刺五加鲨烯合酶基因DNA和启动子的克隆及分析

在已克隆出的刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)基因cDNA序列基础上,利用TAIL-PCR技术克隆SS的基因组DNA及启动子序列。克隆得到刺五加SS的DNA序列长8 244 bp,启动子序列长1 984 bp,转录起始位点位于起始密码子ATG上游568 bp处。基因包括13个外显子,12个内含子,其剪切符合GT-AG原则。启动子序列含有37个顺式作用元件,其中包括128个TATA-box、38个CAAT-box等核心调控元件,并且含有部分光响应元件、激素应答的元件等顺式调控元件。本研究首次克隆出刺五加SS基因组DNA及启动子序列,为后续研究SS基因表达的调控机制有很大帮助。     

茶树硒营养代谢关键酶硒半胱氨酸甲基转移酶基因克隆及启动子结构分析

为探明茶树硒营养代谢关键酶基因硒半胱氨酸甲基转移酶（SMT,GenBank登录号： DQ480337）的表达调控规律,通过PCR和基因步移技术获得SMT的DNA全长和部分启动子序列,用PLACE、PlantCARE分析SMT内含子和启动子的序列,预测其顺式作用元件及功能。结果表明SMT基因全长5473bp,有7个外显子和6个内含子,内含子富含光响应元件,激素响应元件和抗逆性相关元件,通过基因步移法克隆得到的SMT启动子长375bp,除了含核心启动子保守元件TATA-box和CAAT-obx外,还有其它重要顺式作用元件,如光响应元件、低温响应元件和胚乳表达特异性元件等。植物硒营养代谢关键酶SMT启动子的克隆及结构分析为进一步揭示SMT基因的生物学功能和表达调控机制奠定了理论基础。     

花生蔗糖合成酶基因的克隆及序列分析

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶,在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要作用。为揭示蔗糖合成酶基因在花生中的抗逆机理,以花生基因组DNA为模板,利用染色体步移技术(GenomeWalking)中的TAIL-PCR技术扩增花生SuSy基因组序列和启动子区域,得到基因组序列6 189 bp,启动子预测分析表明,该序列包含约800 bp的启动子上游调控序列,13个外显子,12个内含子。启动子元件分析显示,该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box,并存在低温响应元件LTR、GA响应元件、干旱响应MYB结合位点、厌氧诱导必要的顺式作用元件ARE等调控元件,及G-box、box4等光响应元件,说明花生SuSy基因的表达可能受低温、干旱、缺氧、光照等环境因素以及激素GA的调控。     

核盘菌分枝酸变位酶同源效应蛋白启动子的克隆及功能分析

为了进一步研究分枝酸变位酶同源效应蛋白在核盘菌与植物互作过程中的作用机制,对其启动子进行了克隆和功能分析。采用启动子在线软件Promoter 2. 0和Promoter scan分析分枝酸变位酶同源基因的上游序列,寻找其启动子位点和顺式作用元件,然后通过PCR技术克隆预测启动子的DNA序列,构建荧光蛋白GFP融合载体,转化核盘菌,最后通过检测GFP荧光信号来验证启动子功能。经生物信息学分析发现,该效应蛋白基因上游具有启动子序列特征,包含TATA盒和CAAT盒等顺式元件,采用引物XS1-1和XS1-2进行PCR扩增,得到了733 bp启动子序列,序列包含相关的启动元件,然后以质粒pBlunt NAT-GFP为基础,将经PCR克隆得到的启动子(N-Pro)片段连入载体中,构建得到启动子N-Pro+GFP融合载体,通过REMI技术转化核盘菌原生质体,潮霉素筛选得到了一些转化子,PCR验证融合载体整合到了核盘菌基因组DNA上,最后经荧光显微镜检测到了菌丝GFP荧光信号,结果表明,克隆的分枝酸变位酶同源基因ATG上游733 bp的DNA序列具有启动子功能。     

棉花中GhTFL1a和GhTFL1c基因的表达及启动子分析

从陆地棉中克隆了磷脂酰乙醇胺结合蛋白GhTFL1a和GhTFL1c基因,并对该基因进行表达分析、启动子预测和启动子活性研究。利用启动子分析软件PlantCARE预测得出,GhTFL1a启动子区域有脱落酸响应元件、干旱诱导的MYB结合位点和顶芽特异表达响应元件等;GhTFL1c启动子区域有乙烯响应元件、干旱诱导的MYB结合位点和水杨酸响应元件。因此,将pGhTFL1a和pGhTFL1c分别构建到启动子检测载体pBI121-GUS上形成融合表达载体,通过烟草瞬时转化检测得出这2个基因的启动子都具有活性。实时荧光定量PCR分析表明, GhTFL1a和GhTFL1c在光周期处理和不同材料的陆地棉(栽培种和半野生种)中表达模式呈相反趋势。GhTFL1a基因受脱落酸(abscisic acid, ABA)、水杨酸(salicylic acid, SA)和盐胁迫诱导,而GhTFL1c可以响应赤霉素(gibberellin, GA)、SA和ABA胁迫。研究结果初步表明,GhTFL1a和GhTFL1c可能参与了植物逆境胁迫脱落酸和水杨酸响应的调控,为在棉花中进一步阐明其功能奠定了基础。     

