传统技术与现代分子生物学技术在瘤胃微生物多样性方面的研究

在反刍动物的瘤胃内存在着复杂、多样、非致病的各种微生物,包括瘤胃原虫、瘤胃细菌和厌氧真菌,还有少数噬菌体。从1843年Gubry和Delaford在反刍动物瘤胃内发现微生物起,到20世纪初,由于受到研究条件和技术的局限性,许多研究工作者主要对微生物的形态分类进行研究（Hungate,1966）。20世纪70年代以来,电子显微镜在微生物研究领域的应用使得人们对瘤胃微生物的研究除了可以进行形态观察外,还可对其生长所需的营养要求、环境条件和生长特性进行深入的研究。     

瘤胃微生物多样性与分析技术的研究进展

瘤胃微生物区系是一个组成和功能极其复杂的体系,微生物的多样性决定着动物机体健康和生产性能。本文就瘤胃微生物多样性的研究进展和瘤胃微生物分类定量的技术手段以及益生菌对瘤胃微生物的作用作一综述。     

DGGE/TGGE技术在瘤胃微生物生态学研究中的应用

在分子生物学技术出现之前，人们对微生物的认识大多数是靠纯培养，或者靠直接形态观察来获得的。动物的胃肠道是一个复杂的生态环境，特别是反刍动物的瘤胃需要严格的厌氧环境，过去对瘤胃微生物的研究主要是一些经典的方法如享氏滚管法（Hungate．1969）和最大可能计数法（Dehority等，1989）。因为微生物形态简单，缺乏明显的外部特征，所以胃肠道中的大多数微生物由于难于模拟其生长繁殖的真实条件而很难培养。能培养的微生物只是天然微生物中的一小部分，     

利用分子生物学技术研究瘤胃微生物多样性的进展

在反刍动物瘤胃内栖息着复杂、多样、非致病的各种微生物．包括瘤胃细菌、厌氧真菌和纤毛虫等原生动物．还有少量噬菌体。幼畜出生前,其消化道内并无微生物．出生后从母体和环境中接触各种微生物．但是经过选择,只有少数微生物能在消化道定植、存活和繁殖．并随着幼畜的生长和发育,形成特定的微生物区系。因此,反刍动物瘤胃选择了其特定的微生物区系．这些微生物选择了瘤胃的环境,这种选择最典型的例子是只有反刍动物和单胃草食动物消化道才有厌氧真菌。     

瘤胃微生物的多样性及其研究技术

瘤胃微生物群落具有丰富的多样性,主要包括瘤胃原虫、瘤胃细菌和厌氧真菌,它们各自有其独特的功能,同时又相互联系,共同与宿主之间构成了复杂的微生态系统。为了探明瘤胃微生态系统,一方面要完善传统的微生物分离技术,另一方面要大力发展分子生物学技术,将二者结合起来进行研究。     

现代分子生物学技术在瘤胃产甲烷菌研究中的应用

瘤胃产甲烷菌代谢产生的甲烷气体,既能引起饲料能量的损失,又能引起温室效应,因此成为当前的一个研究热点.了解瘤胃产甲烷菌菌群的组成及其多样性是对其菌群结构进行调控,并最终控制甲烷产生的基础.但由于产甲烷菌培养条件要求苛刻,迄今为止只有少数几种产甲烷菌得到分离培养.现代分子生物学的迅速发展和应用,突破了瘤胃微生物不可培养的限制,极大地推动了对产甲烷菌的研究.本文综述了现代分子生物学技术在瘤胃产甲烷菌研究中的应用进展情况,并对其发展前景作了展望.     

