草鱼肠道组织差异表达基因消减文库的构建

以致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)人工感染的1龄草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道组织为材料,应用抑制性差减杂交技术,构建了肠道组织的消减cDNA文库.以草鱼管家基因β-actin作为差减指标检测文库差减效率达2~(10)倍,表明感染细菌后某些差异表达基因得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到A/T载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞.     

猪肝脏组织表达序列标签(ESTs)的初步分析

 构建了猪肝脏组织cDNA文库 ,并对文库中随机挑选的 4 38个克隆的表达序列标签 (ESTs)进行了研究。结果表明 ,在所研究的 4 38个ESTs中 ,186个在猪种中已有匹配序列 ,37个在人类及其它物种中可以找到同源序列 ,2 15个为未知功能基因。试验还测定了文库中 4 5个cDNA克隆的全长插入序列 ,结果表明 ,19个为已知功能基因 ,11个没有发现开放阅读框 ,其它 15个具有开放阅读框 ,但基因的功能未知。这些结果初步代表了肝脏组织的功能基因表达谱。     

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础.试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(ETA-Fe2 ,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2 ,40μmol/L)的根的总RNA,经过LD-pCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库.用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300～800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果.     

条斑紫菜孢子体cDNA文库构建及表达序列标签的初步分析

用λ噬菌体载体构建了条斑紫菜Porphyra yezoensis丝状体cDNA表达文库,并对文库进行了随机测序,对随机测序形成的719条表达序列标签(EST)序列进行了初步分析。结果表明:该文库包含1.52×106个独立克隆,重组率为88.2%;EST的冗余率为54.2%,新EST的比率为65.7%。本研究为开展条斑紫菜的功能基因克隆、分析和功能基因组学研究提供了条件。EST序列已递交Gen-Bank,编号为CX873884到CX874602。     

猪脂肪组织表达序列标签(ESTs)的研究

 对猪脂肪组织cDNA文库的2104个克隆进行EST研究,其中563个ESTs在猪种中已有匹配序列,682个在人类及其它物种中可以找到同源序列,376个ESTs为未知新基因,有298个因序列质量差无法做分析,185个在EST库中有同源序列。所分析的376个新ESTs中,其中有159个具有ORF结构,43个具有Poly(A)和CpG特征,这些结果初步显示了猪脂肪组织的功能基因表达特点。     

大规模筛选表达序列标签(ESTs)方法的改进

介绍一种改进的大规模ESTs筛选的方法。以SMARTTM cDNA Library Construction Kit所构建的毛冠鹿大脑cDNA文库为研究材料,基于该文库噬菌体可自发转化为质粒的特点,直接把噬菌体文库转化为质粒文库。随机选取平板中转化后的质粒cDNA文库克隆,振荡培养后运用菌液电泳的方法代替传统的PCR筛选法,对重组克隆进行筛选。改进的菌液电泳法可以准确鉴定出重组的质粒,并估计出插入片段的大小。该方法能更好地保持SMARTTM cDNA Library Construction Kit所构建文库的完整性,是一种简单、高效、适用于大规模表达序列标签筛选的有效方法。     

鸡卵巢组织SSH cDNA文库构建及差异表达基因筛选与初步鉴定

为分离与鸡产蛋性能密切相关的重要基因或调控因子,利用抑制性消减杂交技术,以高产蛋鸡品种海兰褐商品代蛋鸡和产蛋量相对较低的地方鸡品种大骨鸡20周龄时的卵巢组织为试验材料,构建消减cDNA文库。文库的插入片段集中在500bp左右,挑取720个克隆进行PCR筛选,获得657个阳性克隆,经过点杂交筛选后选择了536个阳性克隆,...     