辣椒14-3-3蛋白基因家族全基因组鉴定与表达特征分析

14-3-3蛋白(GRF)基因家族通过与靶蛋白相互作用,广泛参与植物激素信号转导和生理代谢过程,在植株生长发育和逆境响应中发挥重要作用。本研究以辣椒(Capsicum annuum)为材料,利用生物信息学研究方法,鉴定得到15个辣椒14-3-3基因家族成员,命名为CaGRF1～CaGRF15。系统分析了CaGRF基因家族成员的结构、进化关系、启动子顺式作用元件、组织及冷胁迫表达,并对CaGRF蛋白互作网络进行预测。结果表明,根据进化关系CaGRF家族成员被分为ε类和非ε类,ε类CaGRF含有更多外显子和内含子;启动子序列分析发现CaGRF启动子中有多个响应激素、胁迫、光的顺式作用元件;表达分析表明CaGRF各成员在辣椒各组织和冷胁迫响应中特异性表达;蛋白互作网络预测发现CaGRF可能与氮代谢、质子转运、转录调控相关蛋白互作。本研究为深入研究辣椒14-3-3家族成员功能及调控途径提供了参考。     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

苹果MdSGR2基因克隆及植物超表达载体构建

STAYGREEN(SGR)基因在植物叶绿素降解代谢过程中起重要作用。为探究苹果SGR2基因的生物学功能，利用RT-PCR技术从澳洲青苹成熟果皮中克隆得到MdSGR2基因，利用生物信息学分析软件对其编码蛋白进行了同源性、理化性质、蛋白结构、启动子顺式作用元件等预测和分析，并构建其植物超表达载体。结果表明，MdSGR2基因完整开放阅读框(ORF)cDNA序列为840 bp,编码279个氨基酸，该蛋白属于Staygreen超家族。理化性质分析表明，该蛋白分子质量为31.27 ku,等电点pI为8.52,属不稳定亲水蛋白。同源性分析表明，MdSGR2蛋白与秋子梨SGR同源性最高，达84.12%。蛋白质结构分析表明，该蛋白二级结构和三级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲构成，二者比例分别为40.50%,44.44%。启动子分析表明，该基因启动子区域包含低温顺式作用元件、光响应元件和脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯响应元件等诱导型顺式作用元件，说明MdSGR2基因可能受环境和激素等多种因素的调控。同时研究成功构建了MdSGR2基因植物超表达载体pCAMBIA2301-MdSGR2。     

甘蓝型油菜A7-FT启动子的功能分析

为了利用PCR技术得到甘蓝型油菜A7-FT基因启动子序列,根据甘蓝型油菜全基因组序列,利用启动子在线预测软件预测其功能与结构,根据其预测的顺式元件的分布,从5′端开始缺失的方式获得5个不同片段长度的启动子序列。构建含不同片段长度启动子的GUS基因表达载体,利用农杆菌介导拟南芥,得到T_2幼苗,经过GUS染色与脱色,探讨A7-FT基因启动子的功能,为研究甘蓝型油菜开花调控机制提供理论基础。通过PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因DNA中获得A7-FT基因启动子序列。利用PLACE和PlantCARE在线工具对该段序列进行预测,发现A7-FT基因启动子除了存在启动子核心元件CAATbox和TATAbox,还有光应答元件、激素应答元件、胚乳表达应答元件、抗逆性应答元件、生理控制相关的顺式作用元件。基于预测的顺式作用元件的分布情况,设计特异性引物,克隆不同片段长度启动子,与pCAMBIA1303载体构建5′端缺失载体,分别命名为M1、M2、M3、M4、M5。通过农杆菌介导拟南芥,GUS染色与脱色结果显示,在-1 549～-238可能存在一些负调控元件的结合位点,而-238～+1区域是该启动子的核心区段。     

