8周龄中外鸡种心肌、肝脏组织差异表达基因的初步分析

本文利用mRNA差异显示技术对8周龄中国地方品种丝毛乌骨鸡、引进品种白莱航蛋鸡、白洛克肉鸡进行基因差异表达分析。结果表明：三个品种鸡的心肌、肝脏组织分别检测到18和20条差异表达的基因片段。其中，心肌组织中的差异表达片段在白莱航蛋鸡与白洛克肉鸡之间最多，肝脏组织中的差异表达片段在丝毛乌骨鸡与白洛克肉鸡间最多。实验结果为寻找产蛋、产肉及肉质性状相关的基因提供了遗传学基础信息。     

不同发育阶段蒙古牛肌肉组织差异表达基因的筛选

应用mRNA差异显示技术,对两个发育阶段(16月龄和5岁龄)蒙古牛臀肌组织差异表达的基因进行研究,从分子水平分析影响不同发育阶段蒙古牛肉品质的遗传机制。经mRNA差异筛选获得6条差异表达的EST片段,与GenBank中序列进行相似性比对后发现,其中一条序列S1与牛的丝切蛋白2(cofilin 2, CFL2)基因高度同源(相似性99%),确认S1就是牛的CFL2基因;另外5条S2-S6在数据库中未发现同源序列,确定为新的EST片段。 采用相对定量PCR方法对差异表达基因CFL2进行真实性鉴定和差异表达量检测,结果显示,CFL2基因在5岁龄蒙古牛肌肉组织中的表达量是16月龄的3.8倍。过量的丝切蛋白2可以抑制单体型肌动蛋白的聚合及1型优质肌纤维的累积,其高表达可能导致了蒙古牛肉质性状的下降。     

鸡lmbr1基因外显子16的SNP检测和单倍型分析

外显子16是鸡lmbr1基因最大的外显子,本研究进行了该外显子在丝羽乌骨鸡和白洛克肉鸡间的SNP检测和单倍型分析。研究表明,鸡lmbr1外显子16的PCR-SSCP基因型在两个品种间的分布存在明显差异,测序从24个个体中检测到4个变异位点,其中T32C变异在两个品种间存在明显差异,丝羽乌骨鸡均含有32T(纯合的TT或杂合的TC),白洛克肉鸡在T32C位点都为纯合的CC;单倍型分析从24个个体中检测到5种单倍型,丝羽乌骨鸡和白洛克肉鸡的单倍型存在明显的差异,hap1和hap2是丝羽乌骨鸡的特异性单倍型,hap5是白洛克肉鸡的特异性单倍型,hap3和hap4主要存在于白洛克肉鸡中,在丝羽乌骨鸡中的比例极少。     

高铜诱导肉鸡肝脏差异表达的microRNA分析

为了研究高铜(Cu)对肉鸡肝脏microRNA(miRNA)表达的影响,试验选用1日龄健康白羽肉鸡96羽,随机分为2组,每组48羽,并分别饲喂对照日粮(Cu 11 mg/kg,对照组)和高铜日粮(Cu 330 mg/kg,高铜组),于49日龄采集肝脏,利用高通量测序技术观察高铜日粮对肉鸡肝脏miRNA表达量的影响,利用生物信息学方法对36个miRNA的靶基因进行功能分析和信号通路分析。结果表明:与对照组相比,高铜组肝脏有36个miRNA发生差异表达,其中18个miRNA为上调表达,18个miRNA为下调表达;靶基因主要行使细胞代谢、基因表达等功能,参与RNA转运、DNA复制及MAPK、胰岛素和钙等信号通路。说明高铜可影响肉鸡肝脏miRNA的表达。     

内蒙古绒山羊皮肤毛囊差异表达序列标签的筛选及分析

旨在筛选和分析内蒙古绒山羊与毛和绒生长相关的差异基因,本研究采用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)研究内蒙古绒山羊胎儿期不同日龄皮肤中控制初级毛囊和次级毛囊不同分化的差异表达序列标签。结果,共筛选了15条差异表达序列标签(dbEST登录号JK711022-JK711036),其中3条ESTs与毛囊发育有关,5条ES-Ts与次级毛囊和皮脂腺的发育有关。生物信息分析显示,JK711036与甲状腺激素受体相互作用蛋白12(TRIP12)基因有关,其他ESTs功能未知。结果表明,胎儿期初级毛囊和次级毛囊在多种代谢途径上都存在差异表达的基因,这将为进一步研究山羊毛和绒的形成分子机制奠定基础。     

