李斯特氏菌因子血清的制备及食品检测的免疫磁性分离-PCR(MIPA)方法的建立

首先进行了李斯特氏菌因子血清的研制，制备出了可对所有李斯特氏菌分型的 １５ 个 Ｏ 抗原因子和４ 个 Ｈ 抗原因子的因子血清。利用复合因子血清的多克隆抗体包被磁性球，对食品中的单核细胞增多性李斯特氏菌进行免疫磁性分离，并与 Ｐ Ｃ Ｒ 方法相结合，建立了检测食品中单核细胞增多性李斯特氏菌的 Ｍ Ｉ Ｐ Ａ方法（免疫磁性分离—聚合酶链反应方法，ｍ ａｇｎ ｅｔｉｃ ｉｍ ｍ ｕｎｏｐｏｌｙｍ ｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）。对菌液、模拟样品的检测表明，本方法能够有效地克服食品基质、培养基成分和杂菌对 Ｐ Ｃ Ｒ 检验的干扰作用。食品样品在 Ｅ Ｂ增菌液中增菌 １２ ｈ 后，检测的敏感度达 ５ Ｃ Ｆ Ｕ／ｍ Ｌ，可以在 ２０ ｈ 内完成检测。本方法对实际食品样品的检测结果，与国家标准检验方法检测的结果一致。     

单核细胞增多性李斯特菌的毒力因子及检测研究进展

单核细胞增多性李斯特菌是危害公共卫生和食品行业的一种重要人畜共患病致病菌,笔者就单核细胞增生李斯特氏菌的主要毒力因子、特异性鉴别基因和检测方法进行综述。     

快速,特异检测李斯特菌单抗—夹心ELISA方法的建立及应用

本研究以高度特异的，针对单核细胞增生李斯特氏菌，无害李斯特氏菌，格氏李斯特氏菌共同表位的单抗ＬＪ１０Ａ为捕捉抗原抗体和酶标抗体，建立了快速检测该菌的单抗夹心法ＥＬＩＳＡ方法，该方法对单核细胞增生李斯特菌的最小检出量为５×１０＾５个菌／ｍｌ，人工模拟样品至少可检出５个菌／１０ｇ样品，并在４８小时内报告结果，在实际应用中，我们以该法检测了２４０份肉样和８５０份奶样，并平行以改良ＭｃＢｒｉｄｅ琼脂分离国     

快速、特异检测李斯特菌单抗-夹心ELISA方法的建立及应用

本研究以高度特异的、针对单核细胞增生李斯特氏菌、无害李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌共同表位的单抗ＬＪ１０Ａ为捕捉抗原抗体和酶标抗体，建立了快速检测该菌的单抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。该方法对单核细胞增生李斯特菌的最小检出量为５×１０５个菌／ｍｌ。人工模拟样品至少可检出５个菌／１０ｇ样品，并在４８小时内报告结果。在实际应用中，我们以该法检测了２４０份肉样和８５０份奶样，并平行以改良ＭｃＢｒｉｄｅ琼脂分离细菌相比较，证实该方法的敏感性和特异性分别达到１００％和９６．９％。     

食品中产单核细胞李斯特菌PCR检测方法的建立

根据产单核细胞李斯特菌hlyA基因设计引物,进行PCR扩增,检测该方法的特异性和灵敏度。人工污染样品经Half-fraser和Fraser增菌后进行PCR检测。结果表明,产单核细胞李斯特菌扩增出234bp的条带,对照菌未扩增出目的条带。该方法的灵敏度为104cfu/mL。人工污染样品的检出限为8cfu/25g,说明PCR方法检测食品中产单核细胞李斯特菌具有快速、特异、敏感等特点,具有较高的实用价值。     

石河子地区动物性食品中单核细胞增生李斯特菌的检测

目的了解新疆石河子地区动物性食品中单核细胞增生李斯特氏菌(LM)污染状况。方法在石河子地区选取5个具有代表性动物性食品零售点,对最常食用的生鲜猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、冻鸡肉、冻虾和冻带鱼8类动物性食品进行随机采样,采用病原分离培养和PCR法对样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行检测。结果检测8类249份食品样品,细菌分离鉴定阳性样品12份,平均阳性率4.82%;PCR法检测阳性样品36份,平均阳性率为14.46%。结论石河子动物性食品中LM的污染比较普遍,尤以冻鸡肉和冻虾LM污染较重,新鲜猪肉、牛肉和羊肉LM污染程度较轻。     