DGGE技术及其在瘤胃微生物多样性研究中的应用

基于可靠性强、重现性高、方便快捷等优点,变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术已经成为微生物群落多样性和动态分析的强有力工具。本文在阐述PCR—DGGE原理及流程的的基础上,对DGGE技术在瘤胃微生物多样性研究中的具体应用及其局限性与改进方法进行了全面阐述。     

分子生物学技术在瘤胃细菌多样性研究中的应用

反刍动物的瘤胃是一个复杂的厌氧微生态发酵系统,研究其瘤胃微生物区系组成与功能已成为反刍动物营养学的重要内容,分子生物学技术是开展瘤胃微生物研究的重要技术手段。本文就变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、16S r DNA序列分析、宏基因组技术、DNA芯片技术等在瘤胃细菌多样性研究中的应用情况进行了总结与归纳,为今后开展此方面研究工作提供技术参考。     

瘤胃甲烷菌与其他瘤胃微生物关系和测定技术研究进展

甲烷菌是可生存于瘤胃中的一种古细菌,通过利用瘤胃代谢产生的物质如:CO_2、H_2合成甲烷。反刍动物产生的甲烷不仅会加剧温室效应的产生,还会导致饲料中能量的损失,因此对产甲烷菌进行调控的研究日益增多。产甲烷菌在瘤胃微生物中占有重要的地位,与其他的瘤胃微生物存在促进或抑制的不同关系,因此需要对甲烷菌展开更为系统的研究。论文对瘤胃甲烷菌的种类、未培养技术的应用和甲烷菌与其他瘤胃微生物之间的关系进行概述,旨在为研究甲烷菌以减少反刍动物甲烷排放量提供参考。     

瘤胃微生物生态研究方法评述

瘤胃微生物生态研究方法主要经历了微生物纯培养、混合培养、微生物分子生物学技术[(从瘤胃中提取DNA,进行PCR-16S rDNA(rRNA)技术]、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术),在不同程度上揭示了瘤胃微生物群落丰富的多样性和生态功能.但由于各种方法本身的局限性,限制了人类对瘤胃微生物的全面了解,现代生物技术和传统微生物研究方法的配合将为瘤胃微生物生态研究提供较好的前景.     

山羊瘤胃产甲烷古菌多样性及与其他动物瘤胃的比较

旨在研究山羊瘤胃产甲烷古菌的多样性并与其他动物瘤胃进行比较。采用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R研究山羊瘤胃产甲烷古菌16SrRNA基因的多样性,随机挑选100个克隆进行序列分析。结果表明,所有克隆经限制性内切酶酶切后共获得16个OTU,绝大多数为甲烷短杆菌,其中与甲烷短杆菌菌株AK-87、ZA-10、OCP、SM9和30Y序列最相近的克隆数分别为58%、19%、7%、2%和2%,还有与Methanosphaera stadtmanae(1%)、Methanobacterium aarhusense(2%)、Aciduliprofundum boonei(3%)、Methanobrevibacter sp.AK-87(4%)和Methanobrevibactersp.1Y(2%)等相似的古菌序列。将研究结果与已经报道的关于牛和绵羊瘤胃产甲烷菌多样性比较,发现不同PCR引物可检测出不同菌群结构,而饲料类型、动物种类可影响瘤胃产甲烷菌的菌群结构。     

瘤胃微生物植酸酶的分类与酶学性质研究进展

反刍动物能很大程度上依靠瘤胃微生物来消化利用饲料中的植酸盐,但目前国内有关瘤胃微生物植酸酶的研究报道较少.本文对瘤胃微生物植酸酶的主要来源和活性进行了综述分析,发现主要有5种瘤胃细菌能分泌植酸酶,其中,反刍兽新月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)分泌的植酸酶活性最高(199.1～703.6 U·mL-1);根据酶促反应的最适pH和催化机理,可将瘤胃微生物植酸酶分别归类为酸性植酸酶和半胱氨酸磷酸酶植酸酶;根据植酸酶水解植酸时的立体专一性,发现瘤胃微生物植酸酶中可能同时存在3-植酸酶和5-植酸酶2类植酸酶.最后本文论述了瘤胃微生物植酸酶酶促反应动力学特性,发现反刍兽新月形单胞菌植酸酶的最适pH为4.0～5.5、最适温度为50～55℃、对植酸和ATP表现出较强的活性;埃氏巨形球菌植酸酶的最适pH为5,0、最适温度为60℃、仅对植酸表现出活性.     

