正交优化枣树ISSR-PCR反应体系的研究

为建立适用于枣树ISSR-PCR的最佳反应体系,本研究针对Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶和引物共4个因素分别设置4个浓度水平进行正交优化设计。采用极差、方差和多重比较的方法进行分析,以期获得最佳优化体系。研究结果表明:20μLISSR-PCR反应体系中4个因素的最佳浓度分别为2.0mmol/LMg2+、0.2mmol/LdNTPs、0.05U/μLTaqDNA聚合酶和0.6μmol/L引物。采用该优化体系对枣树不同品种进行扩增,扩增条带清晰、锐利,进一步证实了该体系的稳定性。     

烟草RAPD反应体系的建立与优化研究

以烤烟品种为材料,研究了烟草RAPD分析过程中的影响因素,包括模板浓度、Mg2+、dNTP、引物、Taq 酶、循环次数、退火温度等,建立了适于烟草RAPD分析的PCR反应体系：即在25μl反应体系中,模板用量为40ng;引物浓度为0.4μM;Mg2+浓度为2.5mM;dNTP浓度为0.2mM;Taq DNA聚合酶用量为1U。扩增程序为94℃预变性5min;然后94℃变性1min,38℃复性1min,72℃延伸1.5min,39个循环;最后72℃延伸5min。     

扁豆RAPD体系优化的探讨

以两个扁豆地方品种为材料，进行RAPD反应体系、程序的优化和引物的筛选，结果表明，在20μl的反应体系中，Taq酶浓度、Mg2^2＋浓度、引物浓度、dNTP浓度分别为3．0U，2．5、0．25、0．15mmoL／L，模板DNA浓度为60ng，反应循环数为45个循环。在这种条件下能获得理想的扩增结果，利用该体系进行引物筛选得到46条多态性引物。     

百合属RAPD反应条件优化的研究

以百合DNA为材料,对影响其RAPD反应体系中的6个主要因素(模板DNA、Mg2+、TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs、退火温度)进行优化,最终确定了百合RAPD反应的最佳体系(25μL)为:40 ng模板DNA,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U TaqDNA聚合酶,1.0μmol/L引物,200μmol/L dNTPs,引物E 13的最适退火温度为37.3℃.该体系的建立为今后应用RAPD技术鉴定百合属植物的种质资源和遗传多样性研究奠定了基础.     

棉花RAPD分析条件优化探讨

利用不同的引物、引物浓度、复性温度、ｄＮＴＰｓ浓度、Ｔａｑ酶含量等对棉花品种鄂荆１号、ＰｉｍａＳ－３进行ＲＡＰＤ分析。结果表明，高温复性有利于提高扩增带型的特异性。低Ｍｇ２＋浓度易导致小片断扩增，高Ｍｇ３＋浓度易产生非特异带型。ｄＮＴＰｓ浓度增加导致扩增带型的数目减少。双引物扩增带型与卓引物相比可以检测到更多的品种间遗传差异。根据上述分析，棉花ＲＡＰＤ分析反应物组成为：１Ｘ反应ｂｕｆｆｃｒ、１．８ｍｍｏｌ．Ｌ－１Ｍｇ２＋、０．１６ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｄＮＴＰｓ、４０ｎｇＤＮＡ、０．６μｍｏｌ．Ｌ－１随机引物、Ｔａｑ酶１．５单位，加双蒸水至２５μｌ反应体系。     

谷蠹RAPD反应体系与程序的优化

以谷蠹为研究对象,采用L16（45）正交组合实验和单因素梯度实验对MgCl2、dNTP、随机引物、Taq酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等影响RAPD扩增的重要因素进行优化,以期建立最优的RAPD反应体系与程序。实验结果表明：各因素最适条件为：25μL PCR反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl22.5 mmol/L,dNTP0.4 mmol/L,随机引物960 pmol/L,Taq酶0.5 U,模板DNA 20ng;退火温度为37℃,循环次数为45次。在对谷蠹进行RAPD分析时,采用优化的反应条件,规范实验操作,使用同厂家同批次的试剂,实验结果就会具有很好的重复性和稳定性。     

