福建含笑ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以福建含笑叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于福建含笑ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:20μL PCR反应体积中含0.4 mmol.L-1dNTPs,2.5 mmol.L-1Mg2+,1.5 UTaqDNA聚合酶,0.6μmol.μL-1引物,30 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,47.3℃退火30 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸7 min,4℃保存。应用ISSR体系对5份福建含笑种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

蕺菜ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

[目的]针对蕺莱ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR分子指纹标记反应体系,为进一步研究蕺菜的居群遗传多样性奠定基础。[方法]通过筛选引物并设定影响蕺菜ISSR反应各因素的浓度,检测ISSR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立蕺菜ISSR稳定可靠的反应体系。[结果]建立了可用于蕺菜ISSR—PCR分析的最适宜反应体系。砌酶质量、退火温度、Mg^2＋浓度、dNTP浓度均对ISSR反应结果具有较大影响。[结论]建立的蕺菜ISSR反应体系具有省时、经济、简便、扩增条带清晰而稳定以及重复性好等特点,可以较好地应用于蕺菜的居群鉴别及居群分子生态的研究。     

温郁金ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

[目的]寻找一个可用于温郁金ISSR-PCR的最适宜反应体系。[方法]利用CTAB法提取基因组DNA,同时利用PCR扩增技术和方法,对引物、模板DNA、Mg2+d、NTP、Taq聚合酶等反应条件进行优化。[结果]反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2+浓度(25mmol/L)2.2μl,Taq聚合酶(5 U/μl)0.4μl,引物浓度(20μmol/L)1.5μl,模板DNA(5 ng/μl)1.5μl,dNTP(2.5 mmol/L)2.2μl,10×PCRbuffer2.5μl;PCR扩增程序为:1个循环的94℃预变性5 min;94℃变性35 s,相对应的引物退火温度退火1 min,72℃复性1.5 min,共36个循环;最后72℃延伸10 min。[结论]该体系是适合温郁金ISSR-PCR反应的最适宜体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带清晰而稳定等特点,为今后温郁金遗传多样性的研究奠定了基础。     

菊芋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用正交试验设计的方法,从Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度4因素对菊芋ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度及退火温度进行梯度检测。结果表明:菊芋20μl最佳反应体系包括10×PCR buffer,200μmol/L dNTP,0.5μmol/L引物,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶和50 ng模板DNA。这一优化系统的建立,将为菊芋种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

青海云杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

1材料与方法1．1材料供试材料为祁连山区青海云杉天然分布区内的优良单株,基本能反映出祁连山青海云杉分布区的特点。1．2试剂所用TaqDNA聚合酶、dNTPs等均购于兰州佰澳生物公司;ISSR选择引物来自University of British Columbia Biotechnology Lab（UBCBL）primer set UBC9,由北京赛百盛公司合成。     

桑树ISSR-PCR反应体系建立及优化

采用正交试验设计L₁₆(4⁵)对桑树ISSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg²⁺、dNTPs和rTaq酶5个因素及反应程序中变性时间、退火时间、延伸时间和循环数进行优化分析。结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为DNA模板>rTaq酶>Mg²⁺>引物>dNTPs。最终确立了最佳反应体系,即在10μL反应体系中,含25 ng/μL DNA模板1μL、10×PCR buffer 1μL、20μmol/L引物0.2μL、2.5 mmol/L Mg²⁺ 0.8μL、2.5 mmol/L dNTPs 1μL、5 U/μL rTaq 0.1μL。优化得到的反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性40 s,合适的退火温度退火45 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,16℃保存。通过梯度PCR,确定引物ID37的退火温度为49.5℃。稳定性检测表明该体系能用于桑树ISSR分析。     

金荞麦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为金荞麦品种ISSR指纹图谱建立、新品种选育、数量性状基因定位等工作提供科学依据,以金荞麦为材料,通过单因素试验和正交试验对影响ISSR-PCR反应体系的主要成分进行了优化,建立了稳定、可重复的金荞麦ISSR-PCR扩增反应体系。在20μL的反应体系中10×PCR buffer(不含Mg2+)2.0μL,2U Taq DNA聚合酶0.1μL,0.25mmol/L dNTPs 2.5μL,20ng/μL基因组DNA 1.0μL,2.5mmol/L Mg2+1.2μL,100μmol/L引物0.6μL,去离子水12.6μL。     