滩羊羔羊瘤胃和小肠菌群多样性的比较研究

目的 研究滩羊羔羊瘤胃和小肠菌群多样性的差异。方法 选取健康的断奶滩羊公羔,屠宰后采集瘤胃、十二指肠、空肠和回肠内容物,利用16S rDNA高通量测序技术分析瘤胃和小肠菌群结构及多样性。结果 十二指肠样品Chao1指数高于瘤胃、空肠和回肠,瘤胃样品Shannon指数和Simpson指数均高于其他部位,但差异不显著（P>0.05）。瘤胃液中拟杆菌门（Bacteroidetes）、螺旋菌门（Spirochaetae）、丝状杆菌门（Fibrobacteres）的相对丰度显著（P<0.05）高于十二指肠、空肠和回肠,十二指肠中广古菌门（Euryarchaeota）的相对丰度与瘤胃相比有升高的趋势（0.05<P<0.10）,空肠和回肠中厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度显著（P<0.05）高于十二指肠。瘤胃中的未鉴定菌属（Unidentified）、理研菌属_RC9（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、密螺旋体属_2（Treponema_2）、瘤胃球菌属_NK4A214（Ruminococcaceae_NK4A214_group）、普雷沃菌属_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）相对丰度显著（P<0.05）高于十二指肠、空肠和回肠,空肠中Family_ⅩⅢ_AD3011_group相对丰度显著（P<0.05）高于其他部位。结论 滩羊羔羊瘤胃中细菌的多样性更丰富,瘤胃微生物与十二指肠、空肠和回肠的细菌区系显著不同。     

饲粮纤维水平对育肥羔羊瘤胃微生物组成及多样性的影响

试验旨在研究提高饲粮纤维水平对育肥羔羊瘤胃微生物组成及多样性的影响。试验选择健康无病、体重相近的2月龄杜湖杂交公羔,按照体重随机分为2组,每组38只,分别饲喂不同的饲粮,对照组（LW_CK）饲粮为精料+苜蓿,处理组（LW_EG）为精料+苜蓿+全株玉米青贮+花生秧;试验期150 d,其中预试期20 d,正试期130 d,试验结束后,每组随机选择5只羔羊屠宰取瘤胃内容物,通过16S rDNA高通量测序技术分析其微生物多样性及结构变化。结果表明,处理组羔羊瘤胃中细菌多样性显著高于对照组（P<0.05）。在门水平上,处理组羔羊瘤胃中优势菌门为拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）,对照组优势菌门为拟杆菌门和变形菌门（Proteobacteria）。提高纤维水平后显著增加了育肥羔羊瘤胃中厚壁菌门的相对丰度（P<0.05）;显著降低了变形菌门的相对丰度（P<0.05）。在属水平上,对照组与处理组羔羊瘤胃菌群共鉴定出195个属,处理组优势菌属为普雷沃氏菌属（Prevotella_1）和解琥珀酸菌属（Succiniclasticum）,对照组优势菌属为琥珀酸弧菌属（Succinivibrionaceae）和普雷沃氏菌属（Prevotella_7）。提高饲粮纤维水平,增加了育肥羔羊瘤胃中解琥珀酸弧菌属、密螺旋体属（Treponema_2）、疣微菌属（Ruminococcaceae）、月形单胞菌属（Selenomonas_1）的相对丰度,显著降低了琥珀酸弧菌属相对丰度（P<0.05）。综上所述,适量提高饲粮中纤维水平对育肥羔羊瘤胃微生物菌群结构有一定影响,能够促进部分纤维降解菌的增殖,有利于育肥羔羊的瘤胃发酵和养分消化利用。     