梨RAPD分析技术体系的建立及遗传多样性研究

以梨叶为试材,从DNA提取入手,通过优化扩增程序和反应条件,建立起梨的RAPD分析技术体系,并对15个梨材料进行了遗传多样性分析。结果表明：用改良SDS法提取DNA能有效抑制酚的氧化,所提DNA模板呈无色透明状,A260／A280为1.70以上,DNA（鲜重）平均产率为365.7μg/g,所提模板DNA能成功用于RAPD分析。经过梨遗传多样性分析表明,梨的DNA多态性高,多态带百分率达到81．7％,证明梨的遗传基因广泛、种质资源丰富。根据相似系数用UPGMA法聚类,将起源不同的东方梨和西洋梨明显分成两大类,证明RAPD技术能在DNA分子水平上较好地揭示梨的遗传背景及其亲缘关系。     

辣椒雄性不育RAPD体系优化及标记的筛选

本文以辣椒质核互作雄性不育为对象,进行RAPD体系优化及其标记的研究,结果表明在20 μl 的反应体系中,dNTP、 Mg2 、引物和模板DNA的浓度分别在0.3 mmol、2.5～2.75 mmol 、0.2～0.4 mmol和30～60 ng 同时添加1U Taq酶,退火温度控制在37.8～40.7℃,能够获得理想的扩增结果.利用该体系进行随机引物筛选获得不育系单显性标记5个,恢复系单显性标记7个,共显性标记2个.     

利用RAPD技术进行枣树的品种鉴定

用试剂盒法提取了5种枣树品种的总DNA,使用RAPD技术对其进行了品种鉴定.选出12种扩增较稳定的引物,来扩增5种枣树品种总DNA,共扩增出34条带,每种引物扩增出1～5条带;多态性条带共2条,多态性比例为58.82%.利用DPS软件所做的聚类分析结果表明:5个品种间可聚成2类:优系99-1(1号)、婆枣(3号)、赞皇大臻(2号)可聚为A类;优系97-4(4号)、梨枣(5号)可聚为B类,同一类品种间体现了一定的相关性.     

萝卜基因组DNA RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

对影响PCR反应的主要因子———模板DNA、引物、dNTPs和Mg2 浓度进行优化,建立起适合于萝卜基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系。RAPD反应体系(18μl)为随机引物0.4~0.6μmol/L,dNTPs0.15~0.2mmol/L,Mg2 2.0mmol/L,模板DNA10~40ng,TaqDNA聚合酶0.8U;ISSR反应体系(16μl)为引物0.5μmol/L,dNTPs0.16mmol/L,Mg2 2.5mmol/L,模板DNA10~40ng,TaqDNA聚合酶0.64U。对扩增程序中复性温度进行了梯度PCR试验,表明35~42℃(37℃)与52.4~58.3℃(55℃)分别适于萝卜基因组DNA的RAPD-PCR和ISSR-PCR反应;应用优化的RAPD和IS-SR反应体系对17个萝卜品种进行了鉴定分析。研究结果将为萝卜分子育种、品种鉴定与种子纯度检测提供重要的技术基础。     

芥蓝RAPD反应体系的建立

利用改良的CTAB方法从芥蓝叶片中提取高质量的DNA。在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,经过优化试验,确定适合芥蓝PCR扩增体系（总体积25μL）为：25mmol/LMgCl2 2.0μL、10×PCR Buffer 2.5μL、2.5mmol/L dNTPs2.0μL、5U/μLTaq酶0.25μL、5μmol/ L 引物1.2μL、模板DNA 25ng、灭菌双蒸水12.25μl。PCR扩增程序为：94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,40个循环,72℃延伸10min。     

芹菜RAPD反应体系的优化研究

本试验以一般RAPD反应程序为基础,采用单因素递进筛选方法,针对Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、随机引物和DNA模板5个主要影响因素,分别设置5个不同浓度梯度,对芹菜进行RAPD-PCR扩增,建立了芹菜RAPD技术最优体系。结果表明：25 μL反应体系中含Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+ 3.0 mM、dNTPs 0.2 mM、引物28 ng、模板DNA 70 ng,10×PCR Buffer 2.5 μL;扩增程序为：94℃预变性5 min,94℃变性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸1 min,进行42个循环,最后72℃延伸10 min。     

