尼罗罗非鱼Dmrt基因的序列分析

参照不同物种DM结构域设计了1对兼并引物,扩增出1条带,长约150 bp.对扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP 分析筛选不同基因片段,进一步对筛选的不同基因进行了 DNA 测序.结果获得2个不同的DmDmrt基因,采用 BLAST 方法与人类相应DmDmrt基因进行序列比对,发现其与人类相应的DmDmrt基因的氨基酸序列一致性分别为89.1% 和100.0%.根据尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的拉丁文名,按习惯将其命名为OnDmDmrt1和OnDmDmrt2.根据扩增出的DmDmrt1 DM-domain的序列设计上游引物,用3′RACE(rapid amplification of cDNA ends) 法分离和测定了DmDmrt1 cDNA的3′序列,得到1 108 bp的片段,共编码262个氨基酸,与奥利亚罗非鱼、虹鳟、新月鱼、青鳉等动物的DmDmrt1的氨基酸序列进行比较,同源性分别为99%、62%、73%和41%.     

尼罗罗非鱼2个Dmrt基因的序列分析

参照不同物种DM结构域设计了一对兼并引物,扩增出一条带,长约150bp.对扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP分析筛选不同基因片段,进一步对筛选的不同基因进行了DNA测序.结果获得2个不同的Dmrt基因,采用BLAST方法与人类相应Dmrt基因进行序列比对,发现与人类相应Dmrt基因的氨基酸序列一致性分别为89.1%和100%.根据尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的拉丁文名,接习惯将其命名为onDmrt1,onDmrt2.与其他动物相关的Dmrt基因进行聚类分析,结果表明,不同进化地位动物的Dmrt基因DM域编码序列存在高度的同源性,显示Dmrt基因在系统进化上高度保守.序列上的相似性可能暗示着它们在功能上的保守性.     

尼罗罗非鱼Sox基因PCR—SSCP分析

参照人SRY基因HMG—box保守区序列,设计1对兼并引物,采用PCR技术扩增了尼罗罗非鱼Sox基因,在雌、雄尼罗罗非鱼个体中均扩增出5条带,大小分别约为200、400、600、800、1200bp,回收200bp左右扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP分析,筛选不同基因片段。进一步对筛选的不同基因进行测序,结果获得了5个不同的228bpSox基因,与Gen-Bank联机．采用BLAST方法与人类相应SOX基因进行序列比对,发现其与人类相应SOX蛋白的氨基酸序列一致性分别为97．2％、97．2％、94．4％、96％、88．2％,显示出这些基因在分子进化上具有高度的保守性。     

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆、序列分析和结构预测

采用RT-PCR和RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法分离出奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶(P450aromA)的全序列,得到1784 bp的全长cDNA,包括38 bp 5'非翻译区,1566 bp阅读框以及含Poly(A)信号(AATAAA)的167 bp 3'非翻译区[不包括Poly(A)].阅读框共编码521个氨基酸,计算的蛋白质分子量为59 ku.同源性分析显示,奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其它鱼性腺P450arom具有70%以上的同源性,与其它鱼脑P450arom为60%左右同源,但芳香化酶高保守区包括I-螺旋区,芳香化酶特异保守区II和血红素结合区III和其它鱼芳香化酶的同源性分别高达83%～96%, 78%～86% 和 85～100%.系统发育分析表明奥利亚罗非鱼P450aromA与鱼类性腺P450arom属于同一分支的.生物信息学分析显示:奥利亚罗非鱼P450A基因编码的蛋白无信号肽,无跨膜区域,为非分泌蛋白,同时含有多个酪蛋白激酶II磷酸化位点, N-糖激化位点,N-肉豆蔻酰化位点,蛋白激酶C磷酸化位点.     

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆、序列分析和结构预测

采用RT-PCR和RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法分离出奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶(P450aromA)的全序列,得到1784 bp的全长cDNA,包括38 bp 5'非翻译区,1566 bp阅读框以及含Poly(A)信号(AATAAA)的167 bp 3'非翻译区[不包括Poly(A)].阅读框共编码521个氨基酸,计算的蛋白质分子量为59 ku.同源性分析显示,奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其它鱼性腺P450arom具有70%以上的同源性,与其它鱼脑P450arom为60%左右同源,但芳香化酶高保守区包括I-螺旋区,芳香化酶特异保守区II和血红素结合区III和其它鱼芳香化酶的同源性分别高达83%～96%, 78%～86% 和 85～100%.系统发育分析表明奥利亚罗非鱼P450aromA与鱼类性腺P450arom属于同一分支的.生物信息学分析显示:奥利亚罗非鱼P450A基因编码的蛋白无信号肽,无跨膜区域,为非分泌蛋白,同时含有多个酪蛋白激酶II磷酸化位点, N-糖激化位点,N-肉豆蔻酰化位点,蛋白激酶C磷酸化位点.     