基于16S rRNA高通量测序技术分析中国西门塔尔牛瘤胃微生物多样性和功能预测的研究

为系统探讨中国西门塔尔牛瘤胃内的微生物多样性及其功能,本试验利用16S rRNA基因高通量测序技术检测分析西门塔尔牛(20月龄,平均体重约为550 kg)瘤胃液样本菌群结构并进行PICRUSt功能预测。结果显示,两组样本通过Illumina Miseq测序平台共获得66 712条优质序列,聚类分析得到1 797个操作分类单元(OTU),经分类学鉴定分属13个门20个纲22个目33个科及59个属;厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌群,所占比例分别为62.46%和22.45%;基于属的组成,依次为粪杆菌真核菌群([Eubacterium]_coprostanoligenes_group,9.16%)、瘤胃球菌属_2 (Ruminococcus_2,7.90%)、未知属f型拟杆菌目RF16菌群(norank_f__Bacteroidales_RF16_group,6.23%)、未知属f型瘤胃菌科(norank_f__Ruminococcaceae,4.79%)、理研菌科_RC9菌群(Rikenellaceae_RC9_gut_group,4.72%)、未知属f型拟杆菌目BS11菌群(norank_f_Bacteroidales_BS11_gut_group,4.49%)、瘤胃球菌属_1(Ruminococcus_1,4.43%)等;16S rRNA基因组的PICRUSt功能预测发现,瘤胃菌群功能主要集中在碳水化合物转运及代谢上,可能含有大量的纤维素和木质素降解酶基因。综上,基于16S rRNA基因的高通量测序技术全面揭示了西门塔尔牛瘤胃菌群的多样性,并预测其含有丰富的蛋白质分解、木质纤维素降解酶系,为探索西门塔尔牛瘤胃微生物奠定基础,也为进一步挖掘与某些重要营养生理功能密切相关的瘤胃微生物功能基因提供参考。     

Analysis of Rumen Microbial Diversity and Functional Prediction of Chinese Simmental Cattle Based on 16S rRNA High-throughput Sequencing Technology

To systematically explore the microbial diversity and function in the rumen of Chinese Simmental cattle,this experiment used 16S rRNA gene high-throughput sequencing technology to detect and analyze the rumen fluid samples of Simmental cattle (about 20 months old,the average weight was 550 kg),and its function was predicted by PICRUSt.The results showed that a total of 66 712 high-quality sequences were obtained from the Illumina Miseq sequencing platform,and 1 797 operational classification units (OTU) were obtained by cluster analysis.The taxonomic identification was divided into 13 phylums,20 classes,22 orders,33 families and 59 genuses;Firmicutes and Bacteroidetes were dominant bacteria,accounting for 62.46% and 22.45%,respectively;Based on the genus composition,[Eubacterium]_coprostanoligenes_group (9.16%),Ruminococcus_2 (7.90%),norank_f__Bacteroidales_RF16_group(6.23%),norank_f__Ruminococcaceae(4.79%),Rikenellaceae_RC9_gut_group(4.72%),norank_f_Bacteroidales_BS11_gut_group(4.49%),Ruminococcus_1(4.43%),etc.The PICRUSt function of the 16S rRNA genome predicted that the rumen flora function was mainly concentrated in carbohydrate transport and metabolism,and might contain a large amount of cellulose and lignin degrading enzyme genes.In summary,the high-throughput sequencing technology based on 16S rRNA gene fully revealed the diversity of rumen bacteria in Simmental cattle,and predicted that it was rich in protein decomposition and lignocellulose degrading enzymes.The basis of microbial cognition provided a reference for further research on rumen microbial functional genes closely related to some important nutritional and physiological functions.     