用四重PCR检测方法检测产单核细胞李斯特菌

为了同时快速准确的检测产单核细胞李斯特菌以及是否为有毒力的产单核细胞李斯特菌,根据相关文献报道的四重PCR方法,针对该菌的种特异性基因inl A基因进行引物设计,扩增片段大小为800bp,结果应用该PCR法可特异性的扩增出目的基因片段,与GenBank上发表的序列同源性为97.3%。同时通过对毒力基因inlB,inlC和inlJ的检测用来判断菌株的相关毒力。而同一属的其他菌种无害李斯特菌(L.innocua),韦氏李斯特菌(L.welshimeri)均无特异条带,嗜水气单胞菌(J-1),产气荚膜梭菌(C57-13),大肠埃希菌(ATCC 25922),鼠伤寒沙门菌(C79-32),金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)结果均为阴性。对临床上送检的23份样品进行四重PCR方法检测并同时与国家标准GB/T22429-2008食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验中使用的检测方法进行比对,两种检测方法的结果完全符合,均检测出7份阳性样品。并且四重PCR法表明这7份阳性样品中的产单核细胞李斯特菌均携带有3种毒力因子(inlB,inlC和inlJ),因此该四重PCR法可用于快速鉴定是否是有毒力的产单核细胞李斯特菌,为有效预防控制产单核细胞李斯特菌污染提供技术支撑。     

单增李斯特氏菌检验

本研究对肉、胴体拭子等400份单增李斯特氏菌样品进行前增菌,然后用荧光PCR方法对前增菌样品进行检测,挑取阳性样品进行后续的分离、鉴定.结果显示,本研究在传统单增李斯特氏菌分离、鉴定方法基础上增加了荧光PCR初步筛选,提高了检测的灵敏度与特异性,省工省时,最终分离到5株单增李斯特氏菌.     

应用PCR检测单核细胞增多症李氏菌的研究

以二对位于单核细胞增多症李氏菌β－溶血素基因内的２６－ｂｐ寡核苷酸为引物，用ＰＣＲ对单核细胞增多症李氏菌进行了检测，结果所有株单核细胞增多症李氏菌均扩增出１８６－ｂＰ的特异条带，其它种李氏菌和细菌均呈阴性反应。本方法可测出模拟肉样中少至９２个细菌，模拟奶样中少至１８个细菌，其特异性和敏感性不受其它污染杂菌ＤＮＡ的影响。对市售猪肉和牛奶的检测结果表明，ＰＣＲ法优于传统的分离培养法，具有快速、简便和敏     

冷冻食品中单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定

随机从锦州市的超市中采集速冻食品,通过细菌的增菌、分离纯化、生化鉴定确定是单核细胞增生性李斯特菌。通过细菌的血清学鉴定确定其血清分型。通过本研究了解单增李斯特菌在速冻食品中的污染情况,为防治疾病提供依据。     

单核细胞增生性李斯特菌LAMP-浊度/荧光检测方法的建立

将环介导等温扩增技术(LAMP)分别与浊度信号检测系统(turbidimeter)和荧光信号检测系统(fluorescence)相结合,建立了LAMP-浊度/荧光单核细胞增生性李斯特菌检测方法。选择单核细胞增生性李斯特菌保守毒力基因iap序列,通过环介导等温扩增引物设计在线软件设计4条特异性引物,进行反应条件的优化,并对建立的LAMP的特异性和灵敏度进行评价分析。结果表明,构建的LAMP-浊度信号检测方法优化后的扩增温度为61℃,菌液最低检测浓度为22.1 CFU/mL,灵敏度是普通PCR扩增方法的10倍;LAMP-荧光信号检测方法优化后的扩增温度为64℃,菌液最低检测浓度为2.21 CFU/mL,灵敏度是普通PCR扩增方法的100倍;建立的两种LAMP方法的特异性良好,其中1株单核细胞增生性李斯特菌标准菌株和1株本试验分离保存的单核细胞增生性李斯特菌检测结果均为阳性,8株非单核细胞增生性李斯特菌检测结果均为阴性。利用两种LAMP方法对630份肉类及其制品、人工污染样品等进行检测,检出45个LAMP阳性,与国标法(GB)检测结果一致。结果表明,建立优化的单核细胞增生性李斯特菌LAMP-浊度/荧光检测方法具有快速、特异、灵敏等特点,特别适用于基层兽医、食品及口岸一线部门对单核细胞增生性李斯特菌快速筛查工作。     

兔李斯特氏菌病的检疫

李斯特氏菌病或称李氏杆菌病,是一种散发性传染病,以全身血液中毒-败血症和子宫炎及流产为特征.本病的病原为单核细胞增多性李氏杆菌(或单核细菌增多性李斯特氏菌、产单核细胞李氏杆菌).     

3种食源性细菌免疫磁珠联合ATP发光检测技术研究

沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌是食品中常见的致病菌,在国内外常引起食源性疾病。为解决食源性疾病中的微生物检测问题,本研究将免疫磁珠技术和ATP发光技术联合用于食品微生物检测,选择沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌病和金黄色葡萄球菌为检测对象,建立快速检测这3种常见食源性病原菌的富集及检测新方法。该方法在显著缩短预增菌时间的条件下,通过免疫磁珠的富集作用获得与常规增菌时间同样的效果,样品中的微生物浓度增加了10倍,大大提高了样本检出率,缩短了检测周期。结果表明,本研究建立的免疫磁珠富集后联合ATP发光技术具有快速、敏感、特异和低廉的优点,可用于检测食品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌以及金黄色葡萄球菌,具有较好的推广应用前景。     

使用二重PCR方法快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

本研究以单核细胞增生性李斯特菌Hly基因和InlA基因作为靶序列设计2对引物,建立了检测单增李斯特菌的二重PCR方法。结果表明,该方法可以同时扩增出单增李斯特菌的Hly基因和InlA基因,而对大肠杆菌、沙门氏菌等食品中的常见致病菌和英诺克李斯特菌均不能扩增出任何条带,表现出良好的特异性。二重PCR方法的最低检测限为104CFU/mL,并能够用于鉴定实验小鼠攻毒后内脏器官的单增李斯特菌分离培养物。该方法表现出良好的特异性、敏感性和通用性,适用于单增李斯特菌的快速鉴别检测。     

冷冻食品中单核细胞增多性李斯特菌的分离鉴定

随机从锦州市的超市中采集速冻食品,通过细菌的增菌、分离纯化、生化鉴定确定是单核细胞增多性李斯特菌。通过细菌的血清学鉴定确定7株单增李斯特菌的血清型分别是3株为1/2b,2株为1/2 a,2株为1/2 c。通过本研究了解单增李斯特菌在速冻食品中的污染情况,为防治疾病提供依据。     

PCR快速检测猪肉中单核细胞增多症李氏菌试剂盒的研制

ＰＣＲ快速检测猪肉中单核细胞增多症李氏菌试剂盒的研制杨百亮，丁伟（山西农业大学动医系，太谷０３０８０１）薛应照（山西临猗县动检站）单核细胞增多症李氏菌是一种重要的人兽共患和食品卫生病原菌，已引起世界各国的高度重视，被列为９０年代食品中四大病原菌之一，...     

应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。     

丹东地区出口动物产品中李斯特菌污染调查分析

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种能引起人畜共患病.在自然界分布广泛,可造成各种食品的外源性污染.该菌致病性强,病死率高,不易被寒冷日晒等强烈因素所杀灭.近年来,世界各地,特别是北美和西欧由食品感染的单核细胞增生性李斯特菌病患者数目呈上升趋势,并且死亡率高,国外对该菌高度重视,世界卫生组织(WHO)将其列为90年代食品中四大致病菌之一.本文选取丹东地区出口动物产品521份,进行了单核细胞增生性李斯特菌监测,检测结果报告如下.     

高度特异的李斯特菌单抗试剂的研制及鉴定

以单核细胞增生李斯特菌制备免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术，建立了３株能稳定分泌抗单核细胞２增生李斯特菌，无害李斯特菌和格氏李斯特菌的单克隆抗体的细胞系，分别是ＬＪ１０Ａ，ＬＭ１１和ＬＢ５，而与其余种的李斯特菌和属外细菌不发生交叉反应。     

针对单增李斯特菌iap基因PCR检测方法的建立及其应用

为了建立快速、简便的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)PCR检测方法,试验根据Gen Bank上已发表的单增李斯特菌iap基因序列,设计1对特异性引物,通过优化各种条件建立针对iap基因的单增李斯特菌的PCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行评估及初步临床应用。结果表明:建立的PCR检测方法的最佳退火温度为60℃,Mix最佳使用量为12.5μL,模板使用量为30 ng;该方法对单增李斯特菌纯培养物的检测限为1×105cfu/m L,且能够区分单增李斯特菌和英诺克李斯特菌,对沙门氏菌、大肠杆菌及猪链球菌均无交叉反应;对42份疑似感染单增李斯特菌临床样品进行PCR检测,有7份扩增结果呈阳性,与传统分离培养结果一致。说明试验所建立的PCR方法可用于食品中单增李斯特菌的检测。