茶树ISSR-PCR反应体系优化研究

通过优化影响茶树ISSR PCR的主要参数,确立适合于茶树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明,在20μl反应体系中模板DNA的用量、T aq酶用量、引物浓度、M g2 浓度、dNT p浓度分别为:模板DNA为40 ng;T aq酶为0.5 U;引物为0.25μm o.lL-1;M gC l2为1.5 mm o.lL-1;dNT p为0.2 mm o.lL-1。适宜退火温度比Tm值高2~3℃。     

适用于川芎的ISSR-PCR反应体系的建立及优化

[目的]建立和优化适合川芎的ISSR-PCR反应体系。[方法]以川芎叶片为材料,利用改良CTAB法提取了叶片基因组DNA,利用单因素试验分析了DNA模板、Mg2＋、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR反应的影响,对适合川芎的ISSR-PCR反应条件进行了优化。[结果]适合川芎的ISSR-PCR反应体系为25.0μl,其中含2.5μl 10×TaqDNA聚合酶缓冲液、2.1 mmol/LMgC l2、300μmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、1.0 UTaqDNA聚合酶和20～40 ng模板DNA。[结论]为进一步对全国17个不同分布区的川芎资源进行遗传多样性研究奠定了基础。     

梨品种ISSR-PCR反应体系的优化与应用

以海子梨渊Haizili冤品种的DNA 为材料袁对影响ISSR-PCR 扩增的重要因子进行单因素的优化设计袁建 立了最佳体系: 25 滋L 反应体系中含2.5 滋L 10伊buffer尧0.75 U Taq DNA 聚合酶尧0.2 mmol/L dNTPs尧2.5 mmol/L MgCl2尧0.25 滋mol/L 引物尧10~60 ng 模板DNA遥将最佳体系应用于黔西南的22 个梨品种袁证实了该体系的重复性好袁 很稳定遥     

翻白草总DNA的提取与ISSR-PCR体系的建立与优化

[目的]针对翻白草ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR分子指纹标记反应体系,为进一步研究翻白草的居群差异奠定基础。[方法]通过筛选引物并设定影响翻白草ISSR反应的诸因子的不同浓度,检测ISSR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立翻白草ISSR稳定可靠的反应体系。[结果]首次建立了可用于翻白草ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系,确定了25lμPCR反应体系中各试剂终浓度:1×Buffer缓冲液,1 UTaq DNA聚合酶,2.5 mmol/LMg2+,0.25 mmol/L dNTP,0.4μmol/L引物,DNA模板约20~30 ng,退火温度在50~56℃;实验表明:Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度、Mg2+浓度d、NTP浓度均对ISSR反应结果具有较大影响。[结论]所建立的翻白草ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可以较好地应用于翻白草的居群鉴别及居群分子生态的研究。     

高加索三叶草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

高加索三叶草(Trifolium ambiguum Bieb.)是许多干旱和寒冷地区可以种植并在各方面表现优良的三叶草种,建立适用于高加索三叶草的ISSR反应体系,将为ISSR标记技术在三叶草属品种资源研究中的应用提供参考.本试验通过优化影响高加索三叶草ISSR-PCR的主要参数,建立适于高加索三叶草的ISSR反应体系和扩增程序.在25μL体系中各反应物的最适含量为:20 ng模板DNA,0.2 mmol/L dNTP,0.8μmol/L ISSR引物,1.0 U TaqDNA聚合酶,2.5μL 10×PCR Buffer,2.0mmol/L MgC12.PCR扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1 min,共30个循环;72℃延伸7min,4℃保温.     

甘西鼠尾草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用单因素试验和4因素3水平的正交试验相结合的方法,建立和优化甘西鼠尾草稳定的ISSR-PCR反应体系。结果表明,甘西鼠尾草20 ul ISSR-PCR体系中各因素的最佳浓度:10×Buffer(Mg2+)2μl,d NTPs 0.4 mmol/L,Tag酶1.0 U,引物0.3μmol/L,DNA 30 ng。     

半夏ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化研究

建立并优化了半夏ISSR-PCR反应体系,为应用该技术进行半夏遗传多样性研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析等提供试验依据。利用正交试验设计,从Mg2 、dNTP、引物和DNA聚合酶4种因素3个水平,筛选并建立半夏的ISSR-PCR反应最佳体系,并比较不同浓度甲酰胺、甘油和模板DNA的浓度对PCR扩增的影响。经过梯度PCR,确定适宜的退火温度。研究结果表明,利用正交试验可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份半夏种质检验证明该体系稳定可靠,可以用于半夏遗传分析。     