乌骨鸡快慢羽的ev21和dSPEF2/dPRLR分子标记检测

鸡的快慢羽性状受Z染色体上的一对等位基因(Kk)所控制。据报道,慢羽K基因通常携带有插入的内源性病毒基因21(ev21基因)。同时,慢羽K基因还可能包含由SPEF2基因和PRLR基因的非编码区融合组成的重复片段(dSPEF2/dPRLR基因)。为明确乌骨鸡新品系的快慢羽分子结构特点,本试验选择HW1系黑羽乌骨鸡,在1日龄时,对756只健康雏鸡进行羽速观察,区分快羽和慢羽鸡。在90日龄时,分别采集快羽和慢羽鸡各40只血液,采用ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因扩增引物及双重PCR方法扩增特异性片段。结果显示:HW1系乌骨鸡的快羽和慢羽鸡比例分别为72.2%和27.8%。慢羽乌骨鸡样本采用ev21基因引物扩增电泳后出现396 bp和341 bp两条带,而快羽乌骨鸡仅出现396 bp一条带。采用dSPEF2/dPRLR基因引物扩增电泳后,慢羽乌骨鸡样本出现1950 bp和1437 bp两条带,而快羽乌骨鸡仅出现1950 bp一条带。40只快羽鸡和40只慢羽鸡的ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因PCR分型结果与出雏时的羽速观察分型结果一致。本试验表明,HW1系乌骨鸡中存在快慢羽性状,慢羽鸡的K基因上同时含有ev21插入基因和融合基因dSPEF2/dPRLR。因此后续研究中,将重点考虑以ev21和dSPEF2/dPRLR作为乌骨鸡快慢羽筛选的分子标记,达到准确区分纯合(Z~KZ~K)与杂合(Z~KZ~k)的慢羽公鸡,加快品系的选育速度。     

黑色素沉积相关基因在丝羽乌骨鸡和余干乌骨鸡胸肌和腿肌中的表达分析

试验旨在分析黑色素相关基因在丝羽乌骨鸡和余干乌骨鸡中的差异表达。试验测定丝羽乌骨鸡和余干乌骨鸡2～17周龄胸肌和腿肌肉色亮度值，比较黑色素相关基因TYR、TYRP1、PMEL和MITF在两种乌骨鸡胸肌和腿肌的差异表达量。结果显示：2周龄时余干乌骨鸡胸、腿肌和丝羽乌骨鸡胸肌肉色亮度值显著小于其他周龄（P<0.05），余干乌骨鸡6周龄胸、腿肌亮度值显著大于6周龄丝羽乌骨鸡（P<0.05）,17周龄时丝羽乌骨鸡腿肌亮度值显著大于余17周龄干乌骨鸡（P<0.05）;4个基因在2种乌骨鸡2～17周龄的胸肌和腿肌中相对表达量的变化趋势基本一致，2周龄时表达量较高，随后呈现下降趋势。同时黑色素相关基因表达量存在品种效应，2周龄时TYR和TYRP1基因在丝羽乌骨鸡腿肌中表达量较高，17周龄时MITF基因在余干乌骨鸡腿肌中表达量较高。TYR、TYRP1、PMEL和MITF 4个基因在2种乌骨鸡胸肌和腿肌中表达均呈现显著正相关（P<0.05）;4个基因表达与2种乌骨鸡肉色亮度值显著负相关（P<0.05），且对黑色素沉积呈现正调控作用。研究表明，在乌色度选种时可以将TYR、TY...     