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼核型及DNA含量的比较研究

采用ＰＨＡ体内培养法，取鱼体肾细胞用空气干燥法制备奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的染色体，经核型分析，奥利亚罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝５０。尼罗罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝５０。经流式细胞仪测量外周血红血球的ＤＮＡ含量，奥利亚罗非鱼为２Ｃ＝２．２２ｐｇ（２．２２ｐｇ／Ｎｕｃｌ）；尼罗罗非鱼为２Ｃ＝２．２７ｐｇ（２．２７ｐｇ／Ｎｕｃｌ）。经对比分析，两种鱼     

盐度对尼罗罗非鱼和莫桑比克罗非鱼生长的影响

罗非鱼的耐盐性较广,大多数罗非鱼既能在淡水中生长又能在海水生长.笔者通过人工配制了4个盐度的咸水(0‰、10‰、20‰、30‰),分别从成活率、绝对增重量、瞬时增重率等3个方面对莫桑比克罗非和尼罗罗非鱼的生长进行了初步研究.通过试验研究对比发现,莫桑比克罗非鱼的生长随着试验盐度的升高呈上升趋势,适合在海水中养殖;而尼罗罗非鱼的生长随着试验盐度的升高呈下降趋势,更适合淡水养殖.     

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的遗传标记

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分别对奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼及其杂交后代奥尼杂交鱼（尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂）的５种组织（眼、脑、心、肌、肝）的ＭＤＨ酶谱进行了分析和比较,结果发现;罗非鱼不同组织的ＭＤＨ同工酶有明显的组织特异性。３种罗非鱼肌肉组织ＭＤＨ同工酶表现出种间差异,即细胞质型（ｓ－ＭＤＨ）在电泳时迁移率的不同可以作为鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交种的遗传标记。     

尼罗罗非鱼肝cDNA文库的构建

用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。     

尼罗罗非鱼肝cDNA文库的构建

用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。     

2007-2012年中国罗非鱼无乳链球菌流行菌株血清型分析

采用PCR血清型鉴定方法,对2007-2012年从广西、广东、海南、福建和云南等地养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus中分离获得的168株无乳链球菌Streptococcus agalactiae流行菌株的血清型进行分析。结果表明：有159株为Ⅰa血清型,6株为Ⅰb血清型,3株为Ⅲ血清型。各区域流行菌株血清型也存在差异：从广西自治区7个地区50个养殖场的罗非鱼中分离的61株无乳链球菌中,有54株为Ⅰa型,4株为Ⅰb型,3株为Ⅲ型;从广东省10个地区59个养殖场的罗非鱼中分离的64株无乳链球菌中,有63株为Ⅰa型,1株为Ⅰb型;从海南省5个地区26个养殖场的罗非鱼中分离的33株无乳链球菌中,有32株为Ⅰa型,1株为Ⅰb型;从福建省漳州6个养殖场的罗非鱼中分离的6株和从云南省文山4个养殖场的罗非鱼中分离的4株均为Ⅰa型。研究表明,2007-2012年中国罗非鱼链球菌病流行菌株血清型存在Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ3种血清型,Ⅰa型为主要血清型,研究结果可为准确分析中国罗非鱼链球菌病流行规律和特点提供数据,为该病防治及疫苗候选菌株筛选提供理论基础。     

尼罗罗非鱼8个养殖群体遗传差异的微卫星分析

利用18对微卫星引物对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)国内外8个养殖群体进行遗传差异分析.结果表明:(1)8个群体的平均等位基因数(Na)为3.61～5.11,平均有效等位基因数(Ne)为2.81～3.76,平均观察杂合度(Ho)为0.861 1～0.925 0,平均期望杂合度(He)为0.603 9～0.697 7,平均多态信息含量(PIC)为0.522 9～0.637 3.表明这8个养殖群体具有丰富的遗传变异.(2)在对8个群体的遗传距离和遗传相似度进行估算基础上所作聚类分析表明, 8个群体分为两大支,3个"吉富"群体明显聚为一支,其他5个群体聚为一支, 反映了这8个群体的亲缘关系.(3)微卫星引物UNH187可以初步作为区分"新吉富"尼罗罗非鱼和其他尼罗罗非鱼群体的特异性标记.     