镰形扇头蜱唾液腺抑制消减杂交文库的构建和分析

【目的】寻找镰形扇头蜱吸血后较吸血前唾液腺差异表达基因。【方法】以抑制消减杂交法分别构建镰形扇头蜱半饱血雌蜱和吸血雄蜱唾液腺以pGEM-T-easy为载体的cDNA文库，并测序进行生物信息学分析。【结果】分别测得247个雌蜱有效EST序列和168个雄蜱有效EST序列，并预测雌蜱可能含有5′末端和3′末端的EST序列分别为25个和44个，雄蜱可能含有5′末端和3′末端EST序列分别为53个和74个。随机选择非重复的24个雌蜱序列和21个雄蜱序列以RT-PCR方法验证消减效果；在吸血后唾液腺中，雌蜱有13个基因表达上调或新表达，消减效率为54%，雄蜱有9个基因表达上调或新表达，消减效率为43%。对所测有效序列经BLAST分析，检索247个雌蜱序列获得141个匹配，匹配率为57%，其中有32个蜱基因，占141个匹配基因的23%；检索168个雄蜱序列获得125个匹配，匹配率为74%，其中有29个蜱基因，占125个匹配基因的23%。BLAST检索结果显示这些蛋白主要包括帮助蜱口器固定免疫调节蛋白、抗凝血蛋白、加强能量代谢的线粒体蛋白和促进基因转录的各种转录因子。【结论】这些蛋白主要是为了适应蜱吸血的生理过程及应变蜱因吸血而产生的免疫防御和排斥。     

甘蓝型油菜种子不同发育期基因差异表达cDNA文库构建

以授粉后27 d的种子mRNA为目标群体,授粉后7 d的种子mRNA为对照,构建甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库.文库包括560个克隆,经菌落PCR检测,456个菌落含有插入片段,占全部克隆的91.2 %,片段大小200～600 bp.对PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到201个上调的阳性斑点杂交阳性克隆,对其进行测序,得到有效ESTs序列198个.BLASTN结果显示,134个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因,另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列.这64个ESTs序列和已知功能(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相似性.     

A/J小鼠感染猪链球菌2型后脾脏消减cDNA文库的构建及相关差异基因表达分析

为了分离与猪链球菌2型感染密切相关的基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建了8周龄A/J小鼠感染猪链球菌2型后的脾脏消减cDNA文库,并对其中169个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后共获得110条差异表达序列标签(EST)。利用GenBank的BLAST软件分析比较核酸和蛋白质同源性,发现共有36个基因与这些EST具有高度的同源性,它们分别参与细胞成分、免疫、信号转导、凋亡、转录等重要功能。这些差异表达基因主要有ATP/GTP结合蛋白1(Agtpbp1)、天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸盒多肽5、核蛋白p68、ATP-依赖RNA解旋酶、真核生物转录因子2亚基(Eif2s2)、Na+/K+-ATP酶转运β3多肽、溶菌酶1、溶菌酶2等基因。结论:这些差异表达基因在猪链球菌2型感染过程中可能发挥重要功能。     

特异茶树种质紫阳1号cDNA文库构建及ESTs初步分析

紫阳1号是一常年不开花不结果的特异茶树种质.以紫阳1号新梢为材料,采用Creator SMARTTM eDNA Library Construction技术构建了cDNA文库.经鉴定,文库的库容量为1.0×106,重组率为93%,插入片段在0.5-2.0 kb之间.经随机测序,获得594个有效ESTs,聚类拼接后得到299条单基因簇,包括98个重叠群和201个单拷贝.与NCBI核酸数据库进行比对分析结果表明,227个为已知功能基因或具推测功能的基因;46个为未知功能基因;26个为新的表达基因.这些数据为今后茶树功能基因分离克隆和功能基因组学研究奠定了基础.     

草鱼肠道胰蛋白酶同工酶GT-B的结构信息

    为了解草鱼胰蛋白酶GT-B的组成、结构与其性质之间的关系,用仪器分析结合化学分析方法.研究草鱼肠道胰蛋白酶同工酶GT-B的氨基酸组成、紫外吸收特性及其二级结构单元.氨基酸组成分析表明,GT-B有很高的酸性氨基酸对碱性氨基酸比例,含有较多的亲水性氨基酸残基,较少的半胱氨酸残基和较少的芳香性氨基酸残基.GT-B在280 nm处只有微弱的吸光度,在变性剂存在下,其紫外吸收大幅度增加,依据"二状态模型"计算得到其变性自由能为39.825 kJ.mol-1.圆二色谱(CD)测定表明,GT-B酶蛋白分子具有较少的α-螺旋、β-折叠以及β-转角等规则二级结构单元和较多的无规则卷曲结构.这些信息结合起来可以合理解释GT-B的理化、动力学和热力学等性质.     