苏丹草RAPD反应条件的优化与应用

为研究不同因素对苏丹草随机扩增多态性DNA（RAPD）反应体系的影响，建立并优化反应体系；再利用优化体系绘制了DNA指纹图谱以区分两个高丹草品种。提取苏丹草的基因组DNA，分别设置Mg2+浓度为1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L；退火温度为34℃、35℃、36℃、37℃、38℃；Taq酶含量为0.6U、0.8U、1.0U、1.2U、1.4U进行PCR扩增。结果表明：Mg2+2.0mmol/L，退火温度36度，Tap酶活性值1.2U是进行苏丹草RAPD分析的最优反应条件。利用最优反应条件绘制了皖草2号和皖草3号的DNA指纹图谱，在该图谱中有A、B两条特征带，可以区分皖草2号和皖草3号。     

实蝇RAPD反应体系的构建与优化

以几种常见的实蝇为材料，研究了实蝇RAPD分析过程中的影响因素，包括模板DNA浓度、dNTP、引物、Taq酶、变性时间、循环次数、退火温度等，建立了适于实蝇RAPD分析的PCR反应体系：在25μl反应体系中，模板DNA用量为80ng，MgCl 2浓度为2.0mM；四种dNTP浓度各为0.2 mM；Taq引物浓度为0.5μM；酶用量为1U；扩增程序：先94℃预变性3min，再94℃变性45s、36℃退火1min、72℃延伸2min共40个循环，最后延伸10min。     

山杏RAPD反应体系条件的优化

以山杏新鲜叶片为材料,研究了山杏RAPD分析过程中的影响因素,包括Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间、循环次数等,建立了适合山杏RAPD反应的PCR体系,即20μL反应体系中含有Taq酶1.0U、Mg2+ 2.0mM,四种dNTP各0.1mM,引物0.5μM,模板DNA50ng。扩增程序为：94℃预变性4mins;94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸1.5mins,10个循环;94℃变性30s,36℃退火40s,72℃延伸60s,30个循环;最后72℃延伸5min     

人参根际土壤微生物RAPD反应体系的建立

本研究建立了一种适合于开展参地土壤微生物遗传多样性的RAPD反应体系。利用优化的RAPD反应体系,对200条RAPD引物进行了筛选,其中38条引物多态性高、扩增结果稳定。在此基础上,用筛选出的多态性RAPD引物对参地土壤微生物总DNA进行了扩增。试验结果表明,本研究建立的RAPD反应体系适合开展人参根际土壤微生物的遗传多样性研究。     

10种绣线菊DNA的提取及RAPD反应体系的优化

旨在筛选出绣线菊属 RAPD 反应的最佳体系,为绣线菊属植物种质资源遗传多样性和亲缘关系的研究奠定基础.试验以 10 种绣线菊属植物为材料,采用改良 CTAB 法进行冬芽和嫩叶的总 DNA 提取并对影响 RAPD 扩增效果的因素进行优化.通过单因素优化筛选出最佳的 20μl 反应体系10×Taq buffer 2μl,Taq 酶 1.0U,0.15mmol/L dNTP,DNA 2ng/μl,引物 0.21μ mol/L,Mg2 2.0mmol/L;反应程序94℃预变性 4min,然后进行 40 个循环94℃变性 45s,37℃退火 1min,72℃延伸 1min.最后72℃延伸5min,4℃终止反应.结果发现,采用改良 CTAB 法所提取绣线菊冬芽的 DNA 达到 RAPD 反应的要求.筛选体系扩增出清晰稳定的多态性条带,可用于对绣线菊属遗传育种方面的研究.     

枣ISSR扩增体系的建立

以冬枣DNA为研究对象,利用单因素试验,分析了Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量、引物浓度、模板DNA含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响,经优化建立了枣属植物最适ISSR-PCR反应体系,25μL反应液中包含1×PCR Buffer、2.0 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTP、1.5 UTaq酶、1.25μmol/L引物和50 ng模板,最适退火温度为58℃。PCR反应体系的建立为应用ISSR标记技术开展枣种群遗传变异分析和构建遗传图谱奠定基础。     

香蕉RAPD反应体系的建立

利用改良的CTAB方法从香蕉叶片中提取高质量的DNA。在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,经过反复试验,确定适合香蕉PCR扩增程序为：94℃预变性 5min;94℃变性 1min;38℃退火 1min;72℃延伸 2min;变性ó延伸,循环45次;最后72℃延伸 2min。PCR扩增的体系（总体积25μL）为：模板DNA 20ng,dNTP 200μmol/L,10×PCR Buffer2.5μL,引物0.20μmol/L,Taq酶0.75U,ddH2O17.85μL。