对照,氧化损伤严重。喷施0.1 mg/L赤·吲乙·芸苔,能激活低浓度（1.2 g/L、2.4 g/L）敌草胺胁迫的油菜抗氧化系统,解除药害影响。综上,敌草胺对油菜抗氧化酶活性和相关基因表达整体呈低浓度促进高浓度抑制,先升高后降低的趋势。2.4 g/L敌草胺接近油菜受害的临界浓度,POD可用于药害发生的早期预警。喷施0.1 mg/L 赤·吲乙·芸苔可较好的缓解敌草胺产生的轻度药害。     

甘蓝型油菜WRI1基因cDNA克隆与种子特异性表达载体的构建

WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序列,选取2种存在明显差异(碱基缺失)的cDNA序列构建植物种子特异性表达载体。为后续转基因研究这种差异是否会造成WRI1基因在提高含油量作用上的差异作准备。通过双酶切和连接反应,分别将WRI1基因和napin启动子基因插入到pBI121载体的GUSA基因和CaMV35启动子基因位置。酶切及PCR检测结果显示,napin启动子和WRI1已插入相应位置,完成2种载体种子特异性表达WRI1基因重组载体pBI121+napin+WRI1的构建,命名为pBI121NW2、pBI121NW4。     

转pepc基因油菜及其光合生理表现

采用下胚轴侵染法和花序浸染法将玉米C₄型pepc光合基因导入到甘蓝型油菜中,对转基因植株进行PCR鉴定并测定磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性及其相关光合生理指标。结果表明,2种转基因方法均能将玉米C₄型pepc基因导入油菜中。转pepc基因油菜的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）平均活性比原种提高17倍左右,净光合速率（P_n）比原种提高15.5%,胞间CO₂摩尔分数（C_i）比原种降低35%。表明pepc基因在转基因油菜中得到高效表达。     

棉花茉莉酸羧基甲基转移酶基因克隆及其表达分析

根据亚洲棉石系亚1号的转录组测序结果,克隆获得陆地棉品种"新陆早17号"的茉莉酸羧基甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)全长cDNA,命名为GhJMT(GenBank登录号KJ856913)。序列分析表明,GhJMT基因开放阅读框为1 116bp,编码371个氨基酸。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有甲基转移酶-7保守结构域。系统进化树分析显示,GhJMT与可可的茉莉酸甲基转移酶在同一分支,可能定位于细胞质,为不稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,2.5%PEG6000胁迫处理12h时,根中GhJMT基因的表达迅速上调并达到最大值,约为对照的2.6倍,在茎中GhJMT的表达量在9h达到最高,约为对照的2.3倍,而在叶中GhJMT表达量在3h达到最高,约为对照组的2.1倍,说明GhJMT基因表达受干旱胁迫的诱导。研究结果有助于阐明GhJMT基因表达与植物抗旱的相关性。     

发菜固氮酶nifH基因克隆及其干旱胁迫下的差异表达

通过对发菜固氮酶H亚基基因(nifH)全长进行克隆、原核表达和生物信息学分析,采用qRT-PCR技术,分析不同干旱胁迫下发菜固氮酶基因nifH在转录水平的表达变化。结果表明,根据特异性引物克隆获得长度为894bp的nifH,GenBank登陆号为BankIt1901364(KU886163)。将nifH在大肠杆菌中表达,获得约36ku的外源蛋白。生物信息学分析表明,发菜nifH与已报道的多种蓝藻的nifH及推导的氨基酸序列具有较高的相似性,nifH二级结构和三级结构主要由α螺旋、β-折叠、随机卷曲和β-转角构成。随藻体含水量的逐渐降低,发菜nifH在转录水平上的表达量逐渐增加,固氮酶活性呈现先增加后下降的趋势。研究结果为进一步研究发菜固氮酶基因的分子结构和发菜响应干旱胁迫的固氮机制及氮代谢过程奠定基础。