黄芪多糖对草鱼的安全性研究

设空白对照组、推荐剂量组(每千克鱼体重每天添加10 mg)、3倍推荐剂量组、5倍推荐剂量组,空白组投喂正常日粮,试验组按剂量添加黄芪多糖,连续投喂21 d,发现喂养期间各组草鱼无异常现象,3个试验组草鱼的健康状况良好;分别在第0、8、15、22 d抽样采取试验草鱼全血及血清进行临床病理学检测,发现投喂各剂量黄芪多糖的试验组草鱼的血常规指标和血液生化指标与对照组无显著性差异;试验结束时测定草鱼的体重,试验组生长速率高于对照组,其中推荐剂量组和5倍推荐剂量组与对照组差异显著(P<0.05);对3个试验组及空白对照组的肝、肾、脾进行组织组织切片,未观察到试验组草鱼与对照组草鱼的细胞和组织结构上的异常。表明在生产应用上,以推荐剂量投喂养殖水产动物是安全可靠的,达到5倍推荐剂量时也没有安全性问题,黄芪多糖可以作为一种安全的免疫增强剂应用于水产养殖业。     

草鱼肠道胰蛋白酶同工酶GT-B的纯化及性质

深入了解草鱼消化蛋白酶的性质有利于充分探讨草鱼内脏的可利用途径和研究草鱼消化生理学.将草鱼肠道用冰丙酮脱脂,用磷酸盐缓冲溶液提取,然后经过硫酸铵粗分级沉淀,再经过离子交换层析、凝胶层析等纯化,分离得到一种碱性蛋白酶.SDS-PAGE分析表明其相对分子质量为26400.SDS-底物-PAGE以及抑制实验等表明酶可以水解酪蛋白和N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE),其活性被大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)和甲苯磺酰氟(PMSF)强烈抑制,表明这是一种胰蛋白酶,命名为GT-B.用BAEE作底物时,该酶的最适作用温度为45℃,在65℃加热20 min,酶活性基本丧失;最适作用pH为8.5,在pH5.5～10.5范围内保持稳定,但在酸性环境里很容易失去活性.该酶的Vmax和Km值分别为3.33×103 min-1和31.68 μmol·mL-1,其生理转化效率高,为105.26 mL·μmol-1·min-1.该酶催化水解合成底物时的活化能Ea比较低,为18.31 kJ·mol-1.其活性不受Ca2+的影响,但是Ca2+能提高该酶的热稳定性.Zn2+, Cu2+, Hg2+和 Al3+等的存在会使此酶活性降低.     

稀土镨对草鱼受精卵孵化的影响

研究稀土Pr^3 对草鱼受精卵孵化的影响。Pr^3 的适宜浓度范围为2．4－4.8mg/L。可提高孵化率18．5％－27．5％。镨的促进作用是通过受精卵对镨的吸收实现的。     

草鱼柠檬酸合酶基因SNP筛选及与生长性状的关联分析

根据草鱼(Ctenopharyngodon idella)EST-SNP库中预测的柠檬酸合酶基因的1个Contig序列,设计引物扩增该基因的部分序列,然后采用PCR产物直接测序法筛选SNP突变点。测序的序列经比对后,共筛选到2个在内含子10上的SNP突变点:A-386G和C-499G。随机选择同批繁殖和同塘混养的144尾草鱼对2个SNP位点用Snapshot方法进行检测和分型,并统计基因型频率。A-386G位点的AA基因型占47.10%,AG基因型占38.41%、GG基因型占14.49%;C-499G位点的CC基因型占31.85%,CG基因型占46.67%,GG基因型占21.48%,均属于中度多态位点。利用一般线性模型(GLM)分析2个SNP位点与草鱼6个生长性状(体质量、体长、体高、头长、尾柄长和尾柄高)的相关性,结果显示,A-386G和C-499G位点的不同基因型在这6个生长性状均值有差异,但均不存在显著差异。将这2个SNP不同基因型两两组合,一共组成7种双倍型(去掉频率小于3%的组合D2和D5),GLM相关分析表明5种双倍型在5个生长性状(体质量、体长、体高、尾柄长和尾柄高)上均存在差异,其中在头长上存在显著差异,D6双倍型(A-386G/AG和C-499G/GG)在6个生长性状上均值均最大,属于生长优势双倍型。本研究显示,筛选到的柠檬酸合酶基因上的2个SNP位点具有用于草鱼生长性状的分子辅助育种的潜力。     