高温胁迫下尼罗罗非鱼肝脏组织的转录组分析

为探究罗非鱼高温胁迫响应的调控作用机理,选用孵化12 d后的尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus幼鱼,基于RNA-seq技术对尼罗罗非鱼高温处理组(36℃高温胁迫下养殖30、50、70 d)和常温对照组(28℃,30、50、70 d)肝脏组织样品进行转录组分析.结果表明:高温处理组与常温对照组共获得39...     

尼罗罗非鱼X和Y染色体原位杂交探针的制备

通过染色体显微切割的方法，分别从尼罗罗非鱼XX和YY个体有丝分裂中期相染色体滴片上，割取第1对染色体，随后经简并PCR扩增，分别用生物素和地高辛标记，得到X和Y染色体探针。将探针与尼罗罗非鱼XY个体的染色体进行荧光原位杂交，在第1对染色体上得到很强的杂交信号。结果表明，染色体显微切割和简并PCR技术相结合，可以有效地制备鱼类DNA探针。     

两个尼罗罗非鱼品系Hsp70基因序列比对分析

采用RT-PCR技术,对从美国和埃及引进的两个尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus品系(以下分别简称为美国尼罗和埃及尼罗)热休克蛋白70(Heat shock proteins 70,Hsp70)基因进行扩增并克隆测序。获得两个品系罗非鱼Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)cDNA序列,全长为1 923 bp,编码为640个氨基酸,含有Hsp70家族3个签名序列DLGTTYS、IFDLGGGTFD和VVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端保守序列EEVD,核定位信号标签KRKHKKDISQNKRALRR;Dank特征基序DLGTT-S-V;胞质Hsp70特征基序EEVD;靠近C端的GGMP4肽序列;2个糖基化位点NKSI和NVSA。结合BLAST分析结果,可以确认,获得的cDNA序列为美国尼罗和埃及尼罗两个品系罗非鱼的完整编码序列。序列同源性分析表明,美国尼罗和埃及尼罗有3个氨基酸位点和12个核苷酸位点不同,美国尼罗Hsp70基因氨基酸序列与莫桑比克罗非鱼同源性最高为99.7%,而与家鼠同源性最低为83.6%。     

性成熟前期尼罗罗非鱼雌雄性别生长差异与性类固醇激素水平比较

利用分子标记法、醋酸洋红压片法、组织切片技术等方法进行个体性别鉴定,比较了性成熟前期(0.5~4.0月龄)尼罗罗非鱼雌、雄鱼生长差异,并检测了2.5~4.0月龄雌、雄鱼血清睾酮(T)、雌二醇(E₂)激素含量。结果发现,雌、雄鱼全长、体质量分别自3.0月龄、2.5月龄开始出现差异显著(P<0.05)。Logistic拟合全长、体质量生长方程为:L_t(♀)=16.443/(1+e^{(2.821-1.363*t)}),L_t(♂)=18.248/(1+e^{(2.752-1.295*t)});W_t(♀)=107.704/(1+e^{(5.157-1.464*t)}),W_t(♂)=134.796/(1+e^{(5.080-1.417*t)}),雌、雄鱼体质量生长拐点分别为3.523、3.585月龄,拐点体质量分别为52.352、67.398 g。雄鱼全长、体质量生长速度始终大于雌鱼,雄鱼快速增长期区间长度、体质量增加量大于雌鱼。2.5月龄之后,雌、雄鱼E₂含量差异显著(P<0.05),3.0月龄之后,雌、雄鱼T含量差异显著(P<0.05),推测E₂、T含量差异是引起尼罗罗非鱼雌雄性别生长差异的原因之一。     

氧氟沙星在吉富罗非鱼体内的药代动力学及残留的研究

在水温为(25±2)℃下,按10 mg/kg的剂量给吉富罗非鱼Oreochromis niloticus单次口服氧氟沙星,用高效液相色谱法测定鱼血浆和组织中的药物浓度,研究氧氟沙星在吉富罗非鱼体内的代谢及消除规律。结果表明:血浆及组织药时数据均符合一级吸收二室开放模型,吸收分布迅速,但消除较为缓慢,血浆、肌肉、肝胰脏、肾脏中的达峰时间(Tmax)分别为0.41、3.19、0.18、0.59 h;最大血药浓度分别为7.98μg/mL、17.24、36.10、46.65μg/g,组织中肝胰脏的药物浓度最高,在测定时间内各组织的药物浓度均高于血浆;药物消除速度依次为肾脏>肌肉>肝胰脏,消除半衰期(T1/2β)分别为12.90、19.45、28.27h。以10μg/kg为最高残留限量,在本试验条件下,建议休药期不低于8 d。在治疗罗非鱼疾病时,氧氟沙星的给药剂量为10 mg/kg,每天两次,连续使用2~3 d。