鸡lmbr1部分内含子的克隆及其单核苷酸多态性

以丝羽乌骨鸡和白洛克肉鸡的基因组DNA为模板,采用PCR产物直接测序的方法进行鸡lmbr1基因部分内含子的克隆、单核苷酸多态性检测。结果表明,试验克隆了鸡lmbr1基因的10～14及16内含子序列,共计4 610 kb,从丝羽乌骨鸡和白洛克肉鸡中检测到67个单核苷酸多态位点（SNPs）。将提交序列与NCBI上公布的红色原鸡基因组序列比较,在这6个内含子内发现40个变异位点,其中20个为新的SNPs。基因组结构分析表明,鸡lmbr1基因约60 kb,为人类lmbr1基因的28%,内含子外显子的剪接方式符合GT-AG法则。     

鸡PDKPDK4基因的克隆及组织差异表达研究

丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)基因在动物机体的糖-脂代谢过程中起着重要的调节作用。为揭示PDK4基因对家禽生长和脂肪沉积的影响,以快速生长型肉鸡(隐性白羽洛克鸡)和慢速生长型肉鸡(杏花鸡)为试验对象,采用分子克隆、生物信息学分析和实时荧光定量PCR等方法,克隆鸡PDK4基因并分析其多态位点及在不同生长速度肉鸡组织的表达差异。克隆获得杏花鸡PDK4基因全长3 473 bp序列,并筛查到22处核苷酸多态性位点。生物信息学分析结果表明鸡PDK4蛋白与哺乳动物该基因蛋白序列之间的同源性较高,与爪蟾、斑马鱼的同源性较低;实时荧光定量PCR结果表明PDK4基因在不同生长速度的肉鸡组织中的表达存在较大差异,从组织表达来看,PDK4基因在脂肪组织中(皮脂和腹脂)的表达高于下丘脑和肝脏;从品种来看,PDK4基因在杏花鸡各组织的表达高于隐性白洛克鸡。可见,PDK4基因对家禽的生长和脂肪沉积有重要影响,是影响家禽生长和脂肪沉积的重要候选基因。     

丝羽乌骨鸡体尺性状与屠宰性能的相关性分析

试验在相同的饲养管理下对60只300日龄丝羽乌骨鸡(公母各30只)的体尺性状(体斜长、胸宽、胸深、龙骨长、骨盆宽、胫长、胸围)及屠体性状(体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重)进行测定和分析,对丝羽乌骨鸡体尺指标与屠宰性能进行相关分析,并通过SPSS统计软件测算出各性状间的回归分析。结果:公鸡的体尺性状与屠体性状均显著或极显著(P0.05或P0.01)高于母鸡。试验表明,公母丝羽乌骨鸡体型差异显著;性状间存在显著或极显著的相关。本试验结果为丝羽乌骨鸡的活体表型性状预测屠宰性能、进一步选育提供理论依据。     

应用mRNA差异显示技术筛选绵羊皮肤毛囊差异表达序列标签

为寻找与绵羊羊毛生长相关的基因,应用mRNA差异显示技术(DD-PCR)筛选拔毛皮肤与正常皮肤表达水平有差异的cDNA,用Northern blot证实差异显示基因片段,对差异基因进行测序和同源比较。经差异显示分析,共找到差异表达的序列片段21个;经2次扩增、克隆、Northern Blot分析,最终确定2个差异条带SQ70和SQ75。对这两个差异条带进行测序及生物信息学分析,发现SQ70是绵羊皮肤中与组织修复相关的EST片段,而SQ75是绵羊皮肤或者是毛囊中高表达的未知EST片段。以上结果表明,SQ70和SQ75可能是与绵羊羊毛生长密切相关的基因表达产物,对于这两个ESTs具体的生物学功能有待于进一步研究。     

利用mRNA差异显示技术克隆分析捻转血矛线虫滞育相关基因

以培养获得的捻转血矛线虫滞育期虫体及同期正常发育的虫体为研究材料,采用设计的锚定引物和随机引物,通过mRNA差异显示PCR技术对滞育期幼虫的差异表达基因进行了筛选。结果获得了74个滞育期差异表达的基因EST。生物信息学分析表明：29个差异序列与已知的捻转血矛线虫基因组序列具有同源性;14个差异序列与已知线虫的EST具有同源性。同源基因中的rps-30、T24F1.2等已被证明参与了秀丽隐杆线虫的滞育形成。差异序列的克隆为捻转血矛线虫滞育相关基因及滞育形成机制的研究奠定了基础。     