分蘖洋葱ISSR-PCR扩增体系的建立

以分蘖洋葱幼嫩叶片DNA为试材,采用单因素试验,对ISSR-PCR扩增体系中的退火温度、模板DNA量、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量以及引物浓度等各因素进行优化.结果表明,在反应体系为25μL反应液中,包含DNA模板40 ng(2μL),10×PCR Buffer 3μL,Mg2+(2.5 mmol·L-1)2μL,dNTPs(2.5 mmol·L-1)3μL,引物(5 mmol·L-1)3μL,Taq酶(5 U·μL-1)0.4μL,退火温度为56℃时,分蘖洋葱ISSR-PCR扩增获得最佳效果,初步建立分蘖洋葱叶片最佳ISSR-PCR扩增体系,为ISSR分子标记技术应用于分蘖洋葱种群遗传多样性分析、遗传图谱构建、核心种质资源保存利用等奠定分子生物学的理论基础和技术支撑.     

木槿ISSR-PCR反应体系的建立及优化

建立木槿ISSR-PCR反应体系,为木槿种质资源的创新与鉴定提供理论基础。采用正交试验法,对影响PCR结果的Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量及引物浓度5个因素进行分析,采用单因素试验对退火温度进行筛选,并利用最佳体系对24个木槿品种进行扩增验证。结果表明,最优反应体系(25μL)中,含10×buffer(Mg~(2+) free) 2.5μL、Taq酶0.75 U、Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.10 mmol/L、模板DNA 100 ng、引物0.5μmol/L。PCR反应程序为94℃预变性2 min;94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,34个循环;72℃延伸6 min,4℃保温。建立的体系对24个木槿品种能够扩增出清晰稳定、无拖带、多态性高的条带。     

胡枝子属ISSR-PCR反应体系的建立与优化

在利用ISSR技术对胡枝子属种质资源遗传多样性进行研究的实验过程中,对影响PCR扩增效果的一些因素如DNA的提取、模板DNA质量浓度、Taq酶用量、引物用量、dNTP的用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,筛选优化出可用于胡枝子属ISSR-PCR分析较适宜的PCR反应条件:Taq酶1.0 U,2μL的10×Buffer(200 mM Tris-HC l;200 mM KC l;100 mM(NH4)2SO4;15 mM MgC l2),模板DNA 40 ng,dNTP 0.2 m mol/L,引物0.2μmol/L.     

黑翅土白蚁ISSR-PCR体系的建立与优化

采用单因子梯度优化的方法,对已初步建立的黑翅土白蚁ISSR-PCR的反应体系在dNTPs浓度、Mg²⁺浓度、引物浓度、模板量及TaqDNA聚合酶用量等方面进行了优化。结果表明,适用于黑翅土白蚁的ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为：dNTPs 0.2 mmol·L^-1,Mg²⁺ 3.0 mmol·L^-1,引物浓度0.4 μmol·L^-1,模板用量DNA 20 ng,TaqDNA聚合酶2.5 U。     

百合ISSR-PCR反应体系的优化

为优化百合ISSR - PCR反应体系,利用正交试验设计,对百合ISSR - PCR反应体系中的5种主要因素进行优化筛选.结果表明:优化的25μL百合ISSR - PCR反应体系为dNTP 0.2 mmol/L、Mg2+ 2.0 mmol/L、引物0.5 μmol/L、模板DNA 60 ng和Taq酶1.0U,最佳退火温度为52.2℃.该体系以38个品种(种)百合进行扩增验证,得到的条带清晰、多态性高,且具有良好重复性.说明优化的百合ISSR - PCR反应体系适用于百合资源的品种(种)鉴定及遗传多样性研究.     

‘兰州百合’ISSR-PCR体系的优化

以‘兰州百合’为试材,采用CTAB法提取百合嫩叶DNA,对‘兰州百合’ISSR-PCR反应体系的Taq酶、dNTP、引物和模板DNA进行4个因素4个水平优化试验,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析,最终获得的最佳反应体系为:25μL反应体系中含Taq DNA聚合酶0.5U,dNTP 0.3mmol/L,引物0.5μmol/L,模板DNA 60ng,10×Buffer(20mmol/L Mg2+plus)2.5μL,不足部分用ddH2O补足.在获得最佳反应体系的基础上确定了引物最佳退火温度为53℃,最佳循环次数45次.该优化体系以UBC873作为引物对18份‘兰州百合’材料DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示该优化体系具有较高的扩增稳定性.