菊芋果聚糖合成酶基因1-FFT启动子克隆与功能分析

本研究通过Tail-PCR方法分离到菊芋1-FFT基因上游长度为1 611 bp的片段(FFTP)。神经网络启动子在FFTP序列中预测到8个启动子核心结构,瞬时表达结果显示起始密码子上游400 bp的启动子核心结构域与1 611 bp的启动GUS基因表达的活性无明显差异,表明-296到-246区域就是1-FFT基因的启动子区域。PlantCARE分析表明,FFTP序列中除基本启动子元件(TATA-box和CAAT-box)外,还含有与MYB转录因子结合的元件3个,参与光调控的顺式作用元件12个,茉莉酸反应、厌氧过程、脱落酸、抗逆反应的元件各2个,昼夜节律控制、生长素和赤霉素反应的元件各1个。这些顺式作用元件的鉴定为1-FFT参与相应的生物学过程提供理论依据。     

烟草叶绿体16S启动子的克隆改造及转基因植株的获得

设计引物并克隆了烟草叶绿体16SrDNA基因的启动子,并在其下游加入了rbcL基因的SD序列,以使该启动子能有效翻译外源基因;进一步以aadA基因作为外源基因,以psbA基因的3’序列为终止子,构建成aadA基因表达盒;将此表达盒插入烟草叶绿体同源片段trnK-psbA-trnH中,构建成烟草叶绿体转化及表达载体p16T。用基因枪微弹轰击转化     

棉花转录因子GhSNAC3启动子的克隆与表达分析

为研究棉花NAC转录因子基因GhSNAC3启动子的结构和功能,以鲁棉研32号基因组为模板,用PCR扩增的方法得到棉花基因GhSNAC3的启动子序列,利用分析网站PlantCARE、PLACER和BDGP对启动子上存在的顺式作用元件进行了预测与分析,在此基础上利用该启动子及GhSNAC3基因构建植物表达载体,并通过烟草遗传转化进一步研究启动子的转录活性。结果表明GhSNAC3启动子除含有CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有茉莉酸、赤霉素和脱落酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件。采用不同胁迫处理转基因烟草并进行表达分析,结果显示GhSNAC3在盐胁迫下植株根部有高水平的表达,而在茎和叶中表达量极低,表明GhSNAC3在逆境胁迫应答过程中可能具有重要功能,其启动子是一个盐诱导型启动子,具有组织特异性。研究结果为棉花NAC信号通路研究和耐盐基因工程改良提供了理论依据。     

烟草脱水素基因NtDEH1的克隆及研究

为研究脱水素在植物早期胚胎发育中的作用和机理,采用显微操作技术获得烟草卵细胞并构建其c DNA文库,从中筛选到一个脱水素基因NtDEH1。通过RACE技术获得该基因全长,基因组测序结合生物信息学分析表明该基因拥有一段长度为651 bp的完整开放阅读框和一段535 bp的内含子,编码由217个氨基酸残基组成的蛋白质,其理论等电点为5.27,属于酸性蛋白,且具有一定的亲水性。氨基酸序列比对分析发现在许多物种比如绒毛状烟草、林烟草、甜辣椒、番茄、马铃薯和丹参中都具有与NtDEH1蛋白非常类似的保守的同源序列,均具有SK2型脱水素特征。借助Genome walking技术获取NtDEH1基因约1 706 bp的5'侧翼序列,使用小叶烟草瞬时表达系统检测到其具有较强的启动子活性。该研究为进一步了解脱水素基因NtDEH1在植物生殖发育中的具体功能打下基础。     

棉花光合基因GhRCAα启动子的克隆及活性分析

为了克隆棉花Rubisco活化酶基因(RCA)启动子,研究其表达调控的分子机制,以百棉1号为材料,对GhRCAα启动子区2 000 bp的片段进行克隆、顺式作用元件分析以及活性分析,结果表明,许多重要的顺式作用元件包括响应于光、生物钟、逆境胁迫、植物激素以及其他的基本顺式作用元件特异地存在于GhRCAα启动子区;进一步对GhRCAα进行表达特性分析发现,该基因在光合作用进行的主要位置叶片中表达量最高,在其他组织表达量很低,其表达具有组织特异性,这与该启动子区存在许多光响应及组织特异性表达相关元件的结果相一致;将克隆的GhRCAα启动子片段以烟草叶片为受体材料进行瞬时表达分析表明,GhRCAα启动子可以驱动GUS基因的表达,表明克隆的启动子片段具有驱动目标基因表达的活性。克隆的GhRCAα启动子可能是一种组织特异型启动子,有望用于植物的遗传转化,进而更好地调控重要基因的特异性表达。     