梅山与杜洛克母猪发情前期卵巢组织差异表达基因的分离与鉴定

为了探讨梅山与杜洛克母猪卵巢差异表达基因对猪排卵与繁殖性状的影响,应用mRNA差异显示技术研究梅山猪与杜洛克猪卵巢中基因表达的差异性,分离9条在纯种梅山猪与纯种杜洛克猪卵巢中差异表达的表达序列标签(ESTs),并用半定量RT-PCR鉴定。通过BLAST比对发现,其中有3条EST与GenBank序列同源性较高。组织表达谱分析揭示了这些ESTs在梅山猪心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪、小肠、大脑、卵巢、子宫、脾脏、输卵管等各个组织中的表达有不同程度的差异。研究结果表明,梅山猪和杜洛克猪卵巢之间的不同基因差异表达的方向存在差异,这些差异表达的基因可能在某种程度上导致猪繁殖力的差异,进而为研究影响猪排卵数的分子机理调控网络打下基础。     

猪肌肉组织表达序列标签(ESTs)的分析

研究构建了民猪肌肉组织cDNA文库,并在文库中随机挑选克隆进行测序,获得107个高质量的ESTs。经生物信息学分析,所研究的107个ESTs中,有98个单一克隆,其中71个为人类及其他物种的同源序列,23个为猪的已知ESTs,4个为未知ESTs。对这4个未知ESTs进行开放阅读框预测并进行BLASTn分析,没有找到高度同源的氨基酸序列。对已知功能基因表达谱的构建和分析结果表明:最多的是未分类,占47.88%;然后依次是基因/蛋白表达占26.76%、细胞代谢占9.86%、细胞结构/迁移占8.45%、细胞/机体防御占4.23%和细胞信号/传导占2.82%。     

家蚕脂肪体组织基因表达谱的研究Ⅰ.家蚕5龄中期幼虫脂肪体组织基因表达分析

以大规模EST测序为基础 ,用生物信息学方法分析了家蚕 5龄 3d脂肪体组织基因表达的特征 ,共获取脂肪体组织EST 12 72 1个。经Phrap程序拼接得到 2 316个非冗余序列 ,其中包括 82 4个contigs,14 92个singletons。在鉴定出的已知基因中 ,基因表达频率有明显差异 :物质代谢相关基因表达量最高 ,占总量的 5 8 2 % ;其次为转录翻译调节相关基因和酶类基因 ,分别占 15 5 %和 14 5 %。在高量表达基因中 ,有贮藏蛋白、蛋白酶抑制剂、类IDGF蛋白、抗菌蛋白、谷胱甘肽 S转移酶等。结果表明 ,脂肪体组织基因表达的种类很多 ,特征明显 ,与脂肪体在蚕体内的贮藏功能、蛋白质合成功能、代谢调节功能以及变态发育有密切关系。     

家蚕脂肪体组织基因表达谱的研究I．家蚕5龄中期幼虫脂肪体组织基因表达分析

以大规模EST测序为基础，用生物信息学方法分析了家蚕5龄3d脂肪体组织基因表达的特征，共获取脂肪体组织EST 12 721个。经Plarap程序拼接得到2316个非冗余序列，其中包括824个contigs，l492个singletons。在鉴定出的已知基因中，基因表达频率有明显差异：物质代谢相关基因表达量最高，占总量的58．2％；其次为转录翻译调节相关基因和酶类基因，分别占15．5％和14．5％。在高量表达基因中，有贮藏蛋白、蛋白酶抑制剂、类IDGF蛋白、抗菌蛋白、谷胱甘肽-S转移酶等。结果表明，脂肪体组织基因表达的种类很多，特征明显，与脂肪体在蚕体内的贮藏功能、蛋白质合成功能、代谢调节功能以及变态发育有密切关系。     