复合酶制剂对草鱼生长性能、饲料养分消化率及免疫力的影响

选用体重为(31.51±0.43)g的草鱼C tenopharyngodon idella360尾,随机分为4个处理组,每组设3个重复,每个重复放30尾鱼,分别添加不同梯度水平(0、300、600、900 mg/kg)的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶为主的复合酶制剂。结果表明:与对照组相比,饲料中添加600、900 mg/kg的复合酶制剂后,显著提高了草鱼的相对增重率、特定生长率、饵料转化效率等生长性能指标(P<0.05),同时也显著提高了草鱼对饲料中干物质、粗蛋白质、粗脂肪及粗纤维的表观消化率(P<0.05),但这二组之间差异不显著(P(0.05),而300 mg/kg一组与对照组差异不显著(P(0.05);鱼体的粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、水分等品质指标在4个处理组之间差异不显著(P(0.05);饲料中添加600、900 mg/kg的复合酶制剂后,显著提高了草鱼血液中白细胞的吞噬活性(P<0.05)和血清杀菌能力(P<0.01)。研究表明,饲料中添加复合酶制剂后,能显著提高草鱼对饲料中养分的消化率,从而提高草鱼的生长性能,增强草鱼的免疫力。     

复合酶制剂对草鱼生长性能、饲料养分消化率及免疫力的影响

选用体重为（31.51±0.43）g的草鱼C tenopharyngodon idella360尾,随机分为4个处理组,每组设3个重复,每个重复放30尾鱼,分别添加不同梯度水平（0、300、600、900 mg/kg）的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶为主的复合酶制剂。结果表明：与对照组相比,饲料中添加600、900 mg/kg的复合酶制剂后,显著提高了草鱼的相对增重率、特定生长率、饵料转化效率等生长性能指标（P〈0.05）,同时也显著提高了草鱼对饲料中干物质、粗蛋白质、粗脂肪及粗纤维的表观消化率（P〈0.05）,但这二组之间差异不显著（P〈0.05）,而300 mg/kg一组与对照组差异不显著（P〈0.05）;鱼体的粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、水分等品质指标在4个处理组之间差异不显著（P〈0.05）;饲料中添加600、900 mg/kg的复合酶制剂后,显著提高了草鱼血液中白细胞的吞噬活性（P〈0.05）和血清杀菌能力（P〈0.01）。研究表明,饲料中添加复合酶制剂后,能显著提高草鱼对饲料中养分的消化率,从而提高草鱼的生长性能,增强草鱼的免疫力。     

杜仲对草鱼鱼种生长和血清非特异性免疫指标的影响

在基础饲料中分别添加2%、4%杜仲叶粉,0.1%、0.15%杜仲纯粉,饲喂规格为37±3 g的草鱼鱼种（Ctenopharyngodon idellus）,考察杜仲对其生长、非特异免疫功能的影响.经过60 d的饲养,结果表明：（1）对照组、2%杜仲叶粉组、4%杜仲叶粉组,0.1%杜仲纯粉组、0.15%杜仲纯粉组的鱼体增重率分别为315%、308%、322%、310%、342%,饲料系数分别为1.10、1.17、1.09、1.11、0.97,其中添加0.15%杜仲纯粉显著提高了草鱼增重率（P＜0.05）,降低了饲料系数（P＜0.05）;（2）对照组、2%杜仲叶粉组、4%杜仲叶粉组,0.1%杜仲纯粉组、0.15%杜仲纯粉组的血清SOD活性分别为63.03 μ/mL、88.13 μ/mL、112.2 μ/mL、97.59 μ/mL、112.0 μ/mL;溶菌酶活性分别为9.07 μg/mL、7.83 μg/mL、23.55 μg/mL、19.27 μg/mL、30.44 μg/mL.其中4%杜仲叶粉组、0.15%杜仲纯粉组显著提高了草鱼的SOD、溶菌酶活性（P＜0.05）.上述结果表明,杜仲具有促进草鱼鱼种生长和提高其非特异性免疫功能的作用.