陆地棉GhRACK1启动子的克隆与缺失分析

在基因工程发展中,有应用前景的纤维特异表达启动子的缺乏是制约棉花纤维品质改良的主要因素之一。本研究利用反向PCR的方法克隆到陆地棉纤维优势表达基因GhRACK1的上游启动子GhRACK1-P。GhRACK1-P全长为1987 bp,含有TATA-box、CAAT-box、MYB2和I-box等顺式作用因子和调控元件。根据调控元件的分布对GhRACK1-P进行不同程度的缺失,获得了p1、p2、p3和p4缺失体;构建不同缺失体和全长GhRACK1-P的植物表达载体并通过农杆菌介导法导入烟草,获得不同类型转基因烟草。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子GhRACK1-P只能驱动gus基因在转基因烟草的幼根及根毛中表达,其它缺失体驱动gus基因在转基因烟草的花粉、叶片和根中表达,为组成型表达启动子。由于根毛与棉花纤维具有相似的发育机理,推测全长GhRACK1-P可能为纤维优势表达启动子。研究结果为棉花纤维品质改良基因工程提供了新的调控元件。     

rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究

根据GenBank上公布的rd29A基因序列(D13044),利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了rd29A基因的启动子片段.序列分析表明,该片段与D13044有99%的同源性,它包括了DRE等4种完整的顺式作用元件.与GUS基因融合构建双元植物表达载体pBI-rd.转基因烟草的GUS活性组织染色分析及Northern杂交分析均表明,3种胁迫处理均可诱导GUS基因大量表达.其中,15%PEG和0.5%NaCl胁迫处理的转基因烟草比0℃低温处理的转基因烟草的GUS表达量高,而未经胁迫处理的转基因烟草的GUS基因只有少量表达.这些结果表明,rd29A属胁迫诱导型启动子,当植物遭受逆境胁迫时,rd29A启动子可以驱动下游目的基因超量表达,这就为通过基因工程途径提高植物抗逆性奠定了基础.     

白桦4CL基因启动子克隆及表达分析

为研究4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)在白桦木质素合成代谢过程中的组织特异性表达,利用染色体步移法克隆其启动子,用该启动子定向置换pBI121载体的35S启动子,构建重组载体P_(4CL)::GUS。利用瞬时转化法将重组载体转入白桦实生苗茎后进行GUS染色。结果显示:获得了4CL基因编码区起始密码子上游长1344 bp的启动子序列,该启动子除分布有TATA-box、CAAT-box等基本的转录起始元件外,还存在多个顺式作用元件序列位点,包括35S启动子作用元件ASF,参与脱落酸响应的顺式作用元件ABRE,参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控元件CGTCA-motif,以及光反应元件G-Box、ACE、4CL-CMA2b等;启动子表达分析结果显示经过瞬时侵染的白桦茎段被染成蓝色。以上结果表明克隆获得的4CL基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了白桦木质部的发育。     

巴西橡胶树小橡胶粒子蛋白（SRPP）基因启动子的克隆及其功能分析

摘要：小橡胶粒子蛋白（SRPP）是巴西橡胶树中参与橡胶生物合成的重要蛋白因子之一。SRPP的氨基酸序列与橡胶延长因子（REF）和菜豆胁迫相关蛋白（PVSRP）的同源性分别为72%和68%。为了进一步研究SRPP基因表达及其调控的机制,作者采用接头连接介导的PCR散步法（ligation-mediated PCR）,克隆了SRPP基因的启动子。序列分析表明,SRPP基因启动子中与光诱导相关的顺式元件占39%,可能属于光诱导型启动子,因此,SRPP基因的表达可能受光信号的调控。此外,SRPP基因启动子还具有热激响应元件（HSE）、干旱胁迫响应元件（MBS）、防卫和胁迫响应元件（TC-rich repeats）、脱落酸响应元件（ABRE）、赤霉素响应元件（GARE）和激发子响应元件（EIRE,W box）等,这表明橡胶树SRPP基因不仅参与调控橡胶生物合成,而且可能是橡胶树中响应逆境信号的抗性基因,在橡胶树抵御逆境胁迫的生理过程中发挥重要作用。     

高粱Na~+转运蛋白基因SbSKC1的克隆及其在烟草中的抗盐功能鉴定

钠离子转运蛋白基因在植物抵御逆境胁迫中起重要作用,本研究克隆了高粱钠离子转运蛋白基因SbSKC1(XM_002457691.1),其完整开放阅读框包含1497个核苷酸,编码498个氨基酸残基。氨基酸序列比对及进化树分析表明,SbSKC1与玉米(Zea mays)LOC100382359(NP_001162576.1)具有高度相似性。构建pSH-SbSKC1植物表达载体,利用农杆菌介导法将SbSKC1转入烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthin)。转基因植株经PCR验证后进行300 mmol L~(–1)NaCl胁迫处理,转基因植株的存活率高于野生型,其根长显著高于野生型,而且转基因烟草保持了较高的钾钠离子比。盐胁迫后,转基因烟草的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性显著高于野生型,而过氧化氢(H_2O_2)含量比野生型烟草低37.7%。根据以上结果推断,过量表达SbSKC1基因能够提高烟草的抗盐性。