云南半细毛羊精子冷冻前后转录组表达差异分析

【目的】 本研究旨在对云南半细毛羊精子冷冻前后差异表达的基因与精子冷冻损伤的关系进行研究。【方法】 采用电刺激法采集3只云南半细毛羊精液,各分成2份,一份直接用于提取精子RNA,另一份经过冷冻保存7 d后再进行精子RNA提取。利用获得的精子RNA,采用单细胞转录组测序技术分别检测新鲜精子和冻融精子的mRNA转录组,构建mRNA转录组文库,用Hiseq2500测序仪进行测序,对测序结果做进一步过滤处理,然后对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路分析。【结果】 6份精液样本共产生623 399 754条原始测序序列,过滤处理后得到514 313 802条（82.50%）高质量的Clean reads。生物信息学分析结果表明,冷冻前后差异表达显著的基因共1 213个。其中,解冻后表达量下调的有1 208个,上调的有5个。通过GO功能注释和KEGG通路富集分析,差异表达基因分别归类于56个GO分类,参与40个信号通路。其中与精子功能密切相关的主要包括精子细胞过程、代谢过程、应激反应、生殖、质膜和氧化还原反应;精子冷冻前后差异表达基因参与的信号通路主要有炎症、细胞因子-细胞因子受体相互作用和细胞凋亡等通路。【结论】 云南半细毛羊精子的冷冻损伤可能与获得的差异表达基因参与的生物过程有关。此外,获得的差异表达基因也可作为分子标记物应用于绵羊冻精品质的评价。     

重度感染家蚕微孢子虫的家蚕丝腺cDNA文库构建及EST测序分析

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染家蚕品种大造的3龄幼虫,于感染后第10天选择有Nb重度感染特征的家蚕丝腺组织无菌操作提取RNA,构建Nb和家蚕丝腺混合样品cDNA文库(文库滴度≥1.6×106PFU/mL)。对文库进行测序,获得EST序列5 026条,其中家蚕丝腺EST3 901条、家蚕微孢子虫EST970条。拼接后,分别获得家蚕丝腺和Nb的单一EST(unique EST)563和383条。对EST和unique EST进行分析发现,感染后第10天家蚕丝腺中Nb的组蛋白、细胞分裂激酶等与孢子分裂增殖相关的基因表达水平较高,一些可能与Nb侵染或寄生适应相关的基因,如Nb孢壁蛋白、极丝蛋白、转运体蛋白等基因亦在此时期较高水平表达,尤其是此期间有相对高水平的组蛋白脱乙酰基酶基因表达,说明Nb基因的表达受到组蛋白去乙酰化方式的调控。对家蚕微孢子虫uniqueEST的序列特征分析发现,Nb mRNA UTR的长度和GC含量与其它微孢子虫差异较小,但ORF区的AT含量较高,即家蚕微孢子虫基因ORF序列较其它微孢子虫发生了高AT变化。Nb unique EST的功能注释及分类结果表明感染后第10天家蚕丝腺中的Nb孢子仍处于多形期,还未完全成熟化。     

猪TIMP-2基因克隆、序列特征和表达分析

本研究分析了五指山试验用小型猪TIMP-2基因的分子特性和可能的生物学功能.将人TIMP-2 mR-NA全长序列在猪ESTs数据库中检索获得同源性较高的ESTs,用电子克隆结合RT-PCR方法克隆获得包含完整CDS区的猪TIMP-2基因cDNA序列,应用生物信息学方法分析了其核苷酸序列及其编码蛋白质分子结构特性,应用RT-PCR研究该基因在猪不同组织和发育时期的特异表达情况.结果,猪TIMP-2 cDNA序列全长790 bp,包括663 bp的完整开放阅读框,编码221个氨基酸.多序列比对和系统进化分析表明,该基因编码蛋白质与人(97%)、大鼠(97%)、小鼠(97%)等物种TIMP-2蛋白质具有较高的同源性.蛋白质序列预测分析发现,猪TIMP-2氨基酸序列理论等电点(pI)为7.65,相对分子质量(MW)为24.5 ku,它包括27AA的前导序列和194AA的成熟肽段,其前导序列比其它物种多1个亮氨酸(Leu).结构功能预测发现其具有1个在种间高度保守的NTR_TIMP结构域和N端VIRAK保守序列,序列中存在的12个半胱氨酸(Cys)可以形成6对二硫键结构.表达谱分析表明TIMP-2基因在猪的多个组织和不同发育时期的表达量存在较大差异,在睾丸、垂体、胃、大肠、卵巢、子宫和90 d胚胎骨骼肌中高表达;而在心脏、小肠、脑、肝脏、成年猪骨骼肌中表达量极低;在肾脏、胸腺、脾、甲状腺、33 d胚胎中中度表达.结果表明该基因在发生组织发育和重构活动相对活跃的组织器官和时期表达水平较高,亦符合其固有生物学功能.