饲喂蒸汽压片玉米对新疆褐牛增重、瘤胃发酵及微生物多样性的影响

【目的】通过研究饲喂蒸汽压片玉米对新疆褐牛增重、瘤胃发酵及微生物的影响,旨在探索提高肉牛增重性能和饲养效益的饲喂方法。【方法】将16头年龄(18月龄)和体重相近(436.87 kg±17.29 kg)的健康新疆褐牛公牛随机分为2组,每组8头牛。试验组精料使用蒸汽压片玉米,对照组使用普通破碎玉米,预试期15 d,正试期180 d。记录试验牛初始体重、终末体重并计算平均日增重。于试验第180天采集新疆褐牛饲喂前(0 h)和饲后1、3、5、7、9 h瘤胃液测定瘤胃发酵指标;取0 h瘤胃液利用16S rRNA分析瘤胃微生物菌群组成。【结果】与对照组相比,试验组褐牛平均日增重显著提高(P＜0.05);瘤胃液pH在1 h显著降低(P＜0.05),在3 h极显著降低(P＜0.01);瘤胃液乙酸和乙酸＋丙酸＋丁酸含量在3 h均显著提高(P＜0.05),丙酸含量极显著提高(P＜0.01);在各采样时间点,瘤胃液氨态氮和微生物蛋白含量均极显著升高(P＜0.01)。两组褐牛瘤胃液Chao1指数和Shannon指数差异均不显著(P＞0.05),在门水平上,试验组拟杆菌门相对丰度显著提高(P＜0.05),螺旋菌门相对丰度极显著提高(P＜0.01),而厚壁菌门、脱硫杆菌门、疣微菌门相对丰度均显著降低(P＜0.05),放线菌门相对丰度极显著降低(P＜0.01);在属水平上,试验组理研菌科RC9、普雷氏菌属UCG-003、毛螺旋菌科XPB1014和毛螺旋菌科NK3A2相对丰度均显著提高(P＜0.05),而克里斯滕森菌科R-7相对丰度显著降低(P＜0.05)。【结论】饲粮中使用蒸汽压片玉米能显著提高新疆褐牛公牛平均日增重,改变瘤胃发酵速度,提高发酵效率,显著增加与碳水化合物和挥发性脂肪酸代谢相关的微生物丰度,降低了纤维降解相关和可致病的微生物丰度。     

Research Progress on Cellulose Degradation by Yak Rumen Microorganism

Yak mainly lived in the Qinghai-Tibetan plateau in Qinghai province of China and lived on grasses.Many studies had shown that yak's ability to digest cellulose was far higher than Yellow cattle and dairy cows.Because there were significant differences in the rumen microorganisms among these three kinds of animals.There was a large microbial population in the yak rumen that could degrade cellulose.In this paper,the characteristics of microorganism,influence factor and the mechanism of cellulose degradation in yak were summarized.In addition,the brief introduction of the yak rumen microbial's possible applications had carried on in order to provide theoretical basis and strengthen the use of cellulose degradation bacteria in the areas such as modernization of traditional Chinese medicine fermentation and so on.     

宏基因组学揭示AFB1对牦牛瘤胃微生物多样性及CAZy谱影响

采用宏基因组学方法探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)对牦牛瘤胃微生物多样性及碳水化合物酶类(CAZy)功能谱的影响。试验设E1、E2两个试验组和对照组C,日粮中添加AFB1量分别为20μg·kg^-1、60μg·kg^-1和0。采集瘤胃液,提取DNA,进行宏基因组分析。结果表明,AFB1降低拟杆菌门及厚壁菌门的丰度,在属水平上较高水平的AFB1对普雷沃氏菌具有抑制作用。牦牛瘤胃中降解植物纤维素主要的CAZy是糖苷水解酶(GH)和糖基转移酶(GT)。AFB1对CAZy中6类酶以及3种纤维小体构成组分均产生影响,且高水平影响更大。研究揭示,AFB1降低瘤胃细菌多样性,影响CAZy功能。研究结果有利于探讨AFB1影响反刍动物瘤胃微生态的机制,为饲料安全使用及牦牛健康养殖和产品安全